Abstract
Bakgrunn
En-type lamins er type V mellomgløde proteiner kodet av genet
LMNA
. Mutasjoner i
LMNA
gi opphav til ulike degenerative sykdommer relatert til for tidlig aldring. A-type lamins også påvirke aktiviteten av retinoblastom protein (pRb) og onkogener slik β-catenin. Derfor har det vært spekulert i at uttrykket av A-type lamins kan også påvirke tumorprogresjon.
metodikk /hovedfunnene
Et arkiv av tykktarmskreft (CRC) og normal tykktarm vev ble undersøkt for ekspresjon av A-type lamins. Vi brukte Cox proporsjonal hasardratio (HR) metode for å undersøke pasientens overlevelse. Ved hjelp av CRC-cellelinjer vi undersøkt effekten av lamin A ekspresjon av andre gener ved RT-PCR; på cellevekst ved FACS-analyse; og på invasivitet av celle migrasjon analyser og siRNA knockdown av målrettede gener. Vi fant ut at Lamin A uttrykkes i colonic stamceller og at pasienter med A-type Lamin-uttrykke svulster har betydelig dårligere prognose enn pasienter med A-type Lamin negative tumorer (HR = 1,85,
p
= 0,005) . For å forstå dette funnet, etablerte vi et modellsystem basert på uttrykket av GFP-Lamin A i CRC celler. Vi fant at uttrykket av GFP-Lamin A i disse cellene ikke påvirke celledeling men fremme betydelig økt cellemotilitet og invasivitet. Grunnen til dette økte invasivitet var at ekspresjon av lamin A fremmet oppregulering av aktin bunting proteinet T-Plastin, noe som fører til nedregulering av den celleadhesjonsmolekyl E-cadherin.
Konklusjoner
uttrykk for A-type lamins øker risikoen for å dø av CRC fordi dens nærvær gir opphav til økt invasivitet og potensielt et mer stamcelleliknende fenotype. Denne rapporten knytter direkte A-type lamin uttrykk til tumorprogresjon og hever profilen til
LMNA
fra ett innblandet i flere, men sjeldne genetiske forhold til et gen som er involvert i en av de vanligste sykdommene i den vestlige verden.
Citation: Willis ND, Cox TR, Rahman-Casañs SF, Smits K, Przyborski SA, van den Brandt P, et al. (2008) Lamin A /C er en risiko Biomarker i tykktarmskreft. PLoS ONE 3 (8): e2988. doi: 10,1371 /journal.pone.0002988
Redaktør: Kevin G. Hardwick, University of Edinburgh, Storbritannia
mottatt: 6 mai 2008; Godkjent: 17 juli 2008; Publisert: 20 august 2008
Copyright: © 2008 Willis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. National Health tjenesten Forskning og utviklingsmidler, Association for International Cancer Research, EU rammeprogram 6
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lamins A og C er type V mellomliggende filamentproteiner som danner en del av et trådformet nettverk kalt kjerne lamina foring av den indre kjernemembranen (INM) [1]. A-type lamins alternativt skjøtes produkter av
LMNA
genet, som er kartlagt til kromosom 1q21.3 [2]. Mutasjoner i dette gen er den underliggende årsak til tolv forskjellige genetiske sykdommer som er kollektivt betegnet laminopathies [3]. Laminopathies er alle degenerative sykdommer som hovedsakelig påvirker vev av mesenchymale opprinnelse [3]. Mulige mekanismene bak laminopathies har vært intensivt undersøkt i løpet av de siste syv årene, og dette har ført til den konklusjon at A-type lamins bidra til celle overlevelse på to forskjellige måter. For det første, A-type lamins samvirke med viktige cytoskeletal linker proteiner betegnes nesprins, via SUN domeneproteiner, som forbinder INM til den ytre kjernemembranen (onm) via lumen [4], [5]. De nesprins i sin tur anker elementer av cytoskjelettet til onm [6] – [9], for derved å hardwiring cytoskjelettet på atom lamina og å tilveiebringe en anordning for transdusering av mekanisk spenning avføling fra plasmamembranen til kjernen [10], [11 ]. For det andre, A-type lamins