Abstract
Bakgrunn
ID2 er medlem av en underklasse av transkripsjon regulatorer som tilhører den generelle bHLH (basic-helix-loop-helix) familie av transkripsjonsfaktorer. I normale celler, er ID2 ansvarlig for å regulere balansen mellom proliferasjon og differensiering. Nyere studier har vist at ID2 er involvert i tumorprogresjon i flere krefttyper som prostata eller bryst.
metodikk /hovedfunnene
I dette arbeidet har vi undersøkt, for første gang, forholdet mellom uttrykket av ID2 i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter og clinicopathological funksjoner og prognose for disse pasientene. Immunhistokjemi ble utført på microarray, som inkluderte 62 NSCLC tumorer. I maligne vev, har ID2 ekspresjon blitt påvist i begge de nukleære og cytoplasmiske kamre, men vi har vist at bare atom ekspresjon av ID2 er inverst korrelert med differensierings karakteren av tumoren (p = 0,007). Interessant, blant pasienter med dårlig differensierte tumorer, høy atom ekspresjon av ID2 var et uavhengig og ugunstig prognostisk faktor for overlevelse (p = 0,036).
Konklusjoner
Disse resultater antyder at ID2 kan være involvert i tumor dedifferentiation prosesser av NSCLC, og kan brukes som prognostisk markør for pasienter med dårlig differensierte svulster
Citation. Rollin J, Bléchet C, Regina S, Tenenhaus A, Guyétant S, Gidrol X (2009) intracellulær lokalisering av ID2 Expression Har en prediktiv verdi i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 4 (1): e4158. doi: 10,1371 /journal.pone.0004158
Redaktør: Axel Imhof, Universitetet i München og Center of Integrated Protein Science, Tyskland
mottatt: 08.07.2008; Godkjent: 04.12.2008; Publisert: 08.01.2009
Copyright: © 2009 Rollin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ID2 (hemmer av DNA-binding 2) tilhører en underklasse av proteiner, ID-familien, som finnes i den store bHLH (basic-helix-loop-helix) gruppe av transkripsjonsfaktorer. Interessant, da de ikke har den grunnleggende domene, ID proteiner ikke direkte bindes til DNA og, i stedet virke som dominant negative antagonister av klasse A bHLH transkripsjonsfaktorer. Blant de kjente målene for ID-proteiner er E protein og medlemmer av Ets familien [1]. ID proteiner er involvert i vev utvikling [2], [3], og har blitt beskrevet som inhibitorer av differensiering i en rekke celletyper, inkludert myeloide celler [4], B-lymfocytter [5], og muskelceller [6]. ID2 uttrykk er generelt lav i normale vev, og er oppregulert i tumorer. Høye nivåer av uttrykk har blitt observert i maligne lidelser som neuroblastom [7], [8], tykktarms adenokarsinom [9], Ewing sarkom [10], prostata kreft [11], og bukspyttkjertelkreft [12]. Til sammen disse resultatene tyder på at ID2 kan spille en viktig rolle i startfasen og progresjon.
Til dags dato er det bare en eneste studie som evaluerer rolle ID2 i lungekreft, spesielt i småcellet lungekreft (SCLC ) [1. 3]. Lungekreft er en ledende årsak til dødsfall fra kreft på verdensbasis. Den mest vanlige histologiske type som påvirker ca 80% av pasientene er ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), i motsetning til småcellet lungekreft. Den samlede fem års overlevelse av NSCLC er ca 15% [14]. Når en diagnose er etablert, er behandlingstilbud vanligvis basert på scenen og histologi [15], selv om dette lagdeling ordningen ikke konsekvent reflektere biologi svulst. Som et resultat, vil over 50% av pasienter med tidlig stadium lungekreft slutt dø, mens andre på en mer avansert stadium vil overleve [14], [16], ligger til grunn for behovet for ytterligere prognostiske markører for å bedre forutsi utfallet av sykdom [17].
i denne artikkelen har vi evaluert uttrykk for ID2 ved immunhistokjemi på NSCLC microarray som inneholder 62 svulster. Vi så nærmere undersøkt forholdet mellom ID2 uttrykk og clinicopathologic parametere for å vurdere dens mulige rolle som prognostisk markør for NSCLC.
