Abstract
Prostatakreft (PCA) er en kompleks sykdom som uforholdsmessig påvirker afrikanske amerikanere og andre individer av afrikansk avstamning. En rekke regioner over hele genomet har vært knyttet til PCA de fleste av dem med moderate effekter. Noen få studier har rapportert kromosomforandringer på 12p og 12q som oppstår under utbruddet og utvikling av PCa men hittil ingen konsekvent sammenslutning av sykdommen med kromosom 12 polymorfe variasjon har blitt identifisert. For å greie genetiske risikofaktorer som ligger til grunn PCA helseforskjeller vi undersøkt kromosom 12 ved hjelp av avstamning informative markører (AIMS), som tillater oss å skille genomiske regioner i Europa eller Vest afrikansk opprinnelse, og testet dem for tilknytning PCa. Andre SNPs ble genotypet i de områdene der betydelige signaler om foreningen ble oppdaget. Det sterkeste signalet ble oppdaget ved SNP rs12827748, som ligger oppstrøms for
PAWR
genet, en tumor suppressor, som er rikelig uttrykt i prostata. Den hyppigste allelet i europeere var risikoen allelet blant afro-amerikanere. Vi har også undersøkt vitamin D relaterte gener,
VDR Hotell og
CYP27B1
, og fant en signifikant sammenheng med PCa med TaqI polymorfisme (rs731236) i det tidligere. Selv om våre resultater garanterer videre etterforskning har vi avdekket en genetisk mottakelighet faktor for PCa i en sannsynlig kandidat ved hjelp av en tilnærming som utnyttet differensial bidraget av foreldregrupper til en blandet befolkning
Citation. Bonilla C, Hooker S, Mason T, Bock CH, Kittles RA (2011) Prostate Cancer Følsomhet Loci Identifisert på kromosom 12 i afrikanske amerikanere. PLoS ONE 6 (2): e16044. doi: 10,1371 /journal.pone.0016044
Redaktør: Amanda Toland, Ohio State University Medical Center, USA
mottatt: 13 august 2010; Godkjent: 06.12.2010; Publisert: 16 februar 2011
Copyright: © 2011 Bonilla et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. CB var en mottaker av US Department of Defense-congressionally Directed Medical Research Program gi no. W81XWH-06-1-0066. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) representerer et stort helsebelastning til den amerikanske mannlige befolkningen. Spesielt er afro-amerikanere uforholdsmessig berørt av PCA presentere med mer avansert sykdom og dårligere prognose enn europeiske amerikanere [1]. Årsaker til forskjellene omfatter en rekke genetiske og miljømessige faktorer som rase, alder, familiehistorie, sosioøkonomisk status og tilgang til helsetjenester [2].
I løpet av årene har det vært en opphopning av bevis i favør av en betydelig arvelig komponent ved PCA mottakelighet, men jakten på PCA gener har gitt noen konsistente resultater. Nylig har genome-wide aggregatet, foreningen og innblanding kartlegging skanner oppdaget risiko loci på kromosomene 2p15, 3p12, 6q25, 7q21, 8q24, 10q11, 11q13, 17q12, 17q24, 19q13, 22q13 og Xp11 [3] (se også GWAS katalog: https://www.genome.gov/gwastudies/), selv om polymorfe varianter i disse regionene synes å utgjøre bare en liten del av den observerte genetisk predisposisjon for PCa.
for å avgjøre om de helsemessige ulikheter mellom afrikansk amerikanere og europeiske amerikanere kan delvis forklares med forskjeller i genetisk bakgrunn vi søkte på lene med store frekvensforskjeller mellom disse populasjonene som også har en forekomst på følsomheten for PCa.
i en foreløpig screening av 21 avstamning informative markører ( AIMS) på kromosom 12 i 368 afroamerikanske PCA saker og kontroller fant vi en indikasjon på foreningen over en utvidet region (fra 23 Mb til 64 Mb). Vi økte utvalgsstørrelsen og dekning av kromosom med flere mål og SNPs i et forsøk på å begrense regionen av interesse, og hvis det er mulig, identifisere årsaks variant. Spesiell oppmerksomhet ble gitt til vitamin D reseptor (
VDR
, OMIM * 601769) genet, som ligger på kromosom 12q13.11, som det er en sannsynlig kandidat og tidligere rapporter har avdekket en sammenheng mellom polymorfismer i dette genet og PCa [4].
