Abstract
Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den vanligste typen lungekreft, bestående av ca 75-80% av alle lungekrefttilfellene. Gemcitabin er en godkjent kjemoterapi narkotika for NSCLC. Målet med denne studien var å utvikle en ny strategi for å forbedre den terapeutiske effekten av gemcitabin for NSCLC av co-administrert iRGD peptid. Vi viste at satsene for positivt uttrykk for αvβ3, αvβ5 og NRP-en i A549-cellelinjen var 68,5%, 35,3% og 94,5%, henholdsvis. Mengden av Evans blå akkumulert i svulsten av Evans Blue-+ iRGD gruppe var 2,5 ganger større enn Evans Blue-gruppe. Satsene for veksthemming av svulster i iRGD gruppen, gemcitabin-gruppen og gemcitabin + iRGD gruppe var 8%, 59,8% og 86,9%, henholdsvis. Resultatene av mekanismen studiene viste at PCNA ekspresjon i gemcitabin + iRGD gruppe ble redusert 71,5% sammenlignet med det i Gemcitabin gruppe. Frekvensen av apoptose i gemcitabin + iRGD gruppen var 2,2 gang av gemcitabin-gruppen. Derfor kan den tumor-gjennomtrengende Peptide iRGD forbedre den tumor-inntrengningsevne og terapeutisk effekt av gemcitabin i A549 xenograft. Den kombinerte bruk av gemcitabin med iRGD kan være en roman strategi for å forbedre ende klinisk effekt av gemcitabin hos pasienter med NSCLC
Citation. Zhang Q, Zhang Y, Li K, Wang H, Li H, Zheng J (2015) A Novel strategi for å forbedre den terapeutiske effekt av gemcitabin for ikke-småcellet lungekreft ved tumor-Penetrating Peptide iRGD. PLoS ONE 10 (6): e0129865. doi: 10,1371 /journal.pone.0129865
Academic Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu «, ITALIA
mottatt: 25 oktober 2014; Godkjent: 13 mai 2015; Publisert: 12 juni 2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Science Foundation Natural i Jiangsu-provinsen (BK2012146, https://www.jstd.gov.cn/), Natural Science Foundation National of China (81301946, https://www.nsfc.gov.cn/), Jiangsu Provincial Office of Education Foundation (JHB2012-34, https://www.ec.js.edu.cn/), Kina Postdoktor Science Foundation finansiert prosjekt (2013M540467, https://res.chinapostdoctor.org.cn/BshWeb/index.shtml), og Suzhou Medical College Foundation (2012KJZ23, https://www.xzmc.edu.cn/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, og fortsetter å vise en økende forekomst [1, 2]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den vanligste typen av lungekreft, omfattende ca. 75-80% av alle lungekreft [3]. Diagnosen er ofte laget hos pasienter med avansert stadium sykdommen, og i nesten to tredjedeler av alle tilfeller har kreften allerede spredd utover et lokalisert område ved diagnosetidspunktet [4-6]. Dette begrenser mulighetene for terapi og fører til en dårlig prognose med en median overlevelsestid på mindre enn 12 måneder [7, 8]. De fleste pasienter med NSCLC tilstede med inoperabel sykdom, og derfor de nåværende behandlingsalternativer av cellegift og strålebehandling er palliativ i beste [7, 9]. Mange tradisjonelle cytostatika, inkludert Vindesine, karboplatin, Etoposide, ifosfamid, Cyklofosfamid og Mitomycin, har blitt brukt som monoterapi i tilfeller av NSCLC. I de siste årene har noen nye kjemoterapeutika som Vinorelbin, Paclitaxel, Docetaxel og gemcitabin også blitt brukt til å behandle NSCLC. Men disse kjemoterapeutiske midler bare gir små forbedringer i total overlevelse [10].
