Abstract
Superantigener (sags) er mikrobielle toksiner som kryssbinde T cellereseptorer med store histocompatibility klasse II (MHC-II) molekyler som fører til aktivering av et stort antall T-celler. Heri beskriver vi utviklingen og preklinisk testing av en ny svulst målrettet SAg (TTS) terapeutisk bygget ved hjelp av streptokokkpyrogene eksotoksin C (SPEC) synke og målretting kreftceller som uttrykker 5T4 tumorassosiert antigen (TAA). For å hindre potensielt skadelige utbredt immuncelleaktivering, en Spec mutasjon innenfor den høyaffinitets-MHC-II-bindende grensesnitt ble generert (Spek
D203A) som viste en markert reduksjon i mitogen aktivitet, men denne mutant fremdeles kunne indusere immuncelle-medierte kreft celledød
in vitro
. For å målrette 5T4
+ kreftceller, utviklet vi en humanisert enkelt kjede variabel fragment (scFv) antistoff å gjenkjenne 5T4 (scFv5T4). Spesifikk målretting av scFv5T4 ble bekreftet. Spec
D203A smeltet til scFv5T4 beholdt evnen til å aktivere og indusere immun cellemediert cytotoksisitet av kolorektal kreft celler. Ved hjelp av en xenograft modell av etablerte human tykktarmskreft, vi demonstrert at de Spec-baserte TTS var i stand til å kontrollere veksten og spredningen av store tumorer
in vivo
. Dette krevde både TAA målretting av scFv5T4 og funksjonell SAg aktivitet. Disse studiene legge grunnlaget for utvikling av streptokokk sags som «neste generasjon» TTSs for kreft immunterapi
Citation. Patterson KG, Dixon Pittaro JL, Bastedo PS, Hess DA, Haeryfar SMM, McCormick JK (2014 ) Kontroll av Etablert Colon Cancer xenografter Ved hjelp av en Novel humanisert enkelt kjede antistoff-streptokokker superantigen Fusion Protein Targeting den 5T4 onkoføtal Antigen. PLoS ONE 9 (4): e95200. doi: 10,1371 /journal.pone.0095200
Redaktør: Michael P. Bachmann, Carl-Gustav Carus tekniske universitet-Dresden, Tyskland
mottatt: 03.02.2014; Godkjent: 25 mars 2014; Publisert: 15 april 2014
Copyright: © 2014 Patterson et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) driftstilskudd til JKM (MOP-64176). SMMH har en Canada Research Chair i Viral Immunitet og Patogenese og JKM var mottakeren av en New Investigator Award fra CIHR. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Superantigener (sags) er mikrobielle toksiner som fungerer som potente T celleaktivatorer og er formidlere av toksisk sjokksyndrom [1]. Disse molekylene virker ved binding til sideflatene til store histocompatibility klasse II (MHC-II) molekyler [2] – [5], mens samtidig inngrep med kimlinje-kodede regioner i den variable region av T-cellereseptoren (TCR) β-kjede ( vp) [6] – [9]. Siden det er -50 funksjonelle vp gener hos mennesker [10], [11], og fordi ulike sags kan ofte målrette flere Vβs [12], disse giftstoffene stimulere til en svært stor andel av utsatte T-celler som fører til den påfølgende utgivelsen av pro- inflammatoriske cytokiner (for eksempel IL-2, IFN-γ, og TNF-α) [1]. Selv sags ikke engasjere MHC I molekyler, disse giftstoffene aktivere både CD4
+ og CD8
+ T-celler [13], og dette kan senere føre til tilskuer aktivering av hjelpeceller inkludert NK-celler [14]. I spesielle tilfeller kan SAg også aktivere ukonvensjonelle T-celle undergrupper som invariant natural killer T (
i
NKT) celler [15] og γδ T-celler [16].