Resultater
ID2 Expression i normal lunge og i NSCLC Vev
Farging for ID2 ble utført på en svulst microarray (TMA) som inneholder 62 NSCLC prøver fra menneskelige pasienter. De kliniske og histologiske trekk ved pasienter som er beskrevet i tabell 1. I ikke-kreftceller lungevev, svak til moderat ID2 ekspresjon ble påvist i bronkiale epitelceller både i cytoplasma og kjerner. I tillegg ble svak ID2 farging observert i cytoplasma av endoteliale celler (figur 1A-D)
A-B:. ID2 farging av epitel og endotel-celler i ikke-kreft lunge. C-F: Representative uttrykk på TMA med sterk ID2 farging i kjernen og med moderat (C, D) eller svake (E, F), cytoplasmatisk farge. C, D er dårlig differensierte adenokarsinomer og E, F et dårlig differensiert stor celle karsinom. G-H: Tumor med fravær av kjernefysiske farging med moderat (G, H) cytoplasma uttrykk for ID2. G, H er moderat differensiert plateepitelkarsinom.
ID2 uttrykk i tumorceller fra de 62 NSCLC var svært variert både når det gjelder intensitet og lokalisering (figur 1). Ut av 62 NSCLC pasienter, en stor andel (98%, 61/62) uttrykte ID2 protein nesten utelukkende i tumorceller (median på global flekker poengsum = 3; 0 til 18). Nuclear immunreaktivitet var positiv i 33 (53,3%) av NSCLC-prøver (median av nukleært farging poengsum = 1; 0 til 11), og cytoplasmatisk ID2 ble påvist i 57 (92%) av 62 tumorer (median av cytoplasmatisk farge stillingen = 2; 0 til 8). Mange dårlig differensierte svulster viste sterk ID2 farging i kjernen i forbindelse med svak eller moderat cytoplasma farging (figur 1E-J). I motsetning til dette ble ID2 ikke uttrykt i kjernen av delvis eller godt differensierte tumorer, mens svak til moderat ekspresjon ble observert i cytoplasma (figur 1K-P).
Association of ID2 Expression med Clinicopathological Parametere
midtlinje av fargings poengsum for hver atom, cytoplasma, eller global ekspresjon av ID2, som beskrevet ovenfor, ble brukt som en avskåret for å klassifisere pasienter inn i to grupper: «lav» (dvs. lav ID2 uttrykk) og «høy» (dvs. høy ID2 uttrykk). Multiple komponentanalyse (MCA) ble utført på data samlet inn fra de 62 pasientene og grafisk representasjon er presentert i figur 2A. I korte trekk er variable nabolag på grafen kan være forbundet sammen. MCA viste at lav kjernefysisk uttrykk for ID2 ble assosiert med godt differensierte svulster og spredning til lymfeknuter. I kontrast, ble høyt uttrykk for ID2 i kjernen sett oftere i svulster som var dårlig differensiert og hadde avansert lokal invasjon (T3-T4 status). I forbindelse med MCA, ble Demod analyse utført og viser en signifikant sammenheng mellom kjernekraft uttrykk for ID2 og histologisk differensiering av NSCLC (figur 2B). Våre resultater viste 15 av 17 (88%) godt differensierte svulster viste lave nivåer av ID2. I tillegg dårlig differensierte svulster hadde sterke kjerne uttrykk for ID2 (p = 0,007) i 12 av 19 (63%) tilfeller. Men ingen signifikant sammenheng ble funnet mellom ID2 uttrykk og spredning til lymfeknuter eller T status, muligens på grunn av den ujevne fordelingen av T status mellom grupper (52 og 10 pasienter i T1-T2 og T3-T4, henholdsvis). Cytoplasmatisk ekspresjon av ID2 var ikke assosiert med differensiering karakteren av NSCLC, men ble overraskende koblet til den histologiske type tumorer. Tumor uttrykk for ID2 var høy i 22 av 33 (67%) tilfeller av adenokarsinom i forhold til 5 av 19 (26%) tilfeller av plateepitelkarsinom (p = 0,016) (figur 2B).
En : Nuclear, cytoplasmatisk, og global ekspresjon av ID2 innenfor NSCLC-tumorer er blitt anvendt som aktive variabler og er representert ved kvadrater og fet sirkel. Clinicopathological funksjoner (dvs. differensiering, histologisk type sjanger, røykestatus, scene, og TNM-klassifikasjon) har vært brukt som illustrasjons variabler og er representert ved åpen pastill. Alle variabler ble plassert i henhold til den tyngdepunkt av alle pasienter som hører til den viste kategori. Kliniske parametre potensielt assosiert med ID2 uttrykk er understreket og kursiv. B: Demod analyse ble utført for å identifisere statistiske sammenhenger mellom ID2 uttrykk og clinicopathological funksjoner. Kun parametere identifisert med MCA er presentert i tabellen (dvs. histologisk type T status, status spredning til lymfeknuter, og differensiering av tumor).
