Abstract
Spredningen av prostata kreft celler til mikromiljøet i benmargen og kastrering motstandsdyktig vekst er viktige skritt i sykdomsprogresjon og betydelige kilder til sykelighet. Imidlertid er den biologiske betydning av stamceller (MSC) og benmarg avledet ekstracellulære matriks (ECM-BM) i denne fremgangsmåten ikke fullt ut forstått. Vi har derfor etablert en
in vitro
konstruert beinmarg vev modell som inkorporerer hMSCs og BM-ECM til rette mekanistiske studier av prostatakreft celleoverlevelse i androgen-utarmet media i parakrint faktorer og BM-ECM. HMSC-avledet parakrine faktorer økte LNCaP celleoverlevelse, som var delvis tilskrives IGFR og IL6 signalering. I tillegg, BM-ECM økt LNCaP og MDA-PCa-2b celleoverlevelse i androgen-utarmet forhold, og indusert chemoresistance og morfologiske endringer i LNCaPs. For å bestemme virkningen av BM-ECM på cellesignalisering, ble fosforyleringen status av 46 kinaser undersøkt. En økning i fosforylering av MAPK sti-relaterte proteiner samt vedvarende Akt fosforylering er observert i BM-ECM kulturer sammenlignet med kulturer dyrket på plasmabehandles polystyren. Blokkering MEK1 /2 eller PI3K vei førte til en betydelig reduksjon i LNCaP overlevelse når de dyrkes på BM-ECM i androgen-utarmet betingelser. Den kliniske relevansen av disse observasjonene ble bestemt ved å analysere Erk fosforylering i menneskelig bein metastatisk prostatakreft versus ikke-metastatisk prostatakreft, og økt fosforylering ble sett i de metastatiske prøvene. Her beskriver vi en konstruert benmarg modell som etterligner mange funksjoner observert hos pasienter og gir en plattform for mekanistiske
in vitro
studier
Citation. Lescarbeau RM, SEIB FP, Prewitz M, Werner C Kaplan DL (2012) in vitro modell for metastaser til benmarg som megler Prostate Cancer Kastrering Resistant Vekst gjennom parakrint og ekstracellulære matriks faktorer. PLoS ONE 7 (8): e40372. doi: 10,1371 /journal.pone.0040372
Redaktør: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, USA
mottatt: 11 april 2012; Godkjent: 07.06.2012; Publisert: 01.08.2012
Copyright: © Lescarbeau et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health stipend P41 EB002520-05 (Tissue Engineering Resource Center) (DL Kaplan). FP SEIB er støttet av en Mildred Scheel postdoktorstipend fra den tyske Cancer Aid. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mikromiljøet i benmargen gir mange signaler som muliggjør overlevelse og spredning av prostata kreft celler. Det er nå vel etablert at særlig osteoblast utskilte faktorer aktiverer androgen uavhengig vekst av metastasized prostata kreftceller [1], [2]. I tillegg er benmarg-avledede ekstracellulære matriks (ECM-BM) er implisert i progresjonen av andre kreftformer, inkludert multippel myelom, via aktivering av trasé forbundet med overlevelse [3].
På grunn av den betydelige tropisme av prostatakreft for beinmarg, mange
in vivo
modeller har blitt utviklet for å studere dette samspillet. Disse inkluderer xenograft musemodeller hvor kreftcellene injiseres intratibially [4], humanisert musemodeller hvor menneskelig ben er lagt inn subkutant og deretter podet med prostatakreftceller, subkutan implantasjon av vev konstruert ben [5], og hule fibre inneholdende både prostatakreft og ben lignende celler [6]. Disse
in vivo
modeller, men er lav gjennomstrømning og potensielt lider xenogene interaksjoner. For å overvinne noen av disse begrensningene, og for å tillate bedre mekanistiske og høy gjennomstrømning screeningstudier, forskere bruker
in vitro
cellekultur modeller. Bare nylig har konvensjonell plasma behandlet polystyren (PTP) vev kultur ware blitt erstattet av kultur underlag som nærmere etterligner
in vivo
svulstens mikromiljø. Disse har inkludert modeller som studerer parakrine interaksjoner og nylig ECM interaksjoner [7], [8], [9]. Men ingen av disse studiene har brukt en konstruert beinmarg vev modell i kombinasjon med androgen utarmet media for å modellere kastrering resistent prostatakreft progresjon
in vitro.