Det endelige målet med kreft immunterapi er å utnytte immunmedierte mekanismer for å spesifikt retter og utrydde kreftceller. Det har vært en betydelig innsats for å utforme SAg-baserte immuntoksiner, også kjent som tumor-rettet superantigener (TTS), for å oppnå en kunstig «tvinger» T-celler til å gjenkjenne tumorassosierte antigener (TAA) i en ikke-HLA-begrenset måte. De første TTS representerte fusjon av et mus-antistoff-fragment (Fab) rettet mot et antigen kolorektal kreft, til villtype-stafylokokkisk enterotoksin A (SEA) SAg. I denne banebrytende arbeid, demonstrerte Fab :: SEA TTS en betydelig reduksjon i tumorbyrde og dødelighet ved hjelp av en B16 mus metastase modell [17]. Senere studier benyttet fusjon av en mus Fab å målrette 5T4 onkoføtal-antigen med en mutert versjon av SEA (designet for å redusere MHC-II-binding), og dette resulterte i ~95% reduksjon av tumormassen i en ikke-småcellet lungekreft ( NSCLC) modell [18]. Videre har kombinasjonsterapier med TTSs også vist lovende i prekliniske modeller i forbindelse med cytokin terapi (f.eks IFN-a) [19] og blokade av CTLA-4 [20]. Disse og andre studier har klart vist at potensialet i TTSs for cancer immunoterapi. Likevel, TTSs har hittil blitt bygget utelukkende ved hjelp av medlemmer av SE klasse Sag og SES er også agenter for stafylokokk matbåren sykdom, en aktivitet som er antatt å være uavhengig av evne til å aktivere T-celler [21]. Selv håndterlig, noen av bivirkningene sett i TTS fase I og fase II kliniske studier inkludert kvalme, oppkast og diaré [22] – [24], og kan ha blitt knyttet til kvalme egenskapene til SEA [25]. I tillegg mange pasienter hadde pre-eksisterende antistoffer SEA som krevde individuell TTS dosering [26]. For å redusere antigenisiteten av TTS-terapeutiske, ble anti-5T4 Fab bundet til en konstruert SEA /SEE-fusjons (kalt Naptumomab estafenatox, ABR-217620) [27]. Denne siste TTS terapeutisk har gjennomgått en fase I klinisk studie som monoterapi hos pasienter med avansert NSCLC, bukspyttkjertelkreft og nyrecellekreft (RCC), og som en kombinasjonsbehandling med Docetaxel hos pasienter med NSCLC, viser at ABR-217620 ble godt tolerert med noen bevis på anti-tumor aktivitet [24]. Tidlig informasjon fra et nylig avsluttet fase II /III studie med ABR-217620 hos pasienter med RCC sammenligne ABR-217620 og interferon-α, til interferon-α alene, ikke nådde det primære endepunktet av total overlevelse; men det ser ut til at mange pasienter hadde høyere enn forventet baseline nivåer av anti-SEA /SEE antistoffer, som kan ha bidratt til suboptimal behandling [28].
Bakterielle genomisk sekvens innsats over det siste tiåret har nå avslørt en omfattende «familien» av SAG exotoxins i begge
Staphylococcus aureus Hotell og
Streptococcus pyogenes
. Et generelt trekk ved disse giftstoffene er at genetisk forskjellige sags er også antigenically tydelig, og dessuten forskjellige sags også vanligvis vise unike vp aktiverings profiler [12]. Dermed
S. aureus Hotell og
S. pyogenes
har gitt en overflod av T-celle mitogener som potensielt kan være konstruert som TTSs for kreftbehandling. I dagens arbeid, forsøkte vi å utvide repertoaret av TTSs å inkludere den første streptokokk SAg hjelp streptokokkpyrogene eksotoksin C (spec) som prototypen. En potensiell fordel av engineering et streptokokk SAg som TTS er at disse giftstoffene mangler bona fide brekkmiddel aktivitet [29], noe som kan resultere i færre bivirkninger. Dessuten spec er meget godt studert i form av både struktur [4], [30], [31] og funksjon [9], [32] – [35] for inngrep av vert reseptorer, noe som gir en plattform for skreddersøm aktivitet. Heri, viser vi at spec mutagenisert i sink-avhengige, høy affinitet MHC-II-bindende domene (SPEC
D203A) har redusert superantigenicity samtidig beholde tumorici-dal egenskaper. Vi ga en spec
D203A-baserte TTS fusjonsprotein ved hjelp av en konstruert menneske scFv som er spesielt rettet mot menneskelig 5T4 (scFv5T4). I en humanisert musemodell for tykktarmskreft, viser vi at scFv5T4 :: spec
D203A TTS styrer vekst og metastatisk potensial av en etablert tykktarmskreft svulst, og at denne anti-tumor aktivitet krever både spesifikk målretting av scFv5T4 delen , samt SAg funksjon.