Materialer og metoder
fag
Fem hundre og femti urelaterte afroamerikanske saker og kontroller ble inkludert i studien. Rekruttering for både pasienter og friske kontroller fant sted ved Howard University Hospital i Washington, DC, gjennom Division of Urology og prostata kreft screening.
PSA nivåer og andre kliniske undersøkelser ble bestemt for alle PCA saker og alle kontroller . Prostatakreftpasienter ikke har mer enn en første grad slektning med PCa. Alle kontroller hadde en vanlig digital rektal undersøkelse.
Sykdom aggressivitet ble definert basert på TNM stadium og Gleason grad. Lav aggressivitet ble bestemt av en T kategorien T2C og en Gleason grad 7. Motsatt var høy aggressivitet preget av en T kategori ≥T2c og en Gleason grad ≥7. Studien ble godkjent av Howard University og University of Chicago sykehus Institutional Review Board og av alle deltakerne, som ga skriftlig informert samtykke.
Genomisk DNA ble innhentet fra perifere blodprøver ved bruk av standard teknikker.
Genotyping
et sett av 124 avstamning informative markører (AIMS) ligger på kromosom 12, hvorav de fleste ble valgt fra en publisert blanding kartet skreddersydd for afro-amerikanere [5], ble genotypet i saker og kontroller og benyttes til anslå lokal herkomst. I tillegg ble individuelle tilsetningsstoffmengdeforhold beregnet ved hjelp av et sett med 103 genom som mål valgt fra det samme panelet. Personer som tilhører hver foreldre befolkningen, dvs. HapMap Yoruba (YRI) og CEPH (CEU), ble også skrevet for disse markørene.
I tillegg har vi genotypet femten SNPs i to gener som er involvert i vitamin D metabolismen, elleve på vitamin D reseptor (
VDR
) og fire på
CYP27B1 plakater (OMIM * 609506).
til slutt genotyper for en ytterligere sett med 55 SNPs på kromosom 12 ble samlet inn og analysert i et forsøk på å omskrive de tilknyttede områder til bestemte gener.
Illumina BeadLab plattformen [6] ble brukt til å genotype alle målene i dette prosjektet.
VDR
,
CYP27B1 Hotell og alle SNPs brukes til finere kartlegging ble analysert med Sequenom MassArray plattformen [7].
Alle fysiske posisjoner og SNP detaljer rapportert i denne studien var basert på NCBI genom bygge 36 og dbSNP bygge 130.
data~~POS=TRUNC analyse~~POS=HEADCOMP
programstrukturen v2.2 [8] ble kjørt for å beregne individuelle og locus-spesifikk herkomst. For vår analyse antall foreldrepopulasjoner ble satt til to. Kjører besto i utgangspunktet av 30000 brenne-ins og 70000 iterasjoner, og 5000 tilsetningsstoff brenn-ins når det er nødvendig. For å samle inn data på stedet-by-side (lokal) aner vi brukte sammenhengen modellen, mens en modell som bruker befolkningen informasjon fra foreldre individers genotyper ble valgt for å oppnå individuelle opphav proporsjoner.
koblingsulikevekt (LD) mønstre langs kromosom 12 ble undersøkt med programmet Haploview v4.2 [9]. Valg av tagSNPs ble også gjort med Haploview bruker YRI som referansegruppen, parvis tagging og ar
2 terskel på 0,8.
Binary logistisk regresjon ble brukt for å estimere odds ratio (OR) og 95% konfidensintervall intervaller (KI) for foreningen av individuelle markører og haplotyper med PCa med justering for alder, individuell og lokal herkomst, via programmene SPSS v15 og plink 1.07 [10]. Strøm beregninger ble utført med programmet Genetic Strømkalkulator [11].
Funksjonell
i silico
analyse av genvarianter for å identifisere endringer i transkripsjonsfaktor bindingsseter, 5’UTR og 3’UTR motiver og bevaring tvers av arter ble utført ved hjelp av programmer som er inkludert i GENEPI kassen [12].