samvirke med et antall av bindingspartnere i kjernen, som i sin tur interagerer med og påvirke aktiviteten av viktige vekstregulatorer. Av proteinene som A-type lamins reagerer med, den best karakteriserte er de såkalte LEM domeneproteiner [12], herunder de integrerende membranproteiner emerin [13], [14] og MAN1 [15], så vel som nucleoskeleton protein LAP2α [16]. Et kompleks av A-type lamins og emerin er nylig blitt rapportert for å regulere atom akkumulering av aktiv β-catenin og tap av funksjon emerin fører til uregulert β-catenin signalering og auto-stimulerende vekst i fibroblaster [17]. Tilsvarende har et kompleks av MAN1 og A-type lamins blitt vist å interagere med reseptoren regulert SMAD (rSMAD) og til å antagonisere TGF-β signalering ved å hemme rSMAD ved INM [18], [19]. Til slutt, et kompleks av LAP2α og A-type lamins binder seg til og fortøyningene ufosforylerte former av vekst suppressor pRb i kjernen [20]. LAP2α og A-type lamins både delta i Rb avhengig E2F undertrykkelse [21] og tap av LAP2α eller A-type lamins i fibroblaster resulterer i akselerert S-fase inngang, gjennom tap av pRb aktivitet [21], [22].
Gitt betydningen av A-type lamins og deres bindingspartnere til regulering av vekst veier, har det vært spekulert i at disse lamins kan være knyttet til tumorprogresjon [23]. Tidligere studier har rapportert differensial ekspresjon av A-type lamins i tumorvev og har knyttet fravær av A-type lamins til økt proliferasjon i tumoren. Men de har ikke klart å knytte endringer i uttrykket til pasientens prognose eller direkte til tumorprogresjon [24]. Vi bestemte oss derfor for å undersøke hvordan uttrykk for A-type lamins kan påvirke både progresjon og resultater av en vanlig svulst. For å gjøre dette screenet vi et veldig stort arkiv av CRC vev knyttet til en omfattende pasientdatabase [25]. Uventet, fant vi at uttrykket av A-type lamins innenfor en svulst var en svært betydelig risikoindikator for tumorrelatert dødelighet. I nedstrøms undersøkelser, har vi funnet at ekspresjonen av lamin A i CRC-cellelinjer promo invasivitet via opp-regulert ekspresjon av aktin-kobling av protein T-Plastin, som i sin tur gir opphav til ned-regulert ekspresjon av det celleadhesjonsmolekyl E-cadherin . Vi konkluderer med at uttrykk for A-type lamins i CRC fremmer svulst invasivitet gjennom omorganisering av aktin cytoskjelettet.
Resultater
Lamin A er en voksen stamcelle biomarkør i colonic krypter
Før undersøke hvorvidt A-type lamins innflytelse tumorprogresjon, vurderte vi fordelingen av A-type lamins i normal tarmslimhinne ved farging vevssnitt med et monoklonalt antistoff som er spesifikt for disse proteinene. Som forventet [26], A-type lamins ble sterkt uttrykt i funksjonelt differensierte epitele sjikt og ble også sterkt uttrykt i omgivende stromale vev og den underliggende muskel. Omvendt, A-type lamin ekspresjon var meget svak eller fraværende i de fleste celler i kryptene i kolon. Imidlertid, A-type lamin ekspresjon var høy i omtrent fem til ti celler på bunnen av kryptene (figur 1A, piler). De positivt fargede celler i kryptene var svært like i antall og inntatt en stilling som tilsvarer det generelt forstått å være colonic epithelial stamcelle nisje [27], [28]. For ytterligere å undersøke identiteten av disse A-type Lamin positive celler, ble seriesnitt farget med antistoffer mot lamins A 50 mikrometer (høyre panel). (B) seriesnitt av normal tarmfunksjon ble farget med antistoffer til enten lamins A /C (JoL2) eller PCNA (PC10) og behandlet som beskrevet ovenfor. Piler indikerer langsomt delende celler på bunnen av kryptene, som flekken positivt med JoL2 men negativt med PC10. Skala barer = 150 nm.