Gemcitabin er et deoksycytidin analogt som omdannes in vivo til aktive metabolitter inkludert difluorodeoxycytidine di- og trifosfat [11]. Den trifosfat analog gemcitabin erstatter en av nukleinsyresekvensene byggeklosser (i dette tilfellet, cytidin) under DNA-replikasjon. Denne prosessen arrestasjoner tumorvekst og til slutt fører til apoptose. Et annet mål av gemcitabin er ribonukleotidreduktase. Den difosfat analoge binder seg til det aktive sete av ribonukleotidreduktase og irreversibelt inaktiverer enzymet. Når enzymet inhiberes, blir DNA-replikasjon og reparasjon avsluttet, og apoptose induseres [11-13]. Gemcitabin har blitt godkjent av Food and Drug Administration (FDA) som behandling for avansert og metastatisk NSCLC, bukspyttkjertelkreft, blærekreft, eggstokkreft og brystkreft alene eller i kombinasjon med andre legemidler [14].
kliniske studier har vist at gemcitabin kan forlenge overlevelsen og forbedre livskvaliteten til pasienter med avansert NSCLC [14, 15]. Noen studier har rapportert at gemcitabin konsekvent gir responsrater som overstiger 20% når det brukes som monoterapi [14, 16, 17]. Imidlertid Gemcitabin svikter ofte for å oppnå tilstrekkelig sykdomskontroll på grunn av utilstrekkelig cytotoksisitet overfor tumorceller og utålelige bivirkninger. Den midlere overlevelse er utvidet i bare 2-4 måneder, og de fleste pasienter dør av sykdomsprogresjon [7, 9]. Derfor kan en enkelt doseøkning ikke forbedre tilstanden til pasientene; tvert imot, kan dette føre til alvorlige bivirkninger.
Tidligere studier har vist at kryssingen av vaskulære veggen og den gjennomtrengning inn i svulsten parenchyma mot forhøyet mellomliggende trykk i tumorer er fortsatt en stor utfordring for den terapeutiske effekten av de fleste kliniske medikamenter [18]. Noen anti-kreft medikamenter kan bare trenge en avstand på 3 til 5 celle diametre fra blodkar i faste tumorer [19]. For eksempel er konsentrasjonen av Doxorubicin avtar eksponentielt som avstanden fra tumorblodårene øker, og det har nådd halvparten av sin perivaskulær konsentrasjon i en avstand på ca 40 um [20]. Fordelingen av trastuzumab (Herceptin) i det indre område av brystet tumorxenografter er også svært heterogent, noe som resulterer i en manglende eksponering av mange tumorceller til påvisbare nivåer av medikamentet [21]. Derfor kan en økt tumor permeabilitet være en nyttig metode for å forsterke den terapeutiske effekt av cytostatika.
iRGD er et tumor-gjennomtrengende peptid (CRGDK /RGPD /EC) som har en spesifikk permeabilitet i tumorvev og i tumor blodkar [22]. Den RGD tripeptide av iRGD kan binde inte αvβ3 og αvβ5, er uttrykk for noe som i stor grad begrenset til svulster (inkludert tumor blodkar og celler) [22, 23]. Når iRGD binder seg til integriner, er peptidbindingen mellom aminosyrene K og G proteolytisk spaltet av celleoverflatetilknyttet proteaser; da er det kryptiske C-end Rule (CendR) motiv (CRGDK /R) som utsettes. Den CendR motiv bindes deretter til neuropilin-1 (NRP-1). Aktiveringen av NRP-1 øker permeabiliteten av blodårene og tumorvev, som lar medikamenter for å trenge inn i det indre vev av tumoren mye lettere [22-24]. Det har blitt bekreftet at iRGD har verdifull potensial som en måls sonde for molekylær avbildning av svulster og for levering av legemidler, og kan forsterke effekten av narkotika opptil tre ganger [24].
I denne studien, vi kombinert Gemcitabin med iRGD å behandle nakne mus xenografter av human NSCLC etablert med A549-cellelinjen. Våre resultater viste at iRGD effektivt kunne stimulere Gemcitabin å hemme tumorcelle-proliferasjon og indusere tumorcelle-apoptose. In vivo terapeutisk effektivitet var også betydelig forbedret. Disse resultatene antydet at kombinasjonsbehandling med iRGD kan være en lovende metode for å forbedre den kliniske effekten av gemcitabin for behandling av NSCLC.
Materialer og metoder
Cell kultur
human NSCLC-avledet cellelinje A549 ble kjøpt fra Shanghai Institute of Biochemistry og cellebiologi, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og dyrket i F-12K medium (Gibco, Grand Island, NY, USA) med 10% føtalt bovin serum (Gibco, Grand Island, NY, USA) og 1% penicillin /streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA).