Resultater
i alt 669 personer ble lagt inn i analysen, inkludert 253 African American PCA pasienter , 297 afroamerikanske kontroller, 59 vest-afrikanere (HapMap Yri) og 60 europeere (HapMap CEU). Kliniske og demografiske kjennetegn ved den afroamerikanske prøven er presentert i tabell 1.
Etter å ha eliminert markører med mer enn 50% manglende genotyper, mindre enn 5% mindre allel frekvens (MAF), ut av Hardy- Weinberg likevekt i kontrollene (p 0,0005), nært knyttet til andre ( 0.1 cm intermarker avstand)., 76 kromosom 12 mål og 88 genom-wide mål ble analysert (Tabeller S1 og S2)
Basert på kraften analyserer vi hadde i gjennomsnitt ~70% effekt (36-83%) for å oppdage en genotype relativ risiko på 1,5 på en alfanivå på 0,05 for varianter med en mindreårig allelfrekvens ≥5%, forutsatt at markøren er i fullstendig LD med årsaks variant og en forekomst av PCa i afrikanske amerikanere på 2,5%. Dersom alle varianter ble ansett, minsket kraft til -60% (8-83%) på grunn av det faktum at det er begrenset kraft for å påvise effekten av variantene med frekvenser under 5% (22% effekt i gjennomsnitt), se Tabell S3.
Slekts og befolkningsstruktur
Bruke sett genom-wide mål, mener allelfrekvens forskjell (delta) mellom foreldrepopulasjoner ble funnet å være 74%, som strekker seg fra 55% til 96% ( Tabell S2). STRUKTUR løper etablert to som den mest sannsynlige antall klynger i afrikanske amerikanere, uavhengig av status, som indikerer tilstedeværelse av befolkningen lagdeling. Gjennomsnittlig europeisk individuell herkomst (± SD) var 22 ± 17% for hele utvalget, i likhet med tidligere rapportert estimater for denne populasjonen [13]. PCA tilfeller hadde i gjennomsnitt høyere vestafrikanske opphav enn kontroller (79% vs. 77%) selv om forskjellen var ikke signifikant (tabell 1). Pasientene var betydelig eldre enn kontrollene (p 0,001, Tabell 1).
Association med sykdomsstatus
Vår innledende analyse ved hjelp av 242 tilfeller og 126 kontroller fant at tre av 21 mål var signifikant assosiert med sykdomsstatus etter justering for alder og individuell herkomst (p 0,05, tabell 2)., mens en annen AIM var nær betydning (rs1963562, p = 0,07)
for ytterligere å undersøke disse forening signaler utvidet vi kromosom 12 AIM sett med 75 flere polymorfismer og økt størrelsen på utvalget til totalt 550 individer. Gjennomsnittlig allelfrekvens forskjellen mellom vest-afrikanere og europeere for forstørret sett målene var 70% (fra 24% -95%), og den gjennomsnittlige avstanden mellom merkene var 1,25 Mb (Tabell S1). Dekning av kromosom utvidet fra 0,2 Mb til 131,2 Mb. Svært få markører for denne AIM panelet er i LD i hele regionen, og de som ikke viser lav R
2 verdier. Dette forventes i noen grad som varianter ble valgt for å sikre fravær av LD i foreldrepopulasjoner.
Association med PCa ble avdekket for ti nye markører på et alfanivå på 0,05, justert for alder og individuell herkomst, selv om ingen oppnådd betydning hvis du søker en Bonferroni korreksjon for multippel testing (p 0,0007, Tabell S1). Interessant, for alle loci, den hyppigste allelet blant europeere var også allelet confering risiko for PCa.
Vi valgte 55 ekstra SNPs innenfor tilhørende regioner og nabo kandidat gener for å prøve å finne kilden til foreningen signal . Preferanse ble gitt til tagSNPs som definert av programmet Haploview i YRI populasjonen. Dette ble gjort i to omganger, ble 20 SNPs skrevet og analysert først og basert på disse og tidligere resultater, ble 35 flere varianter til, særlig i genene
TMTC1
,
HMGA2 plakater (OMIM * 600 698) og
PAWR plakater (OMIM * 601936), som viste sterkest sammenheng med PCA (tabell S1 og S4). Seks SNPs var invariant i denne populasjonen, mens tre var ute av Hardy-Weinberg likevekt (p 0,002), derfor 46 polymorfismer ble inkludert i den endelige analysen, hvorav fire var signifikant assosiert med PCa (en i
HMGA2
og tre i
PAWR
). Vi gjorde ikke forfølge
HMGA2
foreningen videre siden rs17179670 er en intronic variant, er den eneste polymorfisme assosiert til sykdom innenfor dette genet og foreningen signalet er ikke spesielt sterk (p = 0,03).