Materialer og Metoder
Etikk uttalelser
Eksperimenter ved hjelp primære humane lymfocytter ble gjennomgått og godkjent av Western University forskningsetiske Styret for helsefag forskning som omfatter mennesker. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle blodgivere. Alle dyreforsøk var i samsvar med den kanadiske Council on Animal Care Guide til omsorg og bruk av forsøksdyr, og protokollen ble godkjent av Animal Bruk Subcommittee ved Western University (London, Ontario).
Antistoffer og fargestoffer
følgende monoklonale antistoffer og fargestoffer som ble brukt: PE anti-human CD4 (klone RPA-T4, BD Pharmingen); AlexaFluor700 anti-human CD8 (klon RPA-T8; BD Pharmingen); APC anti-human CD3 (klon UCHT1; BD Pharmingen); CellTrace CFSE (carboxyfluorescein diacetate; molekylære prober); 7-AAD (7-Aminoactinomycin D; molekylære prober); anti-human 5T4 (ab88091, Abcam); IgG2b isotype (eBioscience); FITC-anti-mus IgG (eBioscience); strepativdin-IRDye800 (Rock immunochemicals); streptavidin-FITC (Rockland immunochemicals).
Bakteriestammer
Escherichia coli
XL1-Blue (Stratagene) eller DH5a (Invitrogen) ble brukt for kloning formål og
E. coli
BL21 (DE3) (Novagen) ble anvendt som protein ekspresjonsvert.
E. coli-
stammer ble dyrket aerobt ved 37 ° C i Luria-buljong (LB) inneholdende kanamycin (50 ug /ml), ampicillin (200 ug /ml) eller kloramfenikol (10 ug /ml) for å opprettholde plasmider.
kloning prosedyrer
plasmidkonstruksjoner enten ble tidligere utgitt [34], [35] eller generert av standard kloningsteknikk [36], i enten Dyre 41a (Novagen) eller Dyre 32a (Novagen), og er sammenfattet i tabell S1. Alle plasmid innskudd ble sekvensert ved Robarts Research Institute Sequencing Facility (London, Ontario, Canada). Protein uttrykk kloner i Dyre 32a eller Dyre 41a ble endret slik at enterokinase kuttesete (DDDDK ↓ X) ble erstattet med en Tobacco Etch Virus (TEV) proteasespaltningsstillingen (ENLYFQ ↓ S). Transfeksjon vektorer pCMV6-XL5, pCMV6-XL5 :: 5T4 og pEGFP-N1 ble kjøpt fra Origene Technologies, og Clonetech Laboratories, henholdsvis. Alle andre transfeksjon plasmider ble samlet ved standard kloningsteknikker. Den murine scFv5T4 cDNA [37] ble omkodet og deretter produsert av GenScript Inc. for å generere en humanisert sekvens. Aminosyresubstitusjoner utført i ryggraden sekvensen av scFv5T4 fra det originale muse scFv sekvens bestemmes ved å innrette med en human konsensus-sekvens. CDR sløyfer spesifikk for 5T4 [37], og de umiddelbare aminosyrer flankerer den anslåtte looper ble ikke endret for å opprettholde antistoff spesifisitet.
Protein uttrykk
rekombinante proteiner ble produsert ved hjelp av en
E. coli
BL21 (DE3) uttrykk system som inneholder pBirACm plasmid. Celler ble dyrket aerobt ved 37 ° C i LB-medium til OD
600 = 0,5 og protein-ekspresjon ble indusert over natten (18-24 timer) ved romtemperatur (RT) med 0,2 mM isopropyl-D-tiogalaktopyranosid (IPTG; BioBasic Inc .) og biotinylert under tilsetning av 50 uM D-biotin (BioBasic Inc.). Celler ble pelletert ved 4 ° C og resuspendert i kald 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl inneholdende 0,25 mg /ml lysozym (Sigma-Aldrich) og 0,02 mg /ml DNase I (Sigma-Aldrich). Celler ble inkubert på is i 1 time før lysis med en kontinuerlig hode strømningscelle disruptor (Constant Systems Ltd.) ved 25 psi, etterfulgt av sonikering med uttak 4, en puls /ml. Celleavfall ble pelletert ved 4 ° C ved 10000 x g. Supernatanter ble påført på en ladet Ni-NTA affinitetskolonne (Novagen) og økende konsentrasjon av imidazol ble benyttet for å eluere det rensede protein. Rensede fraksjoner ble dialysert 3 x mot 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl-buffer og de N-terminale lapper ble spaltet ved autoinactivation bestandig His
7 :: TEV [38], som beskrevet [39]. Spaltede proteiner ble påført og eluert fra en andre Ni-NTA-affinitetskolonne for å fjerne TEV protease og oppnå et rent protein. Proteiner ble dialysert 3 x mot 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl-buffer eller 0,9% NaCl (saltvann) og testet for homogenitet ved hjelp av SDS-PAGE og kvantifisert (BCA Protein Assay, Pierce).