Flowcytometri
Det er totalt 1 × 10
6 A549 celler ble inkubert med fluorescensmerkede antistoff fortynnet i 100 ul fosfatbufret saltvann (PBS) i 30 minutter ved romtemperatur. Cellene ble deretter vasket, oppslemmet og evaluert med en FACS maskin (FACSCanto II, Becton-Dickinson, USA). En matchende isotype kontroll-antistoff ble anvendt i alle analyser. Til slutt ble alle data analysert av FlowJo programvare (Tre Star, USA). FITC-konjugert mus-anti-human-integrin-antistoff αvβ3 og integrin αvβ5 antistoffer ble innkjøpt fra Chemicon (CA, USA). Den matchet isotypekontrollantistoff, FITC-konjugert mus IgG1κ, ble kjøpt fra eBioscience (San Diego, California, USA). PE-konjugert mus anti-human NRP-1 antistoff og dets isotype kontroll ble kjøpt fra MACS Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Nordrhein-Westfalen, Tyskland).
Mus og in vivo eksperimenter
I vivo eksperimenter involverte seks uker gamle BALB /C hårløse mus (Vital River Laboratory Animal Science and Technology Co, Ltd, Beijing, Kina), som ble plassert i den spesifikke patogen-frie dyr innretningen av Experimental Animal Center, Xuzhou Medical College (Kina ). Dyrene ble huset med en 12-timers lys /mørke-syklus, i temperatur (22 +/- 1 ° C) og fuktighet (55 +/- 5%) kontrollert rom. Alle mus ble tillatt fri tilgang til sterilt vann og mat. Alle bur plassert inntil 6 dyr og inneholdt tre spon og en uavhengig lufttilførsel system. Alle dyr eksperimentelle protokoller ble godkjent og anmeldt av Institutional Animal Care og bruk komité i Jiangsu-provinsen Academy of Chinese Medicine (SCXK 2012-0005). I in vivo forsøkene ble dyrene i alle forsøksgrupper undersøkt daglig for fysisk aktivitet. Ved slutten av eksperimentet ble musene avlivet ved cervikal dislokasjon.
tumormodell
humane NSCLC-modellen ble etablert som tidligere beskrevet [25]. I korte trekk, 1 x 10
7 A549-celler ble injisert inn i den venstre forbena armhulene av 6 BALB /c nakne mus. Når svulstene vokste til ca 150 mm
3, svulstene ble høstet og delt inn vevsblokker (4-6 mm
3 i størrelse). Deretter ble de venstre forbena armhulene av BALB /c nakne mus inokulert s.c. med vevet blokkene ved hjelp av en trocar. Musene ble behandlet når tumorene vokste til den ønskede størrelse.
Immunofluorescence farving
Når tumorene nådde ca. 200 mm
3, ble musene avlivet og tumorene ble dissekert og seksjonert på en cryostat. Seksjonene i de fire grupper (n = 3) ble inkubert over natten ved 4 ° C med den samme anti-human αvβ3, αvβ5 og deres isotypekontrollantistoffer som de som brukes i den flowcytometrisk analyse. Seksjonene i de to gruppene var farget over natten ved 4 ° C med et primært kanin anti-humant NRP-1-antistoff (Abcam, Beverly, MA, USA) og dens isotype kontrollantistoff (Abcam, Beverly, MA, USA). Deretter ble de delene farget med en DyLight 549-konjugert geit-anti-kanin IgG (H + L) sekundært antistoff (EarthOx, San Francisco, CA, USA) ved 37 ° C i 1 time. Alle delene ble deretter observert og fotografert med en fluorescens mikroskop (DS-Ri1, Nikon, Japan).
