Abstract
Bakgrunn
genetiske varianter kan påvirke mikroRNA-target interaksjon gjennom modulere sin bindende affinitet, skape eller ødelegge miRNA-bindingssteder. SET8, et medlem av SET domeneholdige metyltransferase, har vært innblandet i en rekke utvalg av biologiske prosesser
Metoder
Ved hjelp av Taqman assay genotypet vi en polymorfisme rs16917496 T . C i MIR-502 bindingsstedet i 3′-utranslaterte område av
SET8
genet i 576 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter. Funksjoner av rs16917496 ble undersøkt ved hjelp av luciferase aktivitetsanalyse og validert av immunfarging.
Resultater
Log-rank test og cox regresjon indikerte at CC genotype var assosiert med en lengre overlevelse og en redusert risiko for døden for NSCLC [58.0 vs. 41.0 måneder,
P
= 0,031; hazard ratio = 0,44, 95% konfidensiell intervall: 0,26 til 0,74]. Videre trinnvis regresjonsanalyse antydet rs16917496 var en uavhengig gunstig faktor for prognose og den beskyttende effekten mer fremtredende i aldri-røykere, pasienter uten diabetes og pasienter som fikk kjemoterapi. Det ble observert en signifikant interaksjon mellom rs16917496 og røyking status i forhold til NSCLC overlevelse (
P
0,001). Luciferase aktivitetsanalyse viste en lavere uttrykk nivå for C-allelet sammenlignet med T-allelet, og Mir-502 hadde en effekt på modulering av
SET8
genet
in vitro
. CC genotype ble assosiert med redusert SET8 protein uttrykk basert på farging av 192 NSCLC vevsprøve (
P
= 0,007). Lavere nivåer av SET8 var assosiert med en ikke-signifikant lengre overlevelse (55,0 vs. 43,1 måneder)
Konklusjon
Våre data antydet at rs16917496 T . C ligger på MIR-502 bindingssetet bidrar til NSCLC overleve ved å endre SET8 uttrykk gjennom moduler miRNA-target interaksjon
Citation. Xu J, Yin Z, Gao W, Liu L, Yin Y, Liu P, et al. (2013) genetisk variasjon i en mikroRNA-502 Minding Site i
SET8
Genet medd kliniske resultatet av ikke-småcellet lungekreft i en kinesisk befolkning. PLoS ONE 8 (10): e77024. doi: 10,1371 /journal.pone.0077024
Redaktør: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugal
mottatt: 02.07.2013; Godkjent: 27 august 2013; Publisert: 11 oktober 2013
Copyright: © 2013 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81172140, 81272532), Prioritet Academic Program Utvikling av Jiangsu høgskolerådet (JX10231801) og Jiangsu-provinsen klinisk vitenskap og teknologi prosjekter (Clinical Research Center, BL2012008). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft fortsetter å være den ledende årsak til kreft dødsfall over hele verden, på grunn av sin høye forekomsten, ondartet oppførsel og mangel på store fremskritt i behandlingsstrategi. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ca 80% av alle tilfeller av lungekreft, med mindre enn 15% av pasientene som overlever utover 5 år [1], [2]. Oppdagelsen og anvendelse av spesifikke prognostiske biomarkører i tillegg til standard tumor, lymfeknute, og metastase (TNM) staging system kan forbedre medisinsk behandling av pasienter med NSCLC [3]. Til tross for intens innsats [4], [5], [6], er det fortsatt mangel på spesifikke biomarkører for lungekreft prognose anslag. En ideell biomarkør skal være enkelt å oppdage, stabil og reproduserbar. Genetiske variasjoner i kreftpasienter kan tjene som prognostiske markører for klinisk resultat.