cellelinjer
Menneskelige kolorektal adenokarsinom cellelinjer (HT-29 og WiDr) ble dyrket i et fullstendig Dulbeccos Modified Eagle Medium (cDMEM, Gibco) og HEK293 celler ble dyrket i fullstendig Minimum Essential Media (cMEM, Gibco). Alle dyrkningsmedier ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Sigma-Aldrich), 10 mM HEPES, pH 7,4 (Gibco), 2 mM L-glutamin (Gibco), 1 mM natriumpyruvat (Gibco), 100 uM ikke- essensielle aminosyrer (Gibco), 100 ug /ml streptomycin (Gibco) og 100 U /ml penicillin (Gibco).
scFv5T4 spesifisitet assays
HEK293-celler (1 x 10
5) ble utsådd i 24-brønners plater (Corning) med 500 ul cMEM og tillatt å vokse over natten (24 timer) ved 37 ° C med 5% CO
2. Liposome:DNA komplekser ble dannet ved hjelp Lipofectamine2000 (Invitrogen) og plasmid DNA av valg som per produksjon protokoll. Komplekser ble dannet i cMEM uten FBS eller antibiotika. Transfeksjon av celler fant sted i det samme mediet i 4 timer ved 37 ° C med 5% CO
2, hvoretter mediet ble fjernet og erstattet med cMEM for plasmid ekspresjon i løpet av 24 timer. Når uttrykt, scFv5T4 :: mRFP1 (1:100; 2 mg /ml) ble inkubert med cellene i 1 time ved RT og deretter vasket og på med fluorescensmikroskopi ved bruk av et Olympus IX71 fluorescerende mikroskop. Alternativt transfekterte HEK293-celler (som ovenfor) eller HT-29-celler (1,0 x 10
6) ble inkubert i 1 time med mAb5T4 (1:200) eller scFv5T4-biotin (1:100; 2 mg /ml), etterfulgt av anti-mus-IgG-FITC (1:1000) eller streptavidin-FITC (1:1000), henholdsvis i 1 time ved 4 ° C og på med fluorescensmikroskopi eller FACS (BD FACSCanto II), henholdsvis. Mikroskopi bilder ble tatt med ImagePro Plus Software, og FACS analyse ble gjennomført ved hjelp av FlowJo Software.
proliferasjonsanalyser
Menneske perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble fremstilt fra fullblod fra friske donorer og isolert av tetthet sentrifugering over Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare og biovitenskap). Humane lymfocytter ble dyrket i RPMI-1640 (Gibco) med 10% FBS og supplementert som ovenfor (cRPMI). Alle vevskultur-cellene ble holdt ved 37 ° C med 5% CO
2. Menneske PBMC ble merket med CellTrace CFSE (molekylære prober) i henhold til produsentens anvisninger. Celler (0,8 x 10
6 til 1,0 x 10
6) ble dyrket i cRPMI inneholdende 2 ug /ml Polymyxin B (ICN Biomedicals Inc.) og behandlet med enten villtype-spektrum (Spek
WT) eller varianter spec
Y15A, spec
D203A eller spec
Y15A /D203A (1 mikrogram /ml) og inkubert i 5 dager ved 37 ° C med 5% CO
2. Cellene ble deretter vasket og farget med anti-humant CD3 (1:200), anti-humant CD4 (1:200) og anti-human CD8 (1:200) antistoffer i 30 minutter på is og analysert ved FACS (BD Canto II ), ved hjelp av FlowJo programvare. For radioaktive spredning analyser, menneske PBMC (2,0 × 10
5) ble dyrket i cRPMI inneholder 2 mikrogram /ml Polymyxin B (ICN Biomedicals Inc.) med denne dosen titreres spec varianter, scFv5T4, scFv5T4 :: spec
D203A eller scFv5T4 :: spec
Y15A /D203A i U-bunn 96-brønners mikrotiterplater (BD Biosciences). Celler ble inkubert i 72 timer og deretter merket med
3H-tymidin (Perkin Eimer Inc.) i 18 timer ved 37 ° C med 5% CO
2. Cellene ble høstet på glassfiberfiltre og DNA-innlemmet
3H-tymidin ble målt i en beta scintillasjonsteller (Wallac 1450 Micro Counter).