Tumor permeabilitet analysen
Når svulstene nådde ca 150 mm
3, totalt på 50 mg /kg Evans blå, 4 mg /kg iRGD, 50 mg /kg Evans blå + 4 mg /kg iRGD i 200 ul PBS som kjøretøy, eller 200 ul PBS alene ble injisert inn i fire grupper av tumorbærende mus (n = 3) respektivt. Tretti minutter senere ble musene bedøvet med kloralhydrat og ble perfusert gjennom hjertet med PBS med 1% BSA. Deretter ble organer og tumorvev oppsamlet. For Evans Blue-kvantifisering, 10 ul N, N-dimetylformamid ble tilsatt for hver 10 mg vev. Etter homogenisering, ble blandingene inkubert ved 37 ° C i 24 timer, ble blandingen deretter sentrifugert, og supernatantene ble høstet. Endelig kvantifisering ble utført ved å måle absorbans ved 600 nm med et spektrofotometer (BioTek Epoch, USA).
In vivo effektstudier
Når svulstene nådd ca 100 mm
3 etter 10 dager, ble musene inndelt i fire grupper (n = 6). I alt 100 mg /kg gemcitabin (Merck, Darmstadt, Tyskland), 4 mg /kg iRGD, 100 mg /kg gemcitabin + 4 mg /kg iRGD i 200 ul av PBS som kjøretøy, eller 200 ul PBS alene ble injisert i mus av de fire gruppene via halevenen. Injeksjonene ble utført to ganger i uken i totalt 8 ganger. Volumet av tumorene ble målt i to vinkelrette retninger med en skyvelære, og vekten av nakne mus ble beregnet ut hver tredje dag. Volumet ble målt ved anvendelse av følgende formel: V = 0,5 x (W
2 x L), hvor V = tumorvolum, W = den minste vinkelrette diameter og L = den største vinkelrette diameter. På dag 30 ble musene avlivet, tumorene ble oppsamlet og veiet. Den tumorvekstinhibitering forholdet (TGIR) ble beregnet ved anvendelse av formelen TGIR = (W – W
t) /W x 100%, hvor W er den gjennomsnittlige tumorvekt av kontrollgruppen og W
t er den gjennomsnittlige tumorvekt av behandlingsgruppen. Alle tumorer ble kuttet i to deler henholdsvis, og ble behandlet som følger beskrivelsen.
Immunohistokjemisk farging
Den ene halvdelen av hver tumor høstes ved slutten av behandlingen studien ble fiksert i 10% nøytral- bufret formalin, deretter innstøpt i parafin, og kuttet i 3-5μm deler [26]. Forsøkene ble utført med en streptavidin-peroksidase-systemet (SP) i henhold til produsentens protokoll (ZSGB-BIO, Beijing, Kina). Prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) ble oppdaget med en anti-PCNA antistoff (Abcam, Beverly, MA, USA). Imaging ble utført ved fluorescens mikroskopi (DS-Ri1, Nikon, Japan). For å bestemme IOD indeks over PCNA ble fem representative visuelle områder som var positive for PCNA undersøkt fra hver svulst. Den PCNA indeks for hver valgte området ble analysert ved hjelp av IPP-programvare.
TUNEL analysen
parafinsnitt ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Den apoptotiske celler ble detektert ved anvendelse av en TdT-mediert dUTP nick ende merking (TUNEL) Sett i henhold til produsentens protokoll (Roche, Mannheim, Tyskland). Antallet TUNEL-positive celler ble tellet i fem tilfeldig valgte felt fra hver tumor, og den apoptotiske indeksen for hvert felt ble beregnet som prosentandelen av TUNEL-positive celler i forhold til 100 tilfeldig valgte celler.
Western blot analyse
Den andre halvparten av hver svulst var snap-frosset i flytende nitrogen. Deretter ble det totale protein ekstrahert. PCNA ble påvist ved normal Western blotting med den samme anti-PCNA-antistoff som ble brukt i den immunhistokjemi eksperimentet. IRDye 800CW geit-anti-kanin IgG (H + L) antistoff (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) ble brukt som det sekundære antistoff. β-actin ble også detektert som en intern kontroll. Bilder ble oppnådd ved Odyssey (LI-COR, USA) og intensitet quantifications av Western blot band ble utført av ImageJ programvare (National Institutes of Health, USA).
Statistisk analyse
SPSS versjon 16,0 for Windows ble brukt for alle analyser. Kvantitative data er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD); en sammenligning mellom to grupper ble utført ved uavhengig-prøve t-test, mens flere prøver ble sammenlignet med en-veis ANOVA, med α = 0,05 som et nivå for testen. Resultatene ble ansett som statistisk signifikant ved P 0,05.