microRNAs (mirnas) er en klasse av små (~20-22 nt) ikke-kodende RNA-molekyler som regulerer genekspresjon gjennom binding 3′- utranslaterte region (3’UTR) av målrettet mRNA [7]. Det er anslått at om lag 30% av menneskets gener er transkripsjonen eller posttranskripsjonelt regulert av miRNAs. Som et resultat, er mirnas involvert i viktige biologiske prosesser, inkludert utvikling, differensiering, apoptose og proliferasjon [8], [9]. Nyere studier har vist at feilregulert miRNA uttrykk mønstre i ulike kreftformer, som indikerer viktige roller mirnas i initiering, progresjon og metastasering av kreft hos mennesker [10], [11]. Mirna ekspresjonsprofiler og spesifikke mirnas er blitt vist å assosiere med overlevelse av en rekke kreftformer, inkludert lungekreft [12], [13], [14]. Single-nukleotid polymorfismer (SNPs) i pre-miRNA eller Eldre miRNA sekvenser og miRNA-bindingsseter kan moduleres de miRNA-målet interaksjoner gjennom å endre miRNA uttrykk, modning, ødelegge eller skape miRNA-bindingsseter, noe som resulterer i dereguleringen av målet genet uttrykket [15], [16], [17]. Denne typen polymorfismer har vært implisert i kreft følsomhet, kjemoterapi følsomhet og prognose [16], [18], [19], [20]. Blant disse miRNA-bindingsstedet SNPs er den som finnes i MIR-502 bindingsstedet i 3’UTR av histone metyltransferase
SET8
genet [21].
SET8
(også kjent som PR-SET7 /SETD8 /KMT5A, ligger på kromosom 12q24.31), et medlem av SET domeneholdige metyltransferase familie spesielt rettet mot H4K20 for monomethylation [22], [23], har vært innblandet i en forskjellige utvalg av biologiske prosesser, slik som transkripsjonsregulering [24], [25], heterochromatin formasjon [26], genomisk stabilitet [27], [28], cellesyklusprogresjon og utvikling [28], [29], [30 ], [31], [32]. Nylig, Shi et al. [33] viser en aktivitet for SET8 som en p53 methylatransferase og Yang et al. [34] avslørte en ny rolle for SET8 i tumorinvasjon og metastasering. Tidligere studier tyder på en polymorfisme rs16917496 T C, som ligger innenfor MIR-502 bindingssetet i
SET8
3’UTR (figur 1A), modulerer SET8 protein uttrykk, og dermed bidrar til brystkreft og eggstokkreft mottakelighet, og kliniske resultatet av leverkreft [35], [36], [37].
(A) sekvensen komplementaritet har-MIR-502 og
SET8
3’UTR er her vises. (B) Direkte sekvensering og Skjematisk tegning av reporteren konstruerer inneholder 1650 bp 3’UTR av
SET8
med rs16917496 T eller C-allelet. (C) Luciferase uttrykk for konstruksjoner som inneholder rs16917496 T eller C-allelet i A549 og 293T celler. Hver transfeksjon ble utført med PRL-SV40 plasmider som normaliserte kontroller.
SET8
3’UTR luciferase reporter plasmider ble transfektert med kjemisk syntetisert modne HSA-MIR-502 med eller uten Mir-502-hemmere i A549 og 293T cellelinjer. 3’UTR, 3′-utranslaterte område.
I denne studien genotypet vi rs16917496 i NSCLC å demonstrere at dette SNP er en viktig genetisk variant for å overleve prediksjon. Vi validert også at SNP rs16917496 var relatert til
SET8
uttrykk gjennom å påvirke MIR-502 binding til
SET8
3’UTR.
Materialer og metoder
etikk Uttalelse
Denne studien ble godkjent av Institutional Review board of Nanjing Medical University. Alle deltakerne var frivillig, og vil fullføre informert samtykke i skriftlig før du tar del i denne forskningen.