vekst og overlevelse av prostatakreftceller i androgen utarmet forholdene har blitt tillagt en rekke mekanismer. Oppregulering av androgen reseptoren tillater økt følsomhet, mutasjoner som gir økt promiscuity til andre ligander, samt intracrine syntese av androgen av prostata kreft celler bidrar til androgen uavhengig vekst [10]. Andre metoder for androgen uavhengig vekst inkludere aktivering av mitogene veier og transkripsjonsfaktorer slik som MAPK, PI3K, STAT3, og β-catenin [11], [12]. Aktivering av disse banene gjør androgen uavhengig vekst eller celle overlevelse gjennom co-aktivering av androgen reseptoren.
Forrige
in vitro
studier antydet at enkelt ECM komponenter kan fungere som ligander for å indusere mitogen cellesignalisering og overlevelse. For eksempel, fibronektin, som er en komponent av BM-ECM, indusert fosforylering MEK gjennom FAK og Src [13]. Tilsvarende, integrin β1 og IGF-1R interaksjonene med fibronektin mediert chemoresistance i prostatacancercellelinje DU145 [14]. Disse studiene indikerer en mulig rolle for BM-ECM ligander aktive pathways forbundet med androgen uavhengig vekst og utvikling av sykdommen.
Co-kulturer av humane stamceller (hMSCs) og prostata kreft celler tillater parakrint signalering, induserer osteogenesis, og støtter prostatakreft overlevelse. For panelene A, B, C ble rå verdiene normalisert til den negative kontrollgruppen. (A) hMSCs ble behandlet med normal vekstmedier, LNCaP betinget media, PC3 betinget media, eller osteogene media 14 dager. De ble deretter farget med alizarin rød, som deretter ble ekstrahert og kvantifisert for å bestemme kalsiumavsetning. (B) QRT-PCR for de angitte transkripsjoner. Hver gruppe ble dyrket som beskrevet i (A), og deretter ekstrahert RNA. (C) Indirekte ko-kulturer av hMSCs med LNCaPs i androgen slettet media i nærvær av IGFR inhibitor AG1024, eller IL6-inhibitorer, AG490 og anti-IL6 mAb. Celler ble sådd ut i vekstmediet, fikk komme seg i 24 timer og deretter byttet til androgen utarmet medium pluss inhibitor. LNCaP levedyktighet ble målt etter 7 dager. (D) IL6 konsentrasjoner i kondisjonert kulturmedium. (E) IGF-1-konsentrasjonene i kondisjonert medium etter 48 timer fra hver celletype dyrket alene. (* P 0,05, ** P 0,01; *** P 0,001, n = 3, ± SEM).