Resultater
Uttrykk for NRP-en, ανβ3 og ανβ5 i menneske NSCLC-avledet cellelinje A549
uttrykk for inte er i stor grad begrenset til svulster (inkludert svulsten blodkar og celler), og andre steder av angiogenese eller vev reparasjon [22, 27]. Neuropilin-1 er også overuttrykt i mange tumorer [22, 28]. Den tumor-gjennomtrengende evne til iRGD avhenger i hovedsak av molekylene ανβ3, ανβ5 og NRP-1 overuttrykt i kreftceller [18]. For å bekrefte ekspresjonen av disse molekylene i den humane NSCLC-cellelinje A549, utførte vi en strømningscytometrisk analyse. Som vist i figur 1A, er den positive uttrykk ratene αvβ3, αvβ5 og NRP-1 var 68,5%, 35,3% og 94,5%, respektivt. Dette resultat viste at A549-cellelinjen kan brukes til å etablere en human NSCLC modell for å studere effekten av ko-administrering iRGD.
(A) Ekspresjon analyse av αvβ3, αvβ5 og NRP-1 i A549-celler etter flowcytometri. (B) Expression analyse av αvβ3, αvβ5 og NRP-en i A549 xenografter ved immunfluorescens farging. EG, eksperimentell gruppe; CG, kontrollgruppe. Både αvβ3 og αvβ5 er farget grønt. NRP-en er farget rødt. Kjerner er farget blå. Forstørrelse, × 400; Skala barer = 50 mikrometer.
For å bekrefte uttrykk for ανβ3, ανβ5 og NRP-en i svulstvev, har vi utviklet et BALB /c naken mus xenograft modell med den menneskelige NSCLC cellelinje A549. Ekspresjonen av αvβ3, αvβ5, og NRP-en ble ytterligere påvist ved immunfluorescens farging. Som vist i figur 1B, αvβ3 (til venstre), αvβ5 (i midten) og NRP-en (til høyre) ble overuttrykt i xenograft vev.
Tumor-penetrering av Evans blå administrert samtidig med iRGD
for å bekrefte at in vivo effekten av tumor-gjennomtrengende peptid iRGD, ble Evans blå fargestoff som brukes som en modell medikament for å bestemme hvorvidt iRGD kan fremme opptak av et medikament inn i en svulst [18]. Evans Blue-er et albumin-bindende fargestoff som kan trenge inn i organene via blodet og fargestoff organene blå. Sammenlignet med kontrollene, ble svulster i Evans blå + iRGD gruppe farget en dypere blå, som var synlig for det blotte øye. Imidlertid, den blå fargen av de normale organer, inkludert hjerte, lever, milt, lunge og nyre, var ikke åpenbar (figur 2A og 2B). For ytterligere å bekrefte at effekten av iRGD til spesifikt å fremme opptaket av Evans blå fargestoff inn i tumorvevet, ble Evans blå i tumorer og organer ble ekstrahert og analysert kvantitativt ved hjelp av spektrofotometri. Resultatene viste at, generelt, mengden av Evans blå i den Evans Blue-gruppen og i Evans blå + iRGD gruppe var høyere enn i PBS eller iRGD gruppe (figur 2C). Mengden av Evans blå i svulstene fra Evans blå + iRGD gruppe var 1,5 ganger høyere enn i den Evans Blue-gruppen (figur 2C). Med hensyn til andre organer, ble det observert ingen tydelig forskjell mellom de Evans Blue-gruppen og Evans blå + iRGD gruppe (figur 2C). Disse data viste at iRGD har potensial til å spesifikt fremme opptaket av narkotika og tillate dem å trenge inn i tumoren.
(A) De representative bilder av Evans Blue-opphopning i normale organer og i tumorer i mus som ble gitt forskjellige behandlinger. Den blå intensitet betegner mengden av akkumulert Evans blå. (B) Bilder av svulsten i (A). (C) Kvantifisering av Evans Blue-utvunnet fra tumorer og organer i (A) ved OD600 måling. n = 3; Feilfelt, gjennomsnitt ± SEM; ***
p
0,001.