cytotoksisitetsanalyser
To analyser ble brukt for å måle evnen av de forskjellige proteiner til å indusere PBMC-mediert dreping av kreftceller. Først
in vitro
drapet ble evaluert av co-dyrking humane PBMC med enten WiDr celler eller HT-29 i forholdet 10:01 og dosen titreres sags inkludert spec
WT, Spec
Y15A, spec
D203A, eller spec
Y15A /D203A i 48 timer. Celler ble merket med 7-AAD følge produsentens protokoll og analysert ved FACS (BD Canto II). Ved hjelp av FlowJo programvare, den WiDr eller HT-29 bestander ble gated på ved sammenligning av humane PBMC-prøver alene og deretter bedømt for nærvær eller fravær av 7-AAD. For det andre, humane PBMC ble behandlet med SAg, scFv5T4 eller fusjonsproteiner som i FACS-analysen i 48 timer i en U-bunn mikrotiterplate (BD Biosciences). Target HT-29 celler ble merket med (Na)
2
51CrO
4 (Perkin Elmer Inc.) i cRPMI. PBMC ble lagt på effector:target celleforhold på enten 01:01, 05:01 eller 10:01 mot HT-29. Cytotoksisitet ble målt etter 4-6 timers inkubering ved 37 ° C med 5% CO
2 i en standard kromfrigjøring analyse som måler
51 Cr-innhold i kultursupernatantene ved hjelp av en gamma-teller (Wallac 1470 Wizard Automatic Teller). Total frigivelse kontroll ble oppnådd ved å eksponere målceller til 1% natriumdodecylsulfat (EMD Millipore). Den spesifikke lysis ble beregnet i henhold til formelen:
Evaluering av tumorbelastning og metastaser
immunodeficient NOD.Cg-Prkdc
SCID Il2rgt
m1Wjl /SzJ (NSG) mus var oppdrettet i et dyr barriere anlegget, og holdt under sterile betingelser med mat og vann ad libitum. Basert på et tidligere utviklet protokoll [18], [40], 13-ukers gamle mus ble injisert intraperitonealt med 3 x 10
6 HT-29-celler i 0,2 ml bærer (PBS). Tre uker senere, etter at tumorene var håndgripelig ble musene injisert intraperitonealt med enten bærer alene (n = 3) eller 1 x 10
6 humane PBMC i 0,2 ml bærer (n = 20). PBMC-behandlede mus ble gruppert (n = 4) med et tilfeldig tall generator for å motta enten scFv5T4 :: spec
D203A, eller kontrollerer spec
D203A, scFv5T4, scFv5T4 :: spec
Y15A /D203A, eller bærer alene. To timer etter å ha mottatt PBMC, ble 2 uM /kg av behandling, kontroller, eller bærer alene injisert intravenøst. Mus uten PBMC fikk bilen alene. Intravenøs behandling injeksjoner ble gitt daglig i 7 ekstra dager. Etter 4 uker ble musene avlivet og den totale tumorvolumet ble bestemt. Musene ble også undersøkt visuelt for makrometastaser og scoret følgelig basert på graden av regional spredning fjernt fra den primære svulsten nettstedet. Alle tumorer ble skåret ut, størrelse-og vekt målt i blindt.