Benmargs-avledet ekstracellulære matrise (BM-ECM) beskytter prostatakreft celler mot androgen uttømming og kjemoterapi. For panelene A, B, C ble rå verdiene normalisert til den negative kontrollgruppen. (A) er veksten av LNCaP-celler dyrket over tid i androgen fattigmedium, målt ved hjelp MTT. Like mange LNCaPs ble sådd til BM-ECM eller PTP med en n på 4 per gruppe per tidspunkt, og analysert med hensyn på den aktuelle dagen. (B) MDA-PCa-2BS ble platet ut og byttet til androgen slettede medier som beskrevet i (A) og cellelevedyktigheten ble bestemt etter 4 dager. MDA-PCA-2BS celler ble også dyrket på kommersiell ECM. (C) Celleviabilitet av LNCaP celler etter 72 timer i vekstmedium med 25 nM docetaxel. (* P 0,05, ** P 0,01; *** P 0,001, n = 3, med unntak som nevnt i (A), ± SEM)
Benmargs-avledet ekstracellulære matrise. (BM-ECM) induserer klynge som vekst av LNCaPs som motstår androgen uttømming. LNCaPs ble sådd til BM-ECM og PTP som beskrevet i figur 2A. Scanning elektronmikroskopibilder av 7 dagers kulturer i (A) normale vekstmedier og (B) androgen fattigmedium. (C) Høyere forstørrelse scanning-elektronmikrograf av LNCaP (svart asterisk) celler dyrket i BM-ECM (hvit stjerne). (D) sirkularitet av LNCaPs på PTP i androgen utarmet og vekstmedium og LNCaPs på BM-ECM i androgen utarmet media ble kvantifisert fra scanning elektronmikroskopi bilder etter 7 dager i kultur (* P 0,05, ** P 0,01; * ** P. 0,001, ± SEM)
Expression of αvβ3 inte på LNCaP celler formidler vedheft til benmargen-avledet ekstracellulære matrise (BM-ECM). (A) Celleoverflate-ekspresjon av αvβ3 integrin som målt ved flow-cytometri. (B) Anti-αvβ3 inte antistoff redusert celle adhesjon til BM-ECM. Rå-verdier ble normalisert til kontroll IgG-gruppen. (N = 3, * P 0,05, ** P 0,01; *** P 0,001, ± SEM).
Differensial fosfo-proteomikk av LNCaP celler dyrket på benmargen-avledet ekstracellulære matrise (BM-ECM). (A) Hierarkisk clustering avslører LNCaPs på BM-ECM i androgen utarmet media gruppert tettest med LNCaPs dyrket på PTP i vekstmedier (B) Differensial fosforylering av LNCaPs på BM-ECM i androgen utarmet media versus LNCaPs på PTP i androgen utarmet media. (C) Differential fosforylering av LNCaPs på PTP i androgen utarmet media versus LNCaPs på PTP i vekstmedier. (D) Differential fosforylering av LNCaPs på BM-ECM i androgen utarmet media versus LNCaPs på PTP i vekstmedier.
Benmargs-avledet ekstracellulære matrise (BM-ECM) induserer differensial signalering i LNCaP celler som medierer celle overlevelse. Figur panelene C, D, E rå-verdier ble normalisert til den negative kontrollgruppen. (A) Western blot av LNCaPs indikerer økt fosfo-ERK1 /2 og fosfo-p90RSK i respons til BM-ECM. (B) Effekt av PI3K, LY294002 eller MEK1 /2, U0126, hemmere på LNCaPs dyrket på BM-ECM. Celler ble belagt med like tettheter til BM-ECM eller PTP i vekstmedier og etter 24 timer byttet til androgen utarmet media ± hemmere. Cellelevedyktigheten ble målt etter 7 dager (n = 3). (C) Relativ apoptose målt ved bruk av en glukose-6-fosfat-dehydrogenase-analyse etter 72 timer. Clear linjen viser vekstmedier, svarte striper androgen utarmet media. Lyserte celler er en positiv kontroll (n = 8). (D) LNCaPs ble dyrket på PTP indirekte med hMSCs, på BM-ECM, eller i begge tilstander samtidig mens i androgen fattige medier. Relativ cellelevedyktighet ble målt etter 7 dager (n = 3, unntatt som bemerket i (D), * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, ± SEM). (E) Reduksjoner i fosfor-ERK1 /2 i LNCaP celler på BM-ECM ved behandling med U0126 og LY294002.
farging for Erk fosforylering på en vev microarray fra primærtumorprøver, og beinmetastatisk prøver (A) Representative vevssnitt farget for p-Erk fra primær prostata tumorprøver. Eksempel VI inneholdt den eneste betydelig positiv farging i grunnskolen prostata prøver. (B) Tissue seksjoner farget for p-Erk fra beinmetastatisk prostatakreft prøver (skala barer er 200 mikrometer).
gjennomsnittsskår plottet for hver gruppe hentet fra to anonymiserte etterforskere (svarte sirkler). Farging i bein metastase deler er betydelig over begge normale vev og primærtumorsnitt (n = 8 for normal prostata vev, n = 72 for primærtumor, og n = 4 bein metastasering, *** P 0,001, std dev ±.. ).