den PAWR genet omegn
etter alle rundene analyse rs12827748, som ligger oppstrøms for
PAWR
genet, forble den mest signifikant assosiert SNP, selv etter justering for alder og individuell herkomst (p 0,01). Dette SNP viser en stor frekvensforskjell mellom europeiske og vestafrikanske populasjoner (C-allel: 0,63 vs 0,01, respektivt), mens frekvensen av den samme allel i PCA tilfeller er 0,18 sammenlignet med 0,11 i kontroller (tabell S4). For å eliminere lagt confounding av herkomst vi inkludert lokale opphav anslag i regresjonsmodellen.
Lokale herkomst ved rs12827748 ble vurdert ved hjelp av AIM rs10778691, som var den nærmeste til rs12827748 (fjern ~130 kb), og avdekket at sannsynligheten for at to europeiske kromosomer ved dette locus var større i tilfeller enn i kontrollene, selv om resultatet var ikke signifikant (8,3% mot 7,6%, p = 0,74). Ytterligere justering for lokal herkomst ikke eliminere betydningen av sammenhengen mellom rs12827748 og PCa (OR 1,6; 95% CI, 01.01 til 02.04, p = 0,02, tabell 3).
To andre
PAWR
SNPs var også signifikant (rs8176908, rs8176882, p 0,05, Bord 3 og S4), de mindre lene er helt fraværende i europeiske befolkninger og har en lavere enn 10% frekvens blant vest-afrikanere. Likevel, når alle tre merkene er inkludert i logistisk regresjon med alder, individuell og lokal herkomst som kovariater, viser bare rs12827748 en signifikant sammenheng (p = 0,03). Koblingsulikevekt er sterk mellom rs8176908 og rs8176882 men svakere mellom noen av disse og rs12827748 (data ikke vist).
haplotyper konstruert ved hjelp av de tre
PAWR
polymorfismer viste en sterk beskyttende effekt av TGG haplotype (p = 1,7 × 10
-4), mens de haplotyper som inkluderte alle europeiske alleler (dvs. alleler som har en høyere frekvens i europeiske enn i vestafrikanske populasjoner, CGG) eller alle vestafrikanske alleler (TCT) økte risikoen betydelig av sykdom (tabell 4). Bare TGG haplotype forble signifikant etter korreksjon for multippel testing av permutasjon analyse.
Vi vurderte
i silico
virkningen at rs12827748 kan ha på gen-funksjon og fant ingen forstyrrelse av transkripsjonsfaktor bindingssteder eller andre regulerende effekt. Dette er en intergeniske SNP som ligger mellom
PAWR Hotell og
PPP1R12A Hotell og det kan være i koblingsulikevekt med funksjonelle varianter i enten genet, men
PAWR
som en tumor suppressor er en mer sannsynlig kandidat. Likevel LD mønstre i HapMap populasjoner CEU og YRI viser at rs12827748 kan bli funnet i en stor blokk som omfatter alle
PAWR Hotell og sin oppstrømsregion med et entydig skille fra blokken som inneholder
PPP1R12A
som forventet, bemerket vi at bærere av rs12827748 C-allelet vises signifikant høyere gjennomsnittlig europeisk opphav enn personer med TT genotypen (0,30 vs 0,20, p 0,005)., men det var ingen forskjell i herkomst mellom saker og kontroll innenfor hver genotype gruppe. Men hvis personene er valgt basert på lokale opphav nivåer, for eksempel ved å begrense prøven til de individer med høyere enn 95% sannsynlighet for å ha to europeiske kromosomer ved rs10778691 (N = 32) eller til de som bærer den rs12827748 CC genotypen (N = 21), tilfeller viser en betydelig forhøyet global vestafrikanske herkomst (54-66% vs 32-34% i kontroller), selv om det fortsatt er lav i forhold til gjennomsnittet av uselektert prøve (78%). Til tross for prøvestørrelser blir ganske liten forskjellene er signifikante (p = 0,03 og 0,01). Dette tyder på at det trolig er flere faktorer arvet fra den vestafrikanske stamfar som disponerer for PCa
Vitamin D relaterte gener:. VDR og CYP27B1
Den aktive formen av vitamin D (1,25 ( OH)
2D
3) reduserer spredning og fremmer differensiering, og har vært innblandet i kreft i tykktarm, bryst og prostata. Samtidig har det blitt rapportert at personer fra Vest-afrikansk avstamning har omtrent To gangers lavere nivåer av serum vitamin D (25 (OH) D, den viktigste sirkulerende metabolitt) enn de av hovedsakelig europeisk herkomst [14], noe som kan innebære mindre beskyttelse fra kreft for den førstnevnte. Det har vært antydet at polymorfe variasjon innen genene i vitamin D veien, for eksempel
VDR
, kan bidra til de observerte forskjeller i PCA priser mellom bestander av ulik opprinnelse.