Uttrykk av A-type lamins er en fare indikator i CRC
Nederland Cohort Study på kosthold og kreft [29] er en prospektiv kohortstudie. I første omgang ble vevsprøver fra 819 pasienter søkt fra 54 patologilaboratorier hele Nederland. Incident tilfeller inkluderte de pasienter som utvikler tykktarmskreft mellom 1989 og 1993. Tumor materialet var ikke tilgjengelig for 5% av tilfellene, og av de resterende 775 tilgjengelige vevsprøver, 737 inneholdt tilstrekkelig tumormateriale for immunhistokjemisk analyse. Ved hjelp av standard parametere for å teste på 5% signifikansnivå, og med en 90% strøm, ville det minimum bestandsstørrelse som kreves for å trygt oppdage små hazard ratio være 516, slik at det var trygt å anta at størrelsen på utvalget var stort nok til å produsere statistisk signifikans .
Immunhistokjemisk farging for å påvise uttrykk for lamins A /C følgende antigen gjenfinning ble utført på alle tilgjengelige prøver. I alle deler den stromal vevet rundt kreften var alltid sterkt positiv for lamins A /C som gir en intern positiv kontroll. Ved hjelp av farging av stromal vev som et kriterium for vellykket antigen henting, 673 (91%) av prøvene var tilgjengelige for scoring. Vi har funnet at mens det var noe variasjon i intensiteten av det totale fargings, kjerne lamin A /C uttrykk innen tumoren kan være lett klassifiseres som enten til stede (figur 2E-H) eller fraværende (figur 2A-D) fra kjernen. Det ble også bemerket at i et lite antall tilfeller, det var sporadisk cytoplasma farging og disse prøvene ble scoret som negativ når nukleær farging var fraværende. Etter blind scoring av lysbilder, henting av pasient og overlevelse informasjon fra databasen ledet det endelige antall unike tilfeller å bli redusert til 658 på grunn av duplisering av pasientadministrative koder, og ytterligere 2 saker ble ekskludert etter å ha blitt klassifisert som signet ring svulster.
4 mikrometer formalinfiksert, parafininnstøpte seksjoner fra 656 uavhengige menneskerettighets kolorektal adenokarsinomer ble tatt fra pasienter som deltar i Nederland Cohort Study på kosthold og kreft. Vevssnitt ble utsatt for immunhistokjemi hjelp av JoL2 monoklonalt anti-human Lamin A /C antistoff før kromogen visualisering og lys kontra med Mayers Haemalum å skille kjerner. A-D viser en positiv farging stromal (S) vev som omgir en negativ farging av tumor (T) vev. (A) Moderat godt differensiert stadium I adenokarsinom; (B) Moderat godt differensiert stadium II adenokarsinom; (C) Moderat godt differensiert stadium III adenokarsinom; (D) Moderat godt differensiert stadium IV adenokarsinom. E-H viser en positiv farging stromal (S) vev som omgir positiv farging tumor (T) vev. (E) Moderat godt differensiert stadium I adenokarsinom; (F) Moderat godt differensiert stadium II adenokarsinom; (G) Moderat godt differensiert stadium III adenokarsinom; (H) Moderat godt differensiert stadium IV adenokarsinom. Skala barer = 30 mikrometer.