Studiepopulasjon
Alle forsøkspersonene ble rekruttert fra First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University (Jiangsu, Kina ) mellom januar 2004 og september 2012. Alle pasientene ble nylig diagnostisert, histopathologically bekreftet og uten tidligere andre kreftformer eller forrige kjemo- eller stråleterapi. Alle fagene var irrelevant etniske Han-kinesiske befolkningen. Etter skriftlig informert samtykke ble innhentet, et strukturert spørreskjema om demografiske data og miljømessig eksponering historie, som alder, kjønn og røyking forbruk, ble administrert gjennom ansikt-til-ansikt intervjuer av trente intervjuere. Hver pasient donert 5-ml venøs blod for genomisk DNA-ekstraksjon. Forsøkspersoner med lav frekvens ( en sigarett per dag) og varighet (mindre enn 1 år) av røyking ble definert som ikke-røykere, alle andre ble klassifisert som røykere. Oppfølging ble utført hver 3. måned fra tidspunktet for innmelding til død eller siste planlagte oppfølging (siste oppfølging i februar 2013). Vi valgte pasienter med komplett oppfølging og tilstrekkelig DNA-prøve. Som et resultat ble 576 NSCLC pasienter inkludert og genotypet i vår studie. Den maksimale Oppfølgingstiden var 102 måneder (siste oppfølging i februar 2013) og den mediale oppfølgingstiden var 18,0 måneder.
Genotyping
genomisk DNA fra hvert individ ble ekstrahert ved en rutinemetode [38]. TaqMan allel diskriminering analysen ble valgt for genotyping ved hjelp av en ABI 7900 system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Primer og probe er: fremover, TTTATGATGACAAATAATTTTCAAGTT, revers, AATGTGAGACACAATGTCTTGATTATA og FAM-TTTATTTCCTTGTTTAAA-MGB, HEX-TTTATTTCCTTATTTAAAT-MGB. Den genotyping Analysen inkluderte to tomme (vann) kontroller i hver 384-brønners format og mer enn 10% av prøvene ble tilfeldig valgt for gjentatt analyse, som ga 100% samstemmighet.
Byggingen av reporter plasmider
Siden en signifikant sammenheng ble senere observert for rs16917496 T C polymorfisme og NSCLC overlevelse, vi konstruert to reporter plasmider inneholder rs16917496 T eller rs16917496 C-allelet for å finne ut om denne polymorphism hatt noen effekt på genekspresjon (figur 1B). Den T-allelet reporter-konstruksjonen var syntetisk ved anvendelse av standard DNA-teknikker (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Produktet og pMIR-RAPPORT ™ (Appied Biosystems) vektor med Renilla og Firefly luciferase gensekvenser ble spaltet ved hjelp av
Mlu
jeg og
Sac
I (NEB) og deretter bundet av T4 DNA ligase (NEB). Den C-allelet av rs16917496 ble generert med seterettet mutagenese kit (Takara, Berkeley, CA, USA) med fremover mutagene primer 5′-AAAGAAgAAGGAACTAGGTCAAAAATCTGTCC-3 «og omvendt mutagene primer 5′-TAGAGCAAAAAGAACTTTTACCTCGGCATC-3» i henhold til produsentens protokoll . Alle konstruksjoner brukt i denne studien ble verifisert ved å dirigere sekvensering (figur 1B)
RNA Interferens, Forbigående transfections og luciferase Analyser
rs16917496 T . C polymorfisme ligger på bindingssetet av speil 502 (figur 1A). Så søkte vi etterligne og hemmer av denne miRNA som syntetisert av GenePharma (Shanghai, Kina) for å vise sin effekt på pMIR-SET8 reporter genet in vitro. De A549 og 293T-celler ble holdt i RPMI 1640 medium med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA) og 50 ug /ml streptomycin (Gibco). Celler ble sådd ut i 24-brønners plater med 1 x 10
5 celler per brønn og dyrket i en 37 ° C inkubator supplert med 5% CO
2 i 24 timer. Cellene ble deretter forbigående co-transfektert med
SET8
3’UTR luciferasepreparater plasmider (forskjellige alleler) og MIR-502 mimcs med eller uten Mir-502-hemmere ved hjelp Lipofectamine 2000 i henhold til protokollen (Invitrogen). PRL-SV40 plasmid (Promega, Madison, WI, USA) ble også tilført som en normalisering kontroll. Ved 24 timer etter transfeksjon, ble cellene samlet og analysert for luciferaseaktiviteten med Dual-luciferase reporter Assay System (Promega). Uavhengige tredoble eksperimenter ble gjort for hvert plasmid konstruksjon.