Her presenterer vi en
in vitro
plattform som muliggjør effektiv og nøyaktig undersøkelse av benmargen svulstens mikromiljø med et spesifikt fokus på BM-ECM. Vi brukte dette systemet til å undersøke responsen av prostata kreft celler og var i stand til å identifisere en rekke faktorer som bidro til sykdomsprogresjon inkludert androgen uavhengig vekst og chemoresistance. De identifiserte faktorer inkludert IGF1 og IL6 parakrint signalering, og aktivering av MAPK vei via BM-ECM signalering.
Materialer og metoder
Cellekultur og BM-ECM underlaget
LNCaP, PC3, og MDA-PCA-2b celler ble nylig kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia) som validerer cellelinjer ved hjelp STR analyse. Hele benmargs aspirates ble hentet fra Lonza (Basel, Sveits), og hMSCs ble isolert og karakterisert som beskrevet andre steder [15]. Etter isolering hMSCs ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin streptomycin, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer og 1 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor. LNCaP og PC3-celler ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% FBS, og 1% Penicillin Streptomycin. Mens MDA-PCa-2b-celler ble dyrket i BRFF-HPC1 medium (Athena ES, Baltimore, MD) supplert med 20% FBS med ingen Penicillin Streptomycin. For studier med androgen utarmet media, ble fenol rød fri base media brukes med 10% trekull strippet FBS. Indirekte ko-kulturer brukt 1 um porestørrelse Transwell innsatser (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) med en celletype utsådd på vevskulturplaten og en annen på cellekultur innsatsen. Indirekte co-kulturstudier brukes en 1:01 ratio av media fra de to celletyper av interesse. I androgen utarmet studier både medietyper ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Cellekulturer ble holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Benmargen-avledet ECM ble generert som beskrevet andre steder [16]. Med mindre annet er angitt alle cellekultur reagenser ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California).
Androgen utarmet vekststudier
For androgen uavhengige vekst /overlevelse studier, prostata kreft celler ble sådd på 5.000 celler /cm
2 i vekstmedier på enten PTP eller BM-ECM. Studier inkludert MDA-PCa-2b-celler, PTP kontrollplater ble også belagt først med en proprietær celleadhesjon matrise som inneholder fibronektin, kollagen og albumin (Athena ES, Baltimore, MD) for å lette celleadhesjon. Celler ble tillatt å holde seg i 24 timer, hvoretter kulturene ble vasket med PBS, og byttet til androgen fattige medier. LNCaP-celler med BM-ECM eller PTP ble analysert som beskrevet nedenfor ved deres respektive tidspunkter for å fullvekstkurven, eller mediet ble erstattet. MDA-PCa-2b-celler var kultur i 4 dager, ble mediet endret i 2 dager, og de relative celletall vurderes via 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT, Invitrogen ) ved slutten av dyrkningsperioden etter fremstillingen protokoll. Gyldigheten av MTT analysen ble bekreftet ved å sammenligne til manuell telling og DNA kvantifisering (fig. S1 A, S1B). MTT verdier ble normalisert til den negative kontrollen som ble vilkårlig satt til en verdi av en.
Inte blokkerer forsøket
Suspendert LNCaP celler ble pre-inkubert med en blokkerende monoklonalt antistoff mot αvβ3 (20 mikrogram /ml), klon 23C6 (eBioscience, San Diego, CA), eller IgG-isotype-kontroll i 30 minutter og deretter sådd til BM-ECM. Etter 12 timer ble mediet aspirert og cellene ble vasket en gang med PBS. Det relative celleantall ble deretter målt ved anvendelse av en MTT-analyse som beskrevet ovenfor.