I løpet av oppfølgingsperioden, 246 pasienter døde, med 163 av disse pasientene som dør som følge av CRC. Av de 656 tilgjengelige eksemplarer immunohistochemically vurdert, ble kjernefysisk Lamin A /C uttrykk funnet å være positiv i 463 (70%) pasienter og negative i 193 (30%) pasienter. Innenfor prøven gruppen av pasienter som døde av CRC relaterte årsaker i løpet av studieperioden (ti år), 127 scoret positive for lamins A /C, mens 36 scoret negativ. Bruke Cox Proporsjonal Hazard beregninger [30], fant vi at pasienter uttrykker lamins A /C i svulsten var nesten dobbelt så stor sjanse for å dø (Hazard ratio [HR] 1,85; 95% konfidensintervall [CI] 1,16 til 2,97) av CRC relatert årsaker i forhold til clinicopathogically identiske pasienter som var negative for lamins A /C (
p
= 0,005) (figur 3). Dermed uttrykk for Lamin A /C i en svulst var sterkt korrelert med CRC relaterte dødsfall.
Totalt kumulativ fareanalyse for tilstedeværelse av Lamin A /C uttrykk og tykktarmskreft relatert dødelighet for stadium I-III pasienter i Nederland Cohort Study på kosthold og kreft. Relativ hazard ratio (HR) = 1,85 (95% CI = 1,16 til 2,97),
p
= 0,005 (Justert for kjønn og alder ved diagnose).
Uttrykk for Lamin A i CRC cellelinjer fremmer økt invasivitet
Oppdagelsen av at uttrykk for Lamin A /C i pasient svulster er nært korrelert med CRC relatert dødelighet var uventet og til en viss grad teller intuitivt. Derfor, for å forstå hvorfor ekspresjon av lamins A /C øker risikoen for død i CRC, erholdt vi et antall av CRC-cellelinjer og i utgangspunktet vurderes dem for lamin A /C-status ved immunblotting. I en pre-metastatisk cellelinje, SW480, Lamin A var nesten umulig å oppdage (figur S2A, B) mens nivåer av uttrykk for lamins B
1, B
2 og C var lik andre CRC cellelinjer (f.eks HT29 ). SW480 ble derfor valgt for undersøkelse. For å finne ut hvordan uttrykk for Lamin A kan påvirke SW480, ble kulturene stabilt transfektert med enten GFP eller en GFP-Lamin A konstruere. Etter stabil transfeksjon med GFP-lamin A moderate mengder av både endogene lamin A, så vel som fusjonsproteinet ble påvist, mens GFP transfekterte kulturer, forble lamin A fraværende (figur S2C, D). Morfologien til cellene i GFP og GFP-Lamin A-transfekterte kulturer var også forskjellig. Morfologien til cellene i GFP transfekterte kulturer (SW480 /CNTL) var umulig å skille fra ikke-transfekterte kulturer (SW480), med mange celler som var sterkt flate eller som vokser på toppen av hverandre. I motsetning til dette, i GFP-lamin A-transfekterte kulturer (SW480 /lama), celler som hadde en mer spindel lignende utseende og vokste som et monolag ved lav celletetthet (figur 4A).
(A) Morfologi av utransfekterte SW480, SW480 /cntl og SW480 /Lama ble sammenlignet med fasekontrastmikroskop. SW480 /CNTL og utransfekterte celler viste en flat morfologi og flerlags vekst. I motsetning til dette, ektopisk ekspresjon av GFP-lamin A (SW480 /lama) viste seg å indusere morfologiske endringer, inkludert utseendet av en spindellignende form og vekst som et monolag. Scale bar = 10 mikrometer. (B) Skrape sår ble gjort i 100% konfluente kulturer av SW480 /cntl eller SW480 /Lama celler. Fase kontrast bildene ble tatt annenhver time i løpet av en 12 timers periode fra identiske regioner. Scale bar = 200 mikrometer. (C) Et sår størrelse i forhold til start sår størrelsen ble målt etter 12 timer i tre uavhengige eksperimenter og uttrykt som en prosentvis reduksjon i sårstørrelsen +/- standardavvik (S.D.). Cellemigrasjon ble ~seven ganger raskere i SW480 /Lama i forhold til SW480 /CNTL kulturer, p 0,005. (D) cellesyklusegenskaper ble undersøkt ved hjelp av strømningscytometri. Andelen av celler i hver fase av cellesyklusen er gitt som middelverdi ± s.d. av tre gjentak. Ingen vesentlige forskjeller i cellesyklus dynamikken mellom de to cellelinjer ble oppdaget.