Immunohistochemistry
uttrykk for SET8 proteiner i lungekreft ble oppdaget av immunhistokjemi (IHC). Lysbilder ble utarbeidet med en Ventana autoimmunostainer (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) og en anti-SET8 antistoff (Abcam, Cambridge, UK). Detection utnyttet Polymer-HRP, med 3,3-diaminobenzidin. Lysbilder ble visualisert på 40 × med et Nikon Eclipse mikroskop.
Seksjonene ble anmeldt og scoret av to patologer som ble blindet til genotyping resultater. Kontroversielle saker ble vurdert på nytt i fellesskap frem til en enighet ble nådd. For sammenligning av farge resultatene, ble prøvene scoret halv kvantitativt ved hjelp av et histologisk score (H-score). Intensiteten av tumorcellekjerne immunoreaktivitets (1, ingen eller svak, 2, moderat, og 3, intense) ble multiplisert med prosentandelen av positive neoplastiske celler (1-100), ble dermed skaffe verdier fra 0 til 300. SET8 uttrykk kategorisert så høy (på eller over median H-poengverdi) eller lav (under median H-poengverdi).
Statistical Analysis
Hardy-Weinberg likevekt ble vurdert av en godhet-of fit χ
2 test. Total overlevelse (OS) ble beregnet som tiden mellom den første behandling og død eller den siste oppfølging dato. Sammenhengen mellom genotype og overlevelsesraten ble anslått av Kaplan-Meier metoden og log-rank test. Median overlevelsestid (MST) ble beregnet, og den midlere tid blir presentert når den midlere tid ikke kunne beregnes. Cox-modeller ble utført for å estimere fareforhold (HRS) og deres 95% konfidensielle intervaller (CIS) for OS.
P
verdi for heterogenitet testen var basert på χ
2-baserte Q test. Den statistiske styrken ble beregnet ved å bruke PS-programvaren (https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize). T-test ble brukt for å sammenligne forskjellen i nivåene av luciferasereportergenet uttrykk. Fordelingen av IHC uttrykk karakterer for hver
SET8
genotype ble sammenlignet ved hjelp av en χ
2 test. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 18.0 programvare (SPSS Inc.), og
P
0,05 i en to-side test ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
kjennetegn på studiepopulasjonen
de demografiske karakteristika og klinisk informasjon om pasientene og foreningen med OS er vist i tabell 1. median alder ved diagnose var 60 år (fra 29-86), og det var 380 menn (66,0%) og 267 røykere (46,4%). Blant disse pasientene, 381 (66,2%) var adenokarsinomer, 166 (28,8%) var plateepitelkarsinom, og de andre (29 pasienter, 5,0%) var stor celle, udifferensiert og mixed-karsinomer. I løpet av oppfølgingsperioden, 206 pasienter døde av NSCLC. Røykestatus, klinisk stadium og kirurgisk operasjon, men ikke kjemoterapi eller målrettet terapi status, var signifikant assosiert med overlevelse (alle log-rank P 0,001). Interessant, pasienter med diabetes (MST, 54,9 måneder) hadde en 42% betydelig redusert risiko for død (HR = 0,58, 95% KI: 0,35 til 0,97), sammenlignet med de uten diabetes (MST, 42,0 måneder)
Effekt av SET8 3’UTR rs16917496 T C Polymorphism på NSCLC Survival
genotype frekvensene til rs16917496 var i Hardy-Weinberg likevekt (
P
= 0,272). I samsvar med tidligere rapporter, ble den C-allel funnet å være den minste frekvens allelet [21], [35], [36], [37]. Log-rank test oppdaget en signifikant sammenheng av rs16917496 med NSCLC overlevelse i ulike genetiske modeller (
P
= 0,006, 0,031 og 0,003 for codominant modell, dominerende modellen og recessive modell, hhv. Figur 2A). Pasienter som bærer rs16917496 CC genotype hadde en bedre OS i forhold til de med TT genotype (58.0 vs. 41.0 måneder, HR = 0,44, 95% KI: 0,26 til 0,74). Univariat Cox regresjonsanalyse viste at dette SNP var en betydelig prognostisk markør for NSCLC (dominerende modell: HR = 0,74, 95% KI: 0,56 til 0,98; recessive modell: HR = 0,47, 95% KI: 0,28 til 0,79) (tabell 1) . Foreningen er fortsatt betydelig etter justert for alder, kjønn, røykestatus, diabetes mellitus, histologi, klinisk stadium, kirurgisk operasjon og behandling status (dominerende modellen: HR = 0,70, 95% KI: 0,53 til 0,92). Videre har en studie makt på 91,7% (tosidig test, α = 0.05) er oppnådd for å oppdage en HR på 0,70 for C allel genotypene i den dominerende modellen.