Univariat og multivariat Survival Analysis
for å finne ut om farging av ID2 hadde en prognostisk verdi, undersøkte vi sammenhengen mellom global, kjernekraft, og cytoplasma uttrykk for ID2 med total overlevelse av pasienter. Først må vi analysert konvensjonelle clinicopathological parametere. Vi har observert en betydelig innvirkning av tumorstadium (p = 0,0001) og tumorstørrelse (p = 0,014) på pasienten total overlevelse (figurene 3A-C), mens lymfeknutestatus (N0 vs. N +) var på grensen til signifikant (p = 0.06) . Histologisk differensiering var ikke et prognostisk markør i vår kohort av NSCLC (p = 0,48; data ikke vist). Likeledes kan vi ikke observere en signifikant forskjell i total overlevelse mellom pasienter med høyt uttrykk nivåer av ID2 og de stiller lave nivåer av ID2 (Figur 3D-E). Imidlertid, etter lagdeling av data i henhold til histologisk differensiering (figur 3G-I), dårlig differensierte NSCLC pasienter med høyt atom ekspresjon viste en kortere total overlevelse enn pasienter med lav ID2 atom uttrykket (median overlevelse = 24 vs. 41 måneder, respektivt ; p = 0,036; figur 3G). I tillegg multivariat analyse ved hjelp av Cox regresjonsmodellen viste at atom ID2 ekspresjon hos pasienter med dårlig differensierte tumorer var et uavhengig prognostisk faktor på total overlevelse (p = 0,034; RR = 13,7; IC 95% = 1,2 til 161, tabell 2). Ingen prognostisk verdi av ID2 atom ekspresjon ble observert i moderate eller godt differensierte tumorer (data ikke vist)
A-F.: Kaplan-Meier-kurver etableres for alle NSCLC (n = 59) i henhold til sykdomsstadiet (A), lymfeknutestatus (B), T-status (C), kjerne (D), cytoplasmatisk (E), og global ekspresjon av ID2 (F). G-I: Kaplan-Meier-kurver ble oppnådd for pasienter med dårlig differensierte tumorer (n = 18) i henhold til nukleær (G), cytoplasmatisk (H), og global (I) ekspresjon av ID2. Kurver ble sammenlignet med log-rank test.
Diskusjoner
Rollen ID2 har blitt studert i flere typer kreft (dvs. prostata, bryst, colorectal, neuroblastom , og ganske nylig småcellet lungekreft), men til dags dato, ingenting er kjent om uttrykk for ID2 i ikke-småcellet lungekreft, som rammer 80% av pasienter med lunge maligniteter. Her har vi fokusert på uttrykk for ID2 i NSCLC og sitt forhold til clinicopathological parametre og prognose av sykdommen. Uttrykk for ID2 ble evaluert i 62 NSCLC svulster ved immunhistokjemi hjelp microarray. Mens de fleste pasientene som ble analysert i denne studien uttrykt ID2, pasientgruppen var meget heterogen med hensyn til både ekspresjonsnivået og intracellulær lokalisering. Vi har imidlertid vist at høy ID2 ekspresjon i kjerner synes å være korrelert med dårlig differensiering av tumoren. Denne observasjonen er i god overensstemmelse med kjente egenskaper av ID2, siden proteinet har blitt karakterisert som en inhibitor av differensiering i en rekke vev, inkludert epidermis og muskler [18], [19]. Således hemmer ID2 muskulær differensiering ved direkte interaksjon med myod, et bHLH transkripsjonsfaktor som kreves for myoblastic differensiering [20]. Videre, i prostata carcinoma, ble sterk ID2 uttrykk forbundet med dårlig differensierte graderinger av tumor, noe som tyder på at ID2 kan også være involvert i reguleringen av tumor dedifferentiation [11], [21]. Våre data viser at et høyt atom ekspresjonsnivå av ID2 var et uavhengig og negativ prognostisk markør for overlevelse hos pasienter med dårlig differensierte lungesvulster. Dermed pasienter med svulster som stiller høye atom uttrykk for ID2 har 13,7 ganger høyere risiko for å dø enn pasienter med lav uttrykk for ID2. Den prognostiske verdi av høy ID2 ekspresjon er allerede blitt demonstrert i andre krefttyper som neuroblastom og prostatakreft [7], [11], [21], [22], [23]. Imidlertid har tidligere studier på brystkreft og SCLC rapportert at høy cytoplasmisk ekspresjon av ID2 var assosiert med en god prognose, mens ingen korrelasjon ble funnet mellom kjerne ekspresjon av ID2 og overlevelse av pasienter [13], [22]. Kamalian
et al.