Flere studier har undersøkt variasjon i
VDR
i søk etter en tilknytning til ulike typer kreft. Det er seks vanligvis studert polymorfismer i
VDR
: Cdx2 variant i promoter (rs11568820), Foki på ekson 2 (rs2228570), BsmI på intron 8 (1.544.410), Apal også på intron 8 (rs7975232), TaqI på ekson 9 (rs731236), og poly-A mononukleotid repeat på 3’UTR av genet. TaqI er i sterk LD med andre markører i regionen (BSMI, Apal og poly-A mikro). Polymorfismer i det 5 «regulatoriske region er kjent for å påvirke transkripsjonen aktivitet av genet, mens polymorfismer i 3’UTR har vært knyttet til stabiliteten av mRNA [15]. Resultater for PCa har vært i strid med noen studier som viser positive assosiasjoner og andre postulere ingen effekter [16] – [19]. En forening med avansert PCA har også blitt rapportert, dvs. Gleason grad ≥7 [20].
Siden to av genene i vitamin D vei, nemlig
VDR Hotell og
CYP27B1
, er plassert på kromosom 12, undersøkte vi dem nærmere ved å skrive noen SNPs i dem.
CYP27B1
koder for enzymet 1-α-hydroksylase som katalyserer omdannelsen av 25 (OH) D til 1,25 (OH)
2D
3. Polymorfe varianter i dette genet er kontrollert, men syntes ikke å være forbundet med PCa [21]. Detaljer om SNPs skrevet er gitt i tabell 5. Association med sykdommen ble sett på to nært knyttet
VDR
SNPs, rs731236 (TaqI) og rs7975128 (p 0,05, tabell 3 og 5), og deres haplotyper ( tabell 6). Men justering av alder og individuell aner fjernet betydningen av foreningene. Ingen effekt av
CYP27B1
varianter på PCa risikoen var tydelig i denne studien.
Diskusjoner
Vi har vist kromosom 12 i jakten på lene som disponere afro-amerikanere for utbruddet og utvikling av PCa og som kan delvis forklare de forskjeller i forekomst og dødelighet mellom afroamerikanere og europeiske amerikanere. Etter nøye kontrollere for effekten av individuelle og lokale herkomst identifiserte vi en polymorfisme (rs12827748) ligger oppstrøms for
PAWR
genet som betydelig økt mottakelighet for PCa. Den C-allelet, som gir risiko, er sjelden i vest-afrikanere, men er den viktigste allelet i europeiske befolkninger. To ekstra
PAWR
SNPs (en intronic, en synonymt) var også forbundet med PCa i én markør analyse, men inkluderingen av de tre polymorfismer i regresjonsmodellen eliminert all betydning bortsett rs12827748. Men ettersom de to sistnevnte variantene er kun til stede i populasjoner av vestafrikanske nedstigningen kan de også representere PCA risikofaktorer som på grunn av deres lavere frekvenser ikke blir detektert som uavhengig av hverandre signifikante signaler. Det er da en mulighet for at denne regionen havner resistensfaktorer fra EU samt West afrikansk opprinnelse, og i en blandet befolkning som afro-amerikanere både av dem kan være på jobb.