trekkende /metastatisk oppførsel i kreftceller er vanligvis forbundet med fenotypiske endringer [31]. For å undersøke om endrede celle morfologi korrelert med endret vandringsmønstrene vi utført cellemotilitet analyser på kulturer. Etter bunnen såret, sårheling var syv ganger raskere i kulturer transfektert med GFP-lamin A sammenlignet med kulturer transfektert med GFP (figur 4B 0,005). (B) SW480 /Lama kulturer ble behandlet med egge siRNA eller siRNA spesifikk for T-Plastin. 108H etter behandling RNA ble ekstrahert og amplifisert ved RT-PCR ved anvendelse av primere som er spesifikke for T-Plastin og E-cadherin. Ett hundre prosent knockdown av T-Plastin ble ledsaget av nytt uttrykk for E-cadherin transkripsjoner. (C, D) Alternativt kan bunnen av såret ble utført på løpende kulturer 108H etter siRNA behandling og sårheling ble målt som beskrevet i figur 4B, C. Cellemigrering ble 2 ganger raskere i kulturer behandlet med egge siRNA sammenlignet med kulturer som ble behandlet med Sit-Plastin (
p
0,05). Scale bar = 200 mikrometer.
Diskusjoner
I denne artikkelen rapporterer vi to nye og uventede funn. For det første, Lamin A, men ikke lamin C er en potensiell biomarkør for stamcelleforskningen nisje i kolon krypten og for det andre er uttrykk for Lamin A /C i CRC vev sterkt korrelert med CRC relatert dødelighet og derfor Lamin A /C representerer en ny og viktig prognostisk biomarkør i CRC.
plasseringen av stamcelle nisje i tykktarm har blitt ekstrapolert fra celle kinetisk og radiomerking studier. Ved radiomerking S-fase krypten celler med tritiert tymidin, har den gjennomsnittlige migreringshastighet av celler i forhold til deres celleposisjons blitt målt. Ved bruk av denne tilnærmingen, opprinnelsen til migrasjon og, ved ekstrapolering, har stamcelle nisje er beregnet å ligge på undersiden av krypten [35]. Antall stamceller som innehar denne nisjen er tilnærmet lik mellom fem til ti celler [36]. Mer nylig, ekspresjon av Wnt responselementet Lgr5 har vist seg å definere colonic stamceller og har blitt brukt for å bekrefte at stamcellene oppta en nisje i bunnen av kryptene [27]. Celler av et tilsvarende antall og opptar nettopp at nisje er lett farget med antistoffer detektere lamins A /C eller Lamin A, men er ikke farget med antistoffer spesifikt oppdage lamin C. I motsetning til i celler opptar transitt forsterke sonen, uttrykk for både Lamin A og Lamin C er fraværende. Som forventet [26], [37], [38], begge lamins blir lett påvist i funksjonell differensiert epitel i kolon mukosa. I overensstemmelse med ideen om at lamin A er en potensiell biomarkør av colonic stamceller, cellene ved bunnen av krypten som er positive for lamin A, er generelt negativt for DNA-replikasjon protein PCNA, som ville være forventet i celler som er for det meste hvile~~POS=TRUNC [39]. Det Lamin A er en potensiell biomarkør for voksne stamceller har viktige generelle implikasjoner for sykdom. Lamins A /C er mutert i et vidt spekter av degenerative sykdommer som er knyttet til for tidlig aldring [3], og det har blitt foreslått at en årsak til degenerasjon i disse sykdommene er tap av voksen stamcelle funksjon [40]. Det Lamin En uttrykk noteres i voksen stamcelle nisje i tykktarm, gir direkte støtte til denne hypotesen. Den finner at Lamin A kan være en antatt stamcelle biomarkør har ytterligere konsekvenser for vår oppdagelse som uttrykk for Lamin A /C i CRC er nært korrelert med økt risiko for CRC relatert dødelighet, siden det kan anses som mulig at kreftceller som uttrykker Lamin A kan ha en mer stamcelleliknende fenotype og derfor være naturlig mer farlig [41].