Statistisk analyse
statistiske sammenligninger ble utført ved hjelp av en uparet Student
t
test eller ved 2- veis ANOVA med Bonferroni multiple sammenligningstest (GraphPad Prism). Forskjeller ble betraktet som signifikant når p. 0,05
Resultater
Generering av en spec-baserte TTS
spec er en potent og godt karakterisert streptokokk SAg kjent for å målrette hovedsakelig Vβ2
+ humane T-celler [32] som representerer -7% av de ca 25 millioner forskjellige TCR [41]. Tidligere arbeid viser at Tyr
15 er et kritisk rest for denne SAg til inngrep med TCR [34], og Asp
203 er nødvendig for å koordinere et sink-mediert høy affinitet grensesnitt med β-kjeden av MHC-II [4], [35], [42] (figur 1A). Faktisk er det eneste Asp
203 → Ala mutasjon i spec har vist seg å dramatisk redusere toksisiteten i en dødelig modell av toksisk sjokksyndrom [42]. Vi først vurderes muligheten av villtype SPEC (SPEC
WT), Spec
Y15A, Spec
D203A, og spec
Y15A /D203A å aktivere menneskelige PBMC og indusere PBMC-mediert dreping av kreft celler. Både spec
Y15A og Spec
D203A ble nedsatt for evnen til å utvide PBMC ved ~ 100 ganger sammenlignet med Spec
WT, og spec
Y15A /D203A dobbel mutant var ute av stand til å indusere PBMC spredning (figur 1B). Deretter ble PBMC-avhengig dreping av den humane tykktarmskreft cellelinje WiDr evaluert. Spec
Y15A forårsaket en signifikant reduksjon i WiDr cytotoksisitet mot Spec
WT, og både spec
D203A og Spec
Y15A /D203A mutanter ikke klarte å overtale WiDr cytotoksisitet (figur 1C). Vi vurderte også evnen av de rekombinante proteiner for spesifikt å indusere proliferasjon av human CD3
+ CD4
+ og CD3
+ CD8
+ T-cellepopulasjoner ved 1 ug /ml. SPEC
WT, og hver av de enkle mutanter var i stand til å indusere proliferasjon i begge undergrupper, mens den doble mutanten ikke klarte å indusere proliferasjon av enten subsett (figur 1D og 1E). Disse data indikerer at TCR og MHC-II engasjement er viktige for induksjon av immunceller-mediert dreping av Spek
WT, og at spec
D203A kan være en passende mutant for å redusere eller forhindre systemiske immuncelleaktivering og samtidig opprettholde fullstendig engasjement med TCR.
A) Strukturell oversikt over spec i kompleks med TCR og MHC-II. TCR Vα kjeden er farget oransje, er TCR vp-kjeden farget grå, er MHCα-kjeder farget rød, er MHCβ-kjeder farget grønn, er antigene peptider farget svart, og sinkatom er farget magenta. Spec er farget blå med viktige grensesnitt rester Y15 og D203 markert i gult. Trefoldig modell av TCR-spek (MHC)
2 ble produsert som beskrevet tidligere [9] og båndet diagram er generert ved hjelp PyMOL (https://www.pymol.org). B) proliferasjon av humane PBMC-mediert av Spek
WT eller muterte proteiner som inneholder rester Y15A (TCR-bindende mutant), D203A (MHC-II-bindende mutant) eller Y15A /D203A ble bestemt ved opptaket av
3H- tymidin etter 72 timer etter stimulering (n = 5 i tre eksemplarer, data som representerer en individuell). C) Doseavhengig cytotoksisitet av 7-AAD
+ WiDr celler etter 48 timers inkubering med humane PBMC og enten spec
WT, Spec
Y15A, Spec
D203A, eller Spec
Y15A /D203A (n = 3-6 per gruppe). (D-E) spredning av CFSE merket menneskelige PBMC mediert av spec
WT eller proteiner som inneholder muterte rester ble bestemt ved FACS fem dager etter stimulering, spesielt måler total CD3
+ T-cellepopulasjon, CD3
+ CD4
+ T-celler og, CD3
+ CD8
+ T-celler (n = 4; FACS data som representerer en individuell).
Utviklet menneskelig scFv5T4 rettet spesifikt 5T4 tumorassosiert antigen
for å utvikle en spesifikk målgruppe mekanisme for spec
D203A, genererte vi en humanisert scFv basert på komplementaritet regioner (CDR) av preget musen scFv spesifikk for den menneskelige 5T4 TAA [37]. CDNA-sekvensen ble utformet for å inkorporere en «humanisert» backbone-sekvens, sammen med CDR gjenværende spesifikt for humant 5T4. Aminosyresubstitusjoner ble bestemt ved å justere tidligere beskrevet musen scFv5T4 med 10 humane scFv sekvenser generere en konsensussekvens. Dette cDNA sekvensen ble kodon optimalisert for