Docetaxel behandlingsstudier
prostatakreft-celler ble sådd på PTP eller BM-ECM som beskrevet ovenfor, og fikk komme seg i 24 timer. Deretter ble cellene vasket med PBS og erstattet med vekstmedium supplementert med 25 nM docetaxel eller kjøretøy bare. Celler ble utsatt for behandling i 72 timer, og den relative cellelevedyktigheten ble deretter målt ved hjelp av en MTT-analyse, som ble normalisert som i tidligere MTT analyser.
ELISA-analyser
Å samle klimaanlegg medieprøver hver celletype ble sådd til PTP og co-kulturer utført ved bruk av transwell inserts med hMSCs på PTP og LNCaP celler sådd til innleggene. Kondisjonert medium fra hver gruppe ble fjernet, hver 48. time og erstattet med friskt medium. Både IL6 og IGF-1 ELISA kits ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (eBioscience og R 0,001). Data ble representert som gjennomsnitt ± SEM, med mindre annet er angitt. Bilde circularity analyse ble gjennomført ved hjelp av ImageJ og foreslo terskelinnstillinger. Økende verdier på circularity skalaen indikerer stadig sirkulære celler. Protein microarray data ble skannet som en bildefil og den integrerte piksel intensitet for hvert punkt målt ved hjelp ImageJ. Gjennomsnittet av duplikater ble tatt, dataene ble bety sentrert, og hierarkisk clustering analyse ble utført. Differensial proteinfosforylering mellom gruppene ble uttrykt som differansen mellom to målinger delt på standardavviket i populasjonen.
Resultater
parakrint interaksjoner av hMSCs og LNCaPs fremme osteogene differensiering av hMSCs og androgen uavhengig overlevelse av LNCaPs
for å bedre forstå parakrint signale mellom hMSCs og prostata kreft celler, brukte vi indirekte co-kulturer av LNCaPs og hMSCs. LNCaPs indusere osteogene differensiering av hMSCs (Fig. 1A, 1B) som lignet osteoblast aktivering ofte sett i prostatakreftpasienter [20]. I tillegg overlevelse av LNCaP-celler i HMSC ko-kulturene ble betydelig forbedret i løpet av monotypisk LnCap kulturer i androgen fattig medium (Fig. 1C). Å avhøre disse effektene, ble IL6 signale inhibert med et anti-IL6 monoklonalt antistoff eller, AG490, et lite molekyl hemmer av JAK2 kinase, en oppstrøms aktivator av Stat3. Disse behandlingene betydelig redusert levedyktighet av LNCaPs sammenlignet med ikke-inhibert ko-kultur gruppe i androgen utarmet betingelser (Fig. 1C). Å merke seg at reduksjonen i levedyktigheten var ikke til nivået for LNCaPs dyrket alene, testet vi også effekten av AG1024, en IGFR-inhibitor. Dette stoffet også betydelig redusert levedyktighet av LNCaP cellene indirekte co-dyrket med hMSCs. Disse inhibitorer alene ikke var cytotoksisk for cellene (Fig. S2). Til slutt, ble ekspresjonen av IL6 over tid bekreftet via ELISA fra hMSCs kondisjonert medium med forskjellige betingelser (Fig. 1D). Spesielt hMSCs som hadde vært forhånds differensierte mot en osteogene linage konsekvent hadde høyere forekomst av IL6 uttrykk. Vurderer LNCaPs indusere hMSCs å gjennomgå osteogene differensiering, kan dette være en kilde til økning IL6 ligander nivåer. I tillegg, ble IGF-1-nivåer målt i kondisjonert media med en ELISA-analyse. Ingen tid varierende effekter ble sett, ble observert, men likevel betydelig steady state utgivelsen av hMSCs i forhold til PC3 og LNCaP celler (Fig. 1E).