Vårt finne at uttrykket av A-type lamins i CRC vev er korrelert med en to gangers økning i CRC relatert dødelighet , sammenlignet med fravær av A-type lamins, for første gang direkte forbinder disse proteiner til progresjon av en vanlig sykdom. Tidligere studier har beskrevet endret ekspresjon av A-type lamins i en rekke kreftformer, inkludert kreft i hud, lunge, lymfekar og mykt vev [24], [37], [42] – [44]. Imidlertid har ingen av disse studiene var i stand til å koble enten fravær eller nærvær av A-type lamins til tumorprogresjon, selv om minst én studie [24] har foreslått at tap av ekspresjon av lamins A /C ble korrelert med forbedret sprednings priser i tumorer. Det andre problemet med disse tidligere studiene er at et begrenset antall prøver var tilgjengelig for analyse, og følgelig studere størrelser falt under terskelen for pålitelig statistisk analyse. I kontrast, er vår nåværende funn basert på en tilstrekkelig stor nok kohort å tilby full tillit til betydningen rapporterte nivåer.
Våre funn er til en viss grad teller intuitivt, ved at uttrykket av A-type lamins i ulike celler generelt bremser celleproliferasjon [21] mens fraværet av A-type lamins kan være korrelert med en unnlatelse av å gjennomgå vekst arrestasjon ved samløpet [22]. Derfor er nullhypotesen anvendt ved begynnelsen av studien var at fravær av A-type lamins ville være korrelert med økt risiko for kreft-relaterte dødsfall. Ved hjelp av modell CRC cellelinjer kunne ikke påvise merkbare endringer i frekvensen av celleproliferasjon i celler som uttrykker lamin A sammenlignet med celler av en identisk genetisk bakgrunn som manglet ekspresjon av lamin. Vi har imidlertid oppdage betydelig økt invasive egenskaper når vi sammenlignet Lamin A uttrykker celler til celler som uttrykk for Lamin A er fraværende. Den invasive egenskaper av disse cellene oppstår på grunn av tilstedeværelsen av lamin A fører til en nedstrøms oppregulering av T-Plastin, som i sin tur fører til nedregulering av E-cadherin. Plastins er et nylig beskrevet familie av actin-kobling av proteiner som har vært implisert i invasjon /metastase [34]. I den samme cellelinjen som anvendt i denne studien, er ekspresjon av L-Plastin blitt rapportert å føre til ned-regulert ekspresjon av E-cadherin og økt invasivitet og er nært forbundet med metastase [32]. Vår nåværende funn er helt i tråd med den forrige undersøkelsen, men foreslår for det første at Lamin A styrer denne veien og for det andre kan det invasivitet bli indusert ved ekspresjon av T-Plastin gjennom den samme mekanismen. Interessant nok har vi også observert at endogen lamin A ble påvist i SW480-celler ved stabil ekspresjon av GFP-lamin A, mens i nærvær av GFP alene lamin A forble fraværende. Det er vel kjent at A-type lamins er utsatt for spalting i den ikke-heliske region linker 2 [3]. Lamin A eksisterer i cellene som enten parallelle dimmere eller anti-parallelle tetramerer, hvor det N-terminale domene hode overlapper den linker 2 region [45]. Siden GFP-delen befinner seg ved N-terminus, kanskje dette store protein beskytter linkeren 2 fra proteolytisk degradering og derfor stabiliserer både GFP-lamin A og endogene lamin A. logisk konsekvens av denne hypotese er at fraværet av lamin A i cellelinjer SW480 er på grunn av post-translasjonell modifikasjon av proteinet.