E. coli Hotell og syntetisert, og ble senere brukt for å generere en rekke av rekombinante proteiner (tabell S1).
Hvis du først undersøke spesifisiteten av humanisert scFv5T4 for binding til menneskelig 5T4, den scFv5T4 cDNA var konstruert for å inneholde en C-terminal biotin signal, eller genetisk sammensmeltet til monomert rød fluorescerende protein 1 (mRFP1) [43]. Etter inkubering med humane HT-29 kolorektal kreft celler som er kjent for å uttrykke 5T4 [44], som WiDr-cellene er avledet [45], scFv5T4 bundet til overflaten av disse cellene sammenlign til kommersielle anti-humant 5T4 mAb (figur 2A). HEK293-celler konstruert for å uttrykke 5T4 antigen bundet både mAb5T4 samt scFv5T4-fragmentet som vist ved immunofluorescens-mikroskopi, mens kontrollere HEK293 celler som inneholder bare vektoren ikke flekken med enten antistoff (figur 2B). scFv5T4 spesifisitet for 5T4 ble også bestemt ved inkubering av scFv5T4 :: mRFP1 med HEK293 celler transfektert med pEGFP-N1 :: 5T4, eller kontroll vektor pEGFP-N1. Mikroskopisk analyse av GFP :: 5T4-uttrykkende HEK293-celler viste at scFv5T4 bindes til disse celler som uttrykker GFP 5T4 :: fusjon, men ikke til å få tak transfekterte celler (figur 2C). Sammen utgjør disse dataene indikerer at humanisert scFv5T4 kan binde spesifikt til menneske 5T4.
A) Histograms demonstrerer overflatebinding av de angitte antistoffer, enten kommersielt mAb5T4 eller genereres scFv5T4 (tomme kurver), til 5T4 TAA på tykktarmskreft cellelinje HT-29 målt ved FACS. De skraverte Kurvene viser IgG2b isotype kontroll (øverste panel) eller streptavidin-FITC alene (nederst panel). B) Visualisering av kommersielle mAb5T4, eller scFv5T4, målretting av HEK293 celler transfektert med tom vektor (pCMV6-XL5) eller pCMV6-XL5 :: 5T4 ved fluorescens mikroskopi. Representative bilder tatt på 400 × forstørrelse. C) Visualisering av HEK293 transfektert med pEGFP-N1 eller pEGFP-N1 :: 5T4 og inkubert med scFv5T4 :: mRFP1. Samme synsfelt bildene ble tatt under fasekontrast, og grønne og røde fluorescerende filtre på 100 × forstørrelse.
Generering av scFv5T4 :: Spec
D203A
For å målet spec til 5T4, spec ble translatorisk smeltet til scFv5T4 og rekombinant scFv5T4 :: spec
D203A ble uttrykt fra
E. coli
BL21 (DE3) og renset (figur 3). I tillegg ble kontroll reagenser generert inkludert scFv5T4 alene, og en ikke-fungerende fusjonsprotein som inneholder spec
Y15A /D203A, hver som løselige proteiner som inneholder C-terminal biotin tags (figur 3).
A) skjematisk illustrasjon som representerer komponenter av de genererte fusjonsprotein konstruksjoner. Proteinet består av de genererte 5T4 målrettede humanisert enkelt kjede variable fragmenter, V
H og V
L (grå linje), genetisk fusjonert til streptokokk superantigen spec (blå strek) enten inneholder en alanin substitusjon ved resten D203 eller en ekstra alanin substitusjon ved resten Y15. Alle konstruksjoner ble samlet til å inneholde en C-terminal biotin tag. De rensede rekombinante proteiner er vist ved SDS-PAGE (panel B), og detektert ved Western blot-analyse av streptavidin-IRDye800 (panel C)
human T-celle proliferasjon og cytotoksisitet indusert av scFv5T4.: : spec
D203A
Vi testet først scFv5T4 :: spec
D203A og kontroll proteiner for evnen til å spre induserte humane PBMC. scFv5T4 :: spec
D203A induserte en doseavhengig proliferative respons av humane lymfocytter som var sammenlignbare med spec
D203A (Figur 4A). Viktigere, gjorde scFv5T4 antistoffragment alene og den doble mutant fusjon (scFv5T4 :: spec
Y15A /D203A) ikke fremkalle vesentlige proliferative responser. Dette indikerer at spesifikasjonen
D203A-delen av fusjonen er ansvarlig for indusering av PBMC aktivering. Den Immunterapeutisk middel ble så evaluert med hensyn på evne til å mediere tumorcelle-dreping ved humane Spec-reaktive PBMC i to analyser. Først ble human colorectal cancer cellelinje WiDr brukt som mål i en 7-AAD-baserte dreping analysen. Effektive celle-dreping ble observert etter humane PBMC ble stimulert med 200 nM av midlet i 48 timer, sammenlignet med villtype-spec og ustimulerte kontroller (figur 4B). For det andre, HT-29 celler merket med
51Cr ble anvendt som mål. Effektive celle-dreping ble observert på en doseavhengig måte etter humane PBMC ble stimulert med agent i 48 timer, og deretter tilsatt til tumorceller med økende effektor og mål (E:T) forhold (figur 4C). Videre er det enkelt mutant-fusjons (scFv5T4 :: Spek
D203A) var mer effektiv enn den tilsvarende dobbelt-mutant-fusjons (scFv5T4 :: Spek
Y15A /D203A) eller antistoff alene, men ble redusert sammenlignet med Spec
WT. Disse dataene indikerer at scFv5T4 :: spec
D203A er funksjonell for å indusere immun celle-mediert kreft celledød, og at spec
D203A, scFv5T4, og scFv5T4 :: spec
Y15A /D203A proteiner kan fungere som presise kontroller å vurdere behovet for å målrette og Sag aktivitet
in vivo
.