Det er også interessant å merke seg at alle av de tilhørende SNP faktisk var lav frekvens varianter med frekvenser rundt eller under 10% i kontrollene. Odds ratio som tilsvarer disse variantene, varierte mellom 1,6 til 2,8, høyere enn de vanligvis rapportert i genom-wide assosiasjonsstudier. På grunn av den relativt lille størrelsen på vårt studium er det ikke nok strøm til å påvise effekten av sjeldne varianter (dvs. de med frekvenser lavere enn 1%), og derfor kan ikke se bort fra dem som potensielle PCA forårsakende faktorer. Likeledes kan viktigheten av variantene med frekvenser under 5% ble undervurdert på grunn av utilstrekkelig effekt.
PAWR
eller prostata apoptose respons-genet er lokalisert på kromosom 12q21 og er høyt uttrykt i prostata. Det fremmer apoptose og fører til tumorregresjon, og dens nedregulering er tydelig under tumorigenesis [22]. Men tap av
PAWR
er ikke nok til å forårsake PCa i
PAWR
null mus, men ikke så når kombinert med samtidig
PTEN
heterozygositet [23]. Våre resultater tyder på at
PAWR
kan være en lav pene PCa mottakelighet genet og fortjener videre undersøkelse i andre populasjoner og med hensyn til andre PCa relaterte fenotyper. Relevansen av disse funnene vil imidlertid bare være bestemt av deres replikering i senere studier som vi ikke kan ignorere det faktum at studier med små utvalg er på et høyere risiko for å rapportere falske positive assosiasjoner [24].
begrenset antall saker og kontroller også påvirket vår evne til å gjennomføre en formell blanding kartleggingsstudie på kromosom 12 som det er redusert makt til å oppdage en mindre enn to ganger risiko på grunn av herkomst [25].
Vi oppdaget en marginalt signifikant sammenheng av PCa med to SNPs i
VDR
genet, inkludert TaqI polymorfisme. I motsetning til hva som har blitt funnet i en fersk meta-analyse av mindre allelet (C = t) ved TaqI var risikoen allelet i vår studie, selv om meta-analyse signifikant sammenheng ble identifisert ved å samle sammen europeiske, afrikanske og asiatiske populasjoner [4 ]. Men en nærmere titt på de data stratifisert etter etnisitet viser at mens C-allelet ser ut til å være beskyttende i europeere og asiater det synes å gi risiko i populasjoner av afrikansk avstamning [4]. De fleste av studiene som ble analysert TaqI i europeere fant ikke signifikant effekt eller rapportert at den store (T) allelet økt mottakelighet for PCa [26], [27]. På den annen side, studier av VDR polymorfismer i afrikanske amerikanere med PCa er ganske begrenset, de fleste med små prøvestørrelser og dermed ufullstendig med hensyn på rollen til TaqI [26].
Til slutt er det viktig å understreke at forsiktig genom-wide evaluering av forfedrenes opprinnelse i en blandet befolkning som afro-amerikanere representerer en verdifull måte å rakne de genetiske risikofaktorer som sannsynligvis vil bidra til eksistensen av helseforskjeller.
Støtte Informasjon
Tabell S1.
Liste over 76 avstamning informative markører (AIMS) fordelt langs kromosom 12 brukes for å beregne lokale herkomst og oppdage sammen med prostatakreft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0016044.s001 plakater (DOC)
Tabell S2.
Genome-wide opphav informative markører (AIMS) som brukes i beregningen av individuelle avstamning proporsjoner i African American prostatakreft tilfeller og kontroller
doi:. 10,1371 /journal.pone.0016044.s002 plakater (DOC)
Tabell S3.
Estimert makt til å påvise effekter av kromosom 12 SNPs
doi:. 10,1371 /journal.pone.0016044.s003 plakater (XLSX)
Tabell S4.
Femti-fem SNPs skrevet i tidligere forbundet eller kandidat kromosom 12 regioner
doi:. 10,1371 /journal.pone.0016044.s004 plakater (DOC)
Takk
Vi står i gjeld til alle deltagerne, og til Folasade Akereyeni og Chiledum Ahaghotu for deres uvurderlige hjelp med frivillig rekruttering.