Terapeutisk effekt av gemcitabin administreres samtidig med iRGD
For å bestemme passende konsentrasjon av Gemcitabine for in vivo-forsøk, fire doser med gemcitabin (80 mg /kg, 100 mg /kg, 120 mg /kg og 140 mg /kg) ble anvendt for å behandle fire grupper mus to ganger i en uke i to uker, respektivt. To uker senere, på mus av 80 mg /kg og 100 mg /kg gruppen som normal. Men det var tydelig at musene på 120 mg /kg gruppen manglet energi og opplevd et tap av matlyst. I tillegg musene på 140 mg /kg gruppen hadde diaré. For å redusere virkningen av bivirkningene, valgte vi dose på 100 mg /kg for in vivo eksperimenter.
For å finne ut om den terapeutiske effekten av gemcitabin vil bli styrket når gitt i kombinasjon med iRGD, gemcitabin og iRGD ble ko-administreres for å behandle mus med A549-xenografter som beskrevet i metodedelen. Som vist i figur 3A, tumorer av gemcitabin + iRGD gruppen vokste saktere enn de av gemcitabin-gruppen, og denne forskjellen var statistisk signifikant. Denne observasjonen ble også bekreftet ved en analyse av tumorvekt (figur 3B). Veksttakten hemming av svulstene ble videre analysert. Den iRGD gruppe, gemcitabin-gruppen, og gemcitabin + iRGD gruppen viste en tumorvekstinhibitering sats på 8%, 59,8% og 86,9%, henholdsvis. Resultatene viste at iRGD kunne forbedre den terapeutiske effekten av gemcitabin for menneske NSCLC xenografter når de ble administrert samtidig. Kroppsvekt skift analyse av de eksperimentelle mus viste at kroppsvekten til musene i både Gemcitabin gruppen og gemcitabin + iRGD gruppe ble redusert ca. 5% ved slutten av forsøket. Imidlertid ble det observert noen signifikant forskjell mellom disse to gruppene (figur 3C). Disse resultatene viste at iRGD ikke åpenbart forverre bivirkninger av gemcitabin.
(A) tumorvolum kurve under behandlingen. Pilene viser injeksjonstidspunktet. Dagen når behandlingen startet ble registrert som 0. dag Tumorvolumet ble målt en gang hver tredje dag inntil dag 30. (b) Gjennomsnittlig tumorvekt for hver gruppe ved slutten av behandlingen. (C) Den kroppsvekt skift kurve av musene i løpet av forsøket. n = 6. Feilfelt, gjennomsnitt ± SD; ns, ikke signifikant; ***
p
0.001.
Inhibering av celleproliferasjon etter behandling med samtidig administrert Gemcitabin og iRGD
Gemcitabin utøver en terapeutisk effekt mot kreft via inhibering av DNA-syntese i kreftceller og avbrytelse av deres fremgang fra G1 til S-fasen [3, 29, 30]. PCNA, et 36-kDa-proteinet, er hovedsakelig uttrykt i S-fasen og G2 tidlig fase av cellesyklusen i prolifererende celler [31]. Derfor kan PCNA brukes som en markør for celleformering. For å bekrefte funksjonen av iRGD i forbedring av anti-tumoreffekten til gemcitabin ytterligere, ble ekspresjonsnivået av PCNA i tumorene påvist ved immunhistokjemisk farging. Som vist i figur 4A, ble ekspresjonsnivået av PCNA betydelig redusert hos mus som ble behandlet med gemcitabin (med eller uten iRGD) sammenliknet med ekspresjonsnivået i mus som fikk PBS eller iRGD; ekspresjonsnivået av PCNA var lavere i de mus som ble behandlet med gemcitabin + iRGD sammenlignet med mus som ble behandlet med Gemcitabin alene. For kvantitativ analyse av figur 4A, ble ekspresjonsnivået av PCNA i gemcitabin + iRGD gruppen reduseres med ca. 71,5% sammenlignet med det i det Gemcitabin gruppe, og denne forskjellen var statistisk signifikant (figur 4B). I tillegg tumorvevet av gemcitabin + iRGD gruppen viste strukturelle avvik i kreft reir og morfologiske endringer i de fleste kjerner. De morfologiske endringer i kjernene vil bli beskrevet i detalj senere i manuskriptet.