Antydet at i SCLC økt uttrykk av ID2 i cytoplasma kan være på grunn av sin eksport fra kjerner og kan redusere pro-tumoreffekten av ID2. Disse resultatene var globalt i overensstemmelse med vår studie, som vi demonstrert en direkte sammenheng mellom kjerne ekspresjon av ID2 og overlevelse av pasienter. Imidlertid kan forskjeller med hensyn ID2 lokalisering stammer delvis fra forskjellene mellom de to patologi, men også forskjeller i spesifisiteten til antistoffene. Faktisk har vi brukt Zymed antistoffer som anbefalt av Perk
et al.
, Som advarte mot bruk av dårlig spesifikke ID2 antistoffer [24]. Alt i alt har våre data tyder på at både ID2 ekspresjon og intracellulær lokalisering må vurderes for å bestemme prognosen til cancerpasienter, inkludert de med lungekreft. Den intracellulære lokalisering av ID2 kan spille en viktig rolle i kontrollen av ID2 funksjon og celle skjebne regulering. Kurooka
mfl.
Bestemt at Nucleo-cytoplasma skyt av ID2 er en aktiv mekanisme avhengig av CRM-1 protein, og er omvendt korrelert til transcriptional undertrykkelse via E-box sekvens [25]. I tillegg Lasorella og Iavarone demonstrerte at interaksjonen mellom ID2 og aktin-assosierte protein enigma homolog (ENH) styrer også lokalisering av ID2 [26]. Faktisk, nedregulering av ENH uttrykk hindrer relocalization av ID2 inn i cytoplasma i differensierte neuroblastom celler. Dette resultatet gjør at vi kan spekulere på mulige innblanding av ENH eller CRM-1 protein i dedifferentiation mekanismen av NSCLC. Våre resultater tyder på at atom ID2 er sannsynlig å være en prognostisk faktor i NSCLC og ENH-mediert translokasjon av ID2 til cytoplasma kan forklare mangelen på prognostisk verdi for cytoplasmisk ID2. Men rollen som ID2 compartmentalization i lungetumorprogresjon, men potensielt interessant, vil kreve ytterligere evaluering.
Den mekanismen som ID2 fremmer lungetumorprogresjon er ikke klart ennå. Men resultatene som ble oppnådd i andre modeller tyder på at virkningen av ID2 kan avhenge inhibering av Rb-tumor suppressor pathway [3], [27]. I tillegg har det blitt demonstrert at ID2 regulerer også angiogenese og apoptose via transkripsjonen regulering av den
VEGF
og
BCL2
gener, henholdsvis [28], [29]. Men virkningen av ID2 kan også være vevsspesifikke: i brystkreftcellelinjer, høy ekspresjon av ID2 redusert vekstpotensial og invasivitet, mens oppregulering av ID2 øket proliferasjon og invasive potensial i prostata tumorceller [11], [22], [23].
til slutt, selv om våre resultater er foreløpige, foreslår de at ID2 kan være involvert i tumor dedifferentiation prosesser av NSCLC, og kan brukes som prognose markør for pasienter med dårlig differensierte svulster. Interessant, i NSCLC, dårlig differensierte karsinomer er vanskelig å klassifisere, og som sådan, kan identifisering av nye prognostiske beslutningstakere for denne spesielle gruppen bidra til å forbedre den terapeutiske utfallet av pasientene.
Materialer og Metoder
tumorprøver
Vi har analysert vevsprøver samlet i en potensiell gruppe av 62 pasienter med NSCLC, som hadde gjennomgått fullstendig kirurgisk reseksjon av lunge svulst som en innledende behandling (dvs. uten forutgående strålebehandling eller cellegift) mellom januar 2002 og august 2004 ved Thoracic Surgery Institutt for Trousseau Hospital (Tours, Frankrike). Kirurgiske prøver ble fiksert i 10% formalin og parafin innebygd for rutinemessig histologisk undersøkelse og immunhistokjemi. Histologiske typer, differensiering, TNM klassifisering, og scene gruppering (oppsummert i tabell I) ble bestemt i henhold til Verdens helseorganisasjon (WHO) kriterier for lungesvulster [30]. Skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasientene i denne studien som anbefalt av fransk lovgivning.