A) spec proteiner ble brukt til å sammenligne scFv5T4 alene, scFv5T4 :: spec
Y15A /D203A og senere scFv5T4 :: sPEC
D203A i opptaket av
3H-tymidin som et mål for PBMC-proliferasjon etter 4 dagers inkubasjon (n = 5). B-C) Doseavhengig Spec-mediert PBMC cytotoksisitet av scFv5T4 :: Spec
D203A ble bestemt ved å sammenligne spec kontroller, scFv5T4 alene og scFv5T4 :: spec
Y15A /D203A etter 48 timers inkubering ved hjelp FACS analyse av WiDr (panel B), å måle prosent cancercelledød med 7AAD-utelukkelse farging (n = 3) og
51Cr-frigivelse for å måle den spesifikke cytotoksiske potensial (felt C) når det ble inkubert med økende effector:target forholdstall og
51Cr-merkede HT-29 kreftceller. Viste data (gjennomsnitt ± SEM) er fra fire uavhengige menneskerettighets givere hvert gjort i tre eksemplarer. * P 0,05, *** p 0,001, sammenlignet med inaktive spec
Y15A /D203A kontroll protein
Immunterapi av etablerte tykktarmskreft ved hjelp scFv5T4 :: spec
D203A
spec er spesifikt for humant Vβ2
+ T-celler, men i Sag gjenkjenner ikke mus T-celler [32]. Dermed teste Spec-baserte TTS kreves en modell utnytte humane lymfocytter. Videre har det menneskelige 5T4 målretting scFv har minimal kryssreaktivitet med muse-5T4 [37]. Derfor var nødvendige for eksperimentene humane tumorceller som uttrykker human 5T4. Basert på en tidligere utviklet modell [18], [40], ansatt vi immunodeficient NOD SCID IL2Rγ
– /- (NSG) mus for engraftment av 5T4
+ menneske HT-29 kolorektal adenokarcinomceller. NSG mus mangler T, B og NK-celler [46] og representere en optimal musestamme for human tumor-innpoding [47]. Videre har disse musene tillater overlevelse av overførte humane immunceller [46], [48]. HT-29 celler ble injisert intraperitonealt i NSG mus og en gang solide tumorer ble håndgripelig (3 uker etter injeksjon), behandlinger ble innledet med intraperitoneal injeksjon av menneskelige PBMC, fulgt av 8 daglige intravenøse injeksjoner av scFv5T4 :: Spec
D203A (figur 5A). Kontroll NSG mus fikk ikke PBMC, eller mottatt PBMC uten ytterligere behandling. Andre grupper inkluderte scFv5T4 alene, spec
D203A alene, eller inaktiv scFv5T4 :: spec
Y15A /D203A. Tumor flateareal ble overvåket ved hjelp av skyvelære måling gjennom hele eksperimentet og viste liten eller ingen vekst av svulster i scFv5T4 :: spec
D203A behandlingsgruppen, mens veksten ble observert i alle andre grupper (figur 5B). Musene ble avlivet ved uke 8 av eksperimentet og tumorer ble evaluert blindt. Dette eksperimentet viste en dramatisk reduksjon i det totale tumorvolum etter behandling med scFv5T4 :: Spec
D203A som var signifikant forskjellig fra mus som ikke mottok PBMC, narrebehandlede mus (saltvann), og musene behandlet Spek
D203A eller scFv5T4 :: spec
Y15A /D203A (figur 5C). Viktigere, den scFv5T4 :: spec
D203A behandlingsgruppe demonstrerte også en betydelig reduksjon i de totale metastaser skår sammenlignet med alle andre grupper (figur 5D og 5E).