BM-ECM fremmer overlevelse av LNCaP celler i androgen utarmet media og chemoresistance
i tillegg til løselige parakrine signaler, hypotese vi at benmarg lignende ECM kan spille en rolle i overlevelsen av androgen-avhengig prostata kreftceller. En decellularized matrise ble avledet fra ECM proteiner utskilt av hMSCs [16]. Etter en uke i kultur i androgen belastede media var det en betydelig økning i antall levedyktige celler på BM-ECM sammenlignet med celler i androgen fattigmedium for PTP (fig. 2A). Mekanismen for denne virkning ble bekreftet i en andre androgen-avhengig cellelinje, nemlig MDA-PCa-2b-celler (Fig. 2B). MDA-PCA-2b-celler blir rutinemessig dyrket på kommersielt tilgjengelige ECM for å støtte celle adhesjon og vekst. Men denne ECM substratet ikke understøtte veksten av MDA-PCa-2b-celler i androgen utarmet betingelser som indikerer effekten er spesifikk for BM-ECM komponenter eller struktur (Fig. 2B). Deretter undersøkte vi om BM-ECM kunne gi chemoresistance bruker vekstmedium supplert med docetaxel. BM-ECM dyrkede LNCaP-celler viste en signifikant økning i celleoverlevelse sammenlignet med PTP kulturer (fig. 2C). Disse dataene indikerer at komponentene i BM-ECM spiller en avgjørende rolle for å overleve i respons til androgen deprivasjon og docetaxel behandling.
BM-ECM endrer LNCaP morfologi
For å gi en bedre forståelse av BM-ECM og LNCaP crosstalk, analyserte vi cellemorfologi ved scanning elektronmikroskopi. LNCaPs kunne observeres festet til ECM fibre og grunnmasse (fig. 3A, 3B og 3C). LNCaP-celler dyrket i androgen fattigmedium hadde en betydelig økning i forlengelse som kvantifisert følgende SEM avbildning etter 4 dager (fig. 3B). Men dette morfologisk forandring ble hindret fra å inntreffe når cellene ble dyrket i androgen fattigmedium på BM-ECM. I denne tilstanden cellene ut til å vokse i klynger som resulterer i en betydelig økning i målt sirkularitet (Fig. 3D).
Blokkerings αvβ3 integrin grenser vedlegg til BM-ECM
Neste, vi søkt å undersøke rollen til αvβ3 inte kompleks for BM-ECM vedlegg, fordi dette inte komplekset har vært innblandet i ECM vedlegg og påfølgende benmargsmetastase [21]. Strømningscytometri viste celleoverflate-merking for αvβ3 integrin (Fig. 4A). For å finne ut funksjonell betydning, ble suspendert celler inkubert med en blokkerende antistoff mot αvβ3 inte eller isotypekontrollantistoff og celle vedlegg til BM-ECM ble deretter målt. En betydelig reduksjon i celleadhesjon ble målt, noe som tyder på at integrin αvβ3 i dette tilfelle spiller en rolle som formidler festing til BM-ECM (Fig. 4B).
Virkning av BM-ECM på MAPK og PI3K signalveier
for å finne mekanismen formidling responsen fra LNCaPs til BM-ECM vi undersøkte den relative fosforylering tilstand av 46 proteiner fra flere veier å bruke en omvendt fase protein microarray. Når ble utført hierarkisk clustering analyse, LNCaPs på BM-ECM i androgen utarmet media gruppert tettest med LNCaPs i vekstmedier på PTP (Fig. 5A). Differensial fosforylering ble så vurdert mellom LNCaPs på BM-ECM i androgen utarmet media og LNCaPs på PTP i androgen utarmet media, og mange proteiner syntes å være forskjellig fosforylert (Fig. 5B). Men når vi også undersøkt fosforylering forskjeller mellom LNCaPs på PTP i vekstmedier versus androgen utarmet medie flere proteiner ble likeledes regulert (Fig. 5C).