(A) immunhistokjemisk farging analyse. PCNA-positive celler i seksjonene er farget brun. Kjernen er farget blå. Representative tall fra hver gruppe vises; n = 6; Forstørrelse, × 400; Skala barer = 50 mikrometer. (B) Den tilsvarende kvantitative analyseresultatene av PCNA er vist i (A). Fem felter fra hver tumorvev seksjon ble tilfeldig valgt for beregning av IOD verdien til den positive regionen gjennom IPP programvare, hvilket indikerte mengden av antigen ekspresjon. (C) Western blot-analyse. Total protein fra tumorvev ble ekstrahert. PCNA ble påvist med β-aktin som en intern kontroll. n = 3. (D) De kvantitative analyseresultatene av PCNA er vist i (D). Intensiteten av hver strimmel ble analysert ved ImageJ programvare. De gjennomsnittlige intensitet av PCNA ble standardisert til p-aktin. Feilfelt, gjennomsnitt ± SD; ns, ikke signifikant; ***
p
. 0,001
For ytterligere å bekrefte uttrykket nivået av PCNA, vi hentet den totale protein fra tumorvev i hver gruppe. Nivåene av PCNA ble påvist ved Western blotting med β-aktin som en intern kontroll. Hver strimmel ble skannet, og en kvantitativ analyse ble utført med ImageJ programvare. Ekspresjonsnivået av PCNA i tumorvev hos mus i gemcitabin + iRGD gruppe ble signifikant redusert sammenlignet med den for mus i Gemcitabin-gruppen (fig 4C og 4D).
Til sammen viser disse resultater ytterligere bekreftet at terapeutisk effekt av gemcitabin ble forsterket da det ble gitt samtidig med tumor-trengende peptid iRGD.
Induksjon av apoptose ved samtidig administrering gemcitabin og iRGD
det er vist at gemcitabin kan hemme DNA replikasjon og reparasjon, noe som til slutt fører til celle apoptose [3]. For å bekrefte den forbedrede terapeutiske effekten av samtidig administrert gemcitabin og iRGD ble apoptotiske celler i behandlede xenotransplantater oppdages ved hjelp av en TUNEL analysen. Som vist i figur 5A, mer apoptotiske celler var synlige i tumorer fra gemcitabin + iRGD gruppe enn i tumorer fra Gemcitabin-gruppen. Den apoptotiske indeksen ble definert som den prosentandel av TUNEL-positive celler versus totale antall celler. I henhold til den statistiske analysen er vist i figur 5B, frekvensen av apoptose av gemcitabin + iRGD gruppe var 2,2 ganger det til de gemcitabin-gruppen. Disse resultatene bekreftet videre at iRGD forsterkes den terapeutiske effekt av gemcitabin i NSCLC-xenotransplantater.
(A) apoptotiske celler i tumorvev ble påvist ved en TUNEL assay. TUNEL-positive kjerner er farget brun, og TUNEL-negative kjerner er farget blå. Tallene som vises her er representative for de seks svulster i hver gruppe. Pilene viser apoptotiske legemer. Forstørrelse, × 400; Skala barer = 50 mikrometer. (B) Kvantitativ analyse av apoptose indeks i hver gruppe. Prosentandelen av TUNEL-positive celler ble talt fra 100 tilfeldig utvalgte kreftceller per seksjon. Fem seksjoner ble telt per svulst. n = 6; Feilfelt, gjennomsnitt ± SD; ***
p
0,001.
Diskusjoner
Denne studien hadde som mål å re-evaluere bruken av iRGD peptid, viste at det forbedret akkumulering og terapeutisk effekt av legemidler i NSCLC xenograft etablert med A549 celle linje som viste høy ekspresjon av αvβ3, αvβ5 og NRP-1. Våre data viser at iRGD var i stand til å betydelig øke tumor-penetrering av Evans blå, så vel som den terapeutiske effekt av gemcitabin i det humane NSCLC xenograft. Den videre evaluering viste at spredning og apoptose av tumorceller i iRGD + gemcitabin-gruppen var mer betydelig hemmet enn i kontrollgruppene.