(A)
SET
8 rs16917496 genotype og NSCLC overlevelse (log-rank
P
= 0,006) i en codominant modell. (B) Kaplan-Meier plott av overlevelse ved kombinasjon av
SET8
genotyper og røykestatus i NSCLC overlevelse (log-rank
P
0,001). 0, pasienter med felles genotype (TT) og stadig røyke; 1, de med variant genotyper (CT eller CC) og stadig røyke; 2, de med vanlig genotype men uten røyking; 3, de med variant genotyper og uten å røyke. (C) lav uttrykk; (D) høyt uttrykk. Celler med en brun-farget kjerne regnes som positive. Original forstørrelse: × 200. NSCLC, ikke-småcellet lungekreft.
For å finne uavhengige prognostiske faktorer, vi videre gjorde en multivariat trinnvis Cox regresjonsanalyse med utvalgte demografiske kjennetegn, kliniske funksjoner og SET8 genotype på NSCLC overlevelse. Resultatene indikerte at
SET8
rs16917496 polymorfisme (
P
= 0,014) ble holdt i sluttprognosemodell sammen med røykestatus, diabetes mellitus og kirurgisk operasjon (
P
= 0,006, 0,018 og. 0,001, henholdsvis) (tabell 2)
Stratifisering og Interaction Analysis
Sammenhengen mellom
SET8
rs16917496 polymorfisme og NSCLC overlevelse ble ytterligere evaluert av stratifisert analyse av røykestatus, diabetes mellitus, histologi, klinisk stadium, kirurgisk operasjon, cellegift og målrettet terapi status. Som vist i tabell 3, den beskyttende effekten av variant genotyper av
SET8
rs16917496 var mer fremtredende hos kvinner som aldri røyker (justert HR = 0,54, 95% KI: 0,35 til 0,83), pasienter uten diabetes (justert HR = 0,70 , 95% KI: 0,53 til 0,94), pasienter som fikk kjemoterapi (justert HR = 0,69, 95% KI: 0,51 til 0,92), men ikke målrettet terapi (justert HR = 0,52, 95% KI: 0,24 til 1,02). Heterogenitet test viste at heterogenitet i hver to lag var betydelig for røykestatus (
P
= 0,016). Derfor et gen-røykestatus interaksjonsanalyse ble utført (tabell 4), og det var en statistisk signifikant multiplikativ interaksjon mellom genotyper av rs16917496 og røykestatus på NSCLC overlevelse (
P
for multiplikativ samhandling 0,001 ). Sammenlignet med røykere med rs16917496 TT genotype, aldri røykere med CC + CT genotyper hadde en betydelig redusert risiko for død (justert HR = 0,50, 95% KI: 0,25 til 0,64). Kaplan-Meier plott av overlevelse ved kombinasjon av
SET8
genotyper og røykestatus i NSCLC spesifikk overlevelse er vist i figur 2B.
Effekt av SET8 3’UTR rs16917496T C polymorphism på SET8 Expression
rs16917496 T C polymorfisme ligger på bindingssetet av MIR-502 (figur 1A). Som spådd å bruke RNAhybrid [39], har MIR-502 en høyere minimum fri energi (MFE) med C-allelet (