Hvordan nærvær av lamin A påvirker ekspresjonen av et aktin-bunting protein er gjenstand for nedstrøms studier. Imidlertid kan to forskjellige mekanismer tenkes. Det har nylig blitt vist at A-type lamins direkte påvirker organiseringen av cytoskjelettet, strekkstyrken av celler [46] og deres evne til å reagere på stress [10]. Dette oppnås via LINC komplekset, som formidler assosiasjoner mellom atom lamina og cytoskjelettet via nesprins [4]. Derfor, er en mulighet for at tilstedeværelse eller fravær av lamin A i en kreftcelle kan føre direkte til cytoskeletal omstilling via en tilbakekoblingssløyfe, som avføler strekkstyrken i cellen. Alternativt har lamin A vist å interagere direkte med et utvalg av transkripsjonsfaktorer [17] og dens tilstedeværelse kan direkte påvirke ekspresjon av T-Plastin. Uansett, er den fenotypiske utfallet av denne omorganiseringen økt invasivitet og antagelig økt metastatisk potensial.
I konklusjonen, foreslår vi at den høye risikoen for dødelighet av CRC relaterte årsaker hos pasienter som viser A-type lamin uttrykk innenfor sine svulst oppstår fordi lamin A er en opp-strøm regulator av en reaksjonsvei som forbinder aktin dynamikk til tap av celle-adhesjon, og dermed fører til økt celle motilitet og følgelig økt invasiv potensialet av tumoren. Denne fenotype kan i sin tur være representative for en mer stamcelle-lignende egenskap av kreft. Mens mutasjoner i lamins A /C har vært implisert i et vidt spekter av sjeldne genetiske sykdommer [3], vår nåværende funn for første gang koblingen ekspresjon av disse proteinene med progresjon av en av de vanligste årsaker til kreft-relaterte dødsfall i vestlige verden.
Materialer og metoder
Immunohistochemistry
Parafin seksjoner (4 mikrometer) av normal tarmslimhinnen og tykktarms adenokarsinom ble de-paraffinised og rehydrert i xylen og etanol. For antigen gjenfinning ble snittene neddykket i 3% H
2o
2 for å slukke endogen peroksidaseaktivitet før den ble inkubert i 0,01 M citratbuffer (pH 6,0) i 20 minutter ved 90 ° C. Seksjonene ble deretter blokkert med 5% normalt geiteserum etterfulgt av inkubasjon med enten JoL2, anti-Lamin A /C mus mAb [47] [01:10], PC10, anti-PCNA mus mAb [1:100], RalC, anti -lamin C kanin polyklonalt antistoff [24] [1:100] eller 133A2, anti-lamin En mus-mAb [48] [1:100] over natten ved 4 ° C. Seksjonene ble deretter inkubert med biotinylert geit-anti-mus-IgG fortynnet ved 1:400 i 45 minutter ved romtemperatur. Standarden ABC prosessen ble deretter utført i henhold til instruks fra Dako (DakoCytomation, Glostrup, Danmark). Diaminobenzidine ble brukt som et kromogen fulgt av lys kontra med Mayers Haemalum.
Cell kultur
Den menneskelige pre-metastaserende tykktarms adenokarsinom cellelinjer HT29 og SW480 ble hentet fra den europeiske Innsamling av cellekulturer, UK. HT29 ble dyrket i McCoys 5A medium (Sigma, UK) supplert med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og holdt i et fuktig miljø ved 37 ° C med 5% CO
2. SW480-celler og transfekterte derivater ble dyrket i Leibovitz-15 (L-15) medium (Invitrogen, UK) supplert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og holdt i et fuktig miljø ved 37 ° C uten CO
2.
Stabil transfeksjon av GFP-reportere i SW480 kolon adenokarcinomceller
SW480 celler ble transfektert med DNA-konstruksjoner som koder for et fusjonsprotein EGFP-lamin en full-lengde (gave fra Dr M. Izumi, Institute of Physical and Chemical Research, Saitama, Japan) og EGFP.