I 2009 Teesalu etal. først rapportert i C-enden regel peptid (iRGD), og viste at peptidet besitter aktiviteten til NRP-1-avhengig celle, vaskulær, og vevspenetrasjon [32]. Påfølgende rapporter viste at iRGD kunne forbedre intratumoral formidling og antitumor effekt av doxorubicin [33-35], Paclitaxel [36, 37] og endostatin [38] ved konjugering med disse medikamenter eller narkotika belastede biler i dyreforsøk. De andre rapportene viste at iRGD også kunne styrke intratumoral akkumulering og antitumor effekt av Paclitaxel, doxorubicin, Transtuzumab [24, 39], Cisplatin [40] ved samtidig bruk av disse legemidlene. I 2014 Akashi etal. rapportert at gemcitabin ble coadministrated med iRGD å behandle kreft i bukspyttkjertelen i murine modeller [41]. Så vidt vi vet, denne studien først vist effekt av co-administrert iRGD og gemcitabin i menneske NSCLC xenograft etablert med A549 cellelinje.
Akashi rapport viste at kreft i bukspyttkjertelen modeller over-uttrykker NRP-en er følsomme for iRGD samtidig administrasjon. Behandling med gemcitabin pluss iRGD peptid resulterte i en betydelig tumor reduksjon sammenlignet med Gemcitabine monoterapi i bukspyttkjertelkreft modeller etablert med cellelinjer [41]. Våre resultater viste at ανβ3, ανβ5 og NRP-1, som medierer den tumor-penetrasjon aktivitet av iRGD, ble overuttrykt i human NSCLC cellelinje A549 og xenograft etablert med denne cellelinjen. Den terapeutiske effekten av gemcitabin ble betydelig forbedret ved samtidig administrering iRGD i murine NSCLC kreft modell. Sammen utgjør disse studiene bekreftet effekten av iRGD å forbedre intratumoral formidling og kreft effekt i NRP-en-overuttrykt kreft modeller.
gemcitabin er en nukleosidanalog mye brukt som førstelinjebehandling av avansert NSCLC [42 ]. Gridelli etal. rapportert at svarprosenten (RR) blant 233 pasienter fikk gemcitabin var 16%, mens median tid til progresjon og total overlevelse (OS) var 17 uker og 28 uker, henholdsvis [43]. Den MILES-2G fase 2-studie av mono Gemcitabin i avanserte NSCLC eldre pasienter viste 17,6% RR, en median tid til sykdomsprogresjon på 16,1 uker og median OS på 41,3 uker [44]. Flere andre studier som benytter gemcitabin alene viste samme aktivitet med RR og median PFS og OS alt 16 til 38,5%, 3-5.4 og 6.6-7.7 måneder, henholdsvis [45-48]. Derfor er den terapeutiske effekt av gemcitabin for NSCLC har plass til å bli ytterligere forbedret. Våre resultater viste at iRGD peptid forsterker effekten av samtidig administrert gemcitabin i NSCLC xenograft. Disse resultatene demonstrerte muligheten for at iRGD forbedrer effekten av gemcitabin i NSCLC.
, selv om effekten av iRGD er bare vesentlig i anvendelse av cellelinjen. Den kliniske programmet trenger å bli gitt nøye overveielse. Den nåværende forståelse av mekanismen som iRGD forbedrer den terapeutiske effekten av gemcitabin for NSCLC er begrenset. Selv om ingen åpenbare bivirkninger ble observert i vår studie, sikkerhet for denne kombinasjonsbehandlingen fortsatt behov for videre evaluering. Den CendR motivet av iRGD kan også brukes av virus og mikrobielle toksiner, for å få adgang inn i celler og spres i vev i kroppen [49, 50]. iRGD kan også fremme opptaket av gemcitabin i normalt vev som er skadet, og reparere vevet som følger kan forårsake ytterligere skader på kroppen.
Konklusjon
I sammendraget, gjennom en human NSCLC A549 naken mus xenograft modell, ble det bekreftet at iRGD kan fremme inhibering av tumorcellevekst og induksjon av apoptose av gemcitabin, og dermed forsterke den terapeutiske effekt av gemcitabin in vivo. Samtidig administrasjon av gemcitabin og iRGD kan være en roman strategi for å forbedre ende klinisk effekt av gemcitabin hos NSCLC pasienter.