Tissue microarray Produksjon og Immunohistochemistry
For vevet microarray (TMA) produksjon, representative områder av NSCLC prøvene ble identifisert ved et kirurgisk patolog på hematoxylin-eosin (HE) farget lysbilder. For hver svulst, ble tre kjerne biopsier 1 mm i diameter deretter tatt fra utvalgte områder av giver blokker og kledd i en mottaker parafin blokk med en håndvevet arrayer (Beecher instrumenter, Sun Prairie, USA). Seksjoner (4 mikrometer tykke) av TMA blokker ble kuttet og immunhistokjemi ble utført ved hjelp av en kanin polyklonale spesifikt antistoff reist mot ID2 (ZMD.325, Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrike). Kort fortalt ble TMA delen deparaffinized, utvannet, og sendt til varme antigen gjenfinning i en etylentetraeddiksyrebuffer (MS-Unmasker, pH 7,8, Diapath) i 20 min. ID2 antistoff ble påført ved en 1/50 fortynning. Farging ble utført med Lab Vision Autostainer (Lab Vision, Fremont, USA) med en biotin-streptavidin-peroksidase deteksjonssystem med diaminobenzidin som et kromogen (ChemMate ™ Detection kit, DakoCytomation). Lysbilder ble hematoxylin kontra. Den TMA inneholdt kjerneprøver av normal bronchiolar slimhinner og lungevevet. Spesifisitet av ID2 antistoff var kontroll ved hjelp av renset ID2 protein som en negativ kontroll for å blokkere bindingen av ID2 antistoffer mot tumorceller (figur S1).
to uavhengige observatører (JR, CB) evaluert både lokalisering og intensiteten av ID2 farging. Denne evalueringen ble blindet for de kliniske data. Både kjernefysiske og cytoplasmatisk farge score til tumorceller ble etablert ved å multiplisere den fargeintensitet skalert fra 0 til 3 (null = 0, svak = 1, middels = 2, og kraftig = 3) av prosentandelen av positive celler (0 = 10%, 1 = 10-25%, 2 = 26-50%, 3 = 51-75%, 4 = 75%). Globalt uttrykk for ID2 i tumorceller ble oppnådd ved tilsetting av kjernefysiske og cytoplasmatiske flekker score.
Statistical Analysis
Multiple komponentanalyse (MCA) ble utført på data samlet inn fra 62 pasienter som bruker SPAD programvare . Denne metoden er en beskrivende multivariat analyse som tillater hurtig identifisering av statistiske relasjoner mellom variabler. Kort fortalt, de ulike kategoriene, dvs. ID2 uttrykk og clinicopathological funksjoner, ble plassert i flerdimensjonale plass. For å observere avstander mellom punkter, ble de projisert på et fly av to ortogonale faktorer,
F
en og
F
2. Disse «første» faktorer ble utvalgt for å være den mest representative for den globale variansen av dataene. Fordi plasseringen av kategorier av aktive variabler (nuclear, cytoplasma, og global uttrykk for ID2) og plasseringen av observasjoner (stadium, lymfeknute status, tumorstatus, histologiske typer, grad av differensiering, sjanger og røykestatus) regnes i på samme måte, kan de bli plassert på den samme grafen (målinger blir erstattet av gravitasjonssenter). Demod metode (SPAD programvare), ligner på chi-kvadrat test, ble også brukt til å utfylle MCA for å analysere sammenhengen mellom de aktive variabler (kjernekraft, cytoplasma, og global uttrykk for ID2) og illustrerende variabler (clinicopathological funksjoner).
Total overlevelse ble beregnet fra tidspunktet for histologi diagnose til datoen for død på grunn av enhver årsak. Den totale overlevelsesraten ble analysert i henhold til Kaplan-Meier-metoden, og forskjellene i overlevelse ble vurdert av log-rank test (MedCalc programvareversjon 7.3.0.1). Multivariat analyse av prognostiske faktorer ble utført ved hjelp av Cox proporsjonal risikomodell (MedCalc).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Immunhistokjemisk analyse av parafin-embedded human NSCLC hjelp kanin polyklonale antistoff mot ID2. IHC ble utført med antistoff alene (A og C) eller etter nøytralisering av antistoff ved preinkubering med 2 ug /ml av renset ID2 protein (ID2 rekombinant protein P01, Abnova, Taiwan), over natten ved 4 ° C, (B og D).
doi: 10.1371 /journal.pone.0004158.s001 product: (9.11 MB TIF)
Takk
Vi er takknemlige for A De Muret (Département d’Anatomie Pathologique, CHRU de Tours, Frankrike) og professor P Dumont (Département de Chirurgie Thoracique, CHRU de Tours, Frankrike) for å gi lunge prøver.
