Abstract
peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor β /δ (PPARβ /δ) er en kjernefysisk reseptor involvert i reguleringen av lipid- og glukosemetabolisme, sårheling og betennelse. PPARβ /δ har vært forbundet også med kreft. Her undersøkte vi ekspresjonen av PPARβ /δ og komponenter av prostaglandin-biosyntese-veien i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Vi har funnet øket ekspresjon av PPARβ /δ, COX-2, CPLA
2, PGES og VEGF i human NSCLC i forhold til normal lunge. I NSCLC cellelinjer PPARβ /δ aktivering økt spredning og overlevelse, mens PPARβ /S knock-down redusert levedyktighet og økt apoptose. PPARβ /S agonister indusert Cox-2 og VEGF transkripsjon, noe som tyder på eksistensen av fôr-forward sløyfer fremme celle overlevelse, betennelse og angiogenese. Disse effektene ble sett bare i høy PPARβ /S uttrykke celler, mens lave uttrykker cellene var mindre eller ikke berørt. Effekten ble også avskaffet ved PPARβ /S knock-down eller inkubasjon med en PPARβ /δ antagonist. Induksjon av VEGF skyldes både binding av PPARβ /δ til VEGF-promoteren og PI3K-aktivering gjennom en ikke-genomisk mekanisme. Vi fant ut at PPARβ /δ samhandlet med PI3K regulatorisk subenhet p85α fører til PI3K aktivering og Akt fosforylering. Sammen er disse dataene indikerer at PPARβ /δ kan være et sentralt element i lunge kreft kontrollere flere stier og representerer et potensielt mål for NSCLC behandling
Citation. Genini D, Garcia-Escudero R, Carbone GM, Catapano CV (2012) transkripsjons- og ikke-Transkripsjon funksjoner PPARβ /δ i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (9): e46009. doi: 10,1371 /journal.pone.0046009
Redaktør: Giuseppe Viglietto, Universitetet Magna Graecia, Italia
mottatt: May 11, 2012; Godkjent: 23 august 2012; Publisert: 25.09.2012
Copyright: © Genini et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette var støttet av «Fondazione Ticinese per la ricerca sul cancro». de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptorer (PPAR) er atomhormonreseptorer (NHRs) aktiveres av lipofile ligander, inkludert langkjedete fettsyrer og prostaglandiner [1]. PPAR danne heterodimerer med retinoid X reseptor (RXR) og binder seg til spesifikke elementer i genet arrangører. PPAR er involvert i metabolske og utviklingsprosesser. PPARβ /δ har en viktig rolle i lipid- og glukosemetabolisme og er et attraktivt terapeutisk mål for metabolske og degenerative forstyrrelser [1]. PPARβ /δ er også involvert i inflammasjon, sårheling, cellevekst og differensiering. PPARβ /δ er over-uttrykt i humane kreftformer og kan være viktig i tumor initiering og progresjon [1]. Til støtte for en pro-tumorigen funksjon, PPARβ /S ligander fremmes kreftcelleoverlevelse in vitro [2], [3], [4] og tumorvekst hos mus [5], [6], [7]. Omvendt genetisk knock-out av PPARβ /δ i tykktarm kreft celler redusert tumorvekst i mus [8]. Andre data, men ved hjelp av agonister og genetisk knock-out i cellulære og musemodeller motsi denne svulsten fremme funksjon [9]. Knock-out av PPARβ /δ i colon cancermodeller ble rapportert å fremme tumordannelse hos mus, mens agonister redusert celleproliferasjon in vitro og tumorvekst hos mus [10], [11], [12]. Ulike faktorer kan påvirke responsen på ligandaktivering, over-uttrykk og knock-out av PPARβ /δ. Vi rapporterte tidligere at uttrykk og aktivitet av PPARβ /δ varierte betydelig i humane NSCLC-cellelinjer og PPARβ /δ proteinnivået avhengig av ligander evne til å beskytte mot proteosomal degradering [13]. Den basale nivået av reseptoren og dette ettertranskripsjonsregulerende trinn kunne konto delvis for de variable responser til PPARβ /S agonister i ulike eksperimentelle forhold [14].
I løpet av sårtilheling og betennelse PPARβ /δ-funksjonen er forbundet med induksjon av syklooksygenase-2 (COX-2) [1]. Cox-2 forvandler arakidonsyre utgitt av fosfolipase A
2 (CPLA
2) inn PGH
2 [15]. PGH
2 blir deretter omdannet til prostaglandiner, som prostaglandin E
2 (PGE
2) og prostaglandin-I
2 (PGI
2), utrustet av komplekse biologiske aktiviteter. Arakidonsyre og PGI
2 virker som PPARβ /S agonister [2], mens PGE
2 øker aktiviteten av PPARβ /δ uten direkte binding til reseptoren [6]. Ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs) og Cox-2-hemmere påvirker PPARβ /δ ved å hindre produksjon av prostaglandiner [3]. På den annen side har økt ekspresjon av PPARβ /δ er blitt rapportert å beskytte cancerceller fra den antiproliferative og pro-apoptotiske virkninger av NSAID og COX-2-hemmere [3]. Cox-2 blir over-uttrykt i premaligne og maligne lesjoner, inkludert lungekreft [16], og har en viktig rolle i tumorassosiert inflammasjon og angiogenese [15]. Videre kan PPARβ /δ og Cox-2 innvirkning på produksjonen av pro-inflammatoriske og pro-angiogene faktorer i tumorer, slik som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [17], [18]. Dermed nåværende bevis plasserer PPARβ /δ sammen med Cox-2 og prostaglandin synthases innen signalveier som kan kontrollere spredning og overlevelse av kreftceller og deres samspill med svulsten mikromiljøet.
Lungekreft er en ledende årsak til kreft død på verdensbasis [19]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) representerer ca 85% av alle lungekrefttilfellene. NSCLC er ofte diagnostisert på et avansert stadium og har en svært dårlig prognose. En bedre forståelse av de involverte i opprinnelse og progresjon av NSCLC faktorer kan føre til en forbedring i behandling og forebygging. I denne studien undersøkte vi om og hvordan PPARβ /δ kan bidra til patogenesen av NSCLC. Vi fant at PPARβ /δ var ofte oppregulert i NSCLC sammenlignet med normal lunge. PPARβ /δ over-uttrykk ble generelt forbundet med økt uttrykk av CPLA
2, Cox-2, PGES og VEGF. Vi undersøkte konsekvensene av PPARβ /δ aktivering på celleproliferasjon og overlevelse og på uttrykk for Cox-2 og VEGF i NSCLC cellelinjer. Vi fant bevis i samsvar med en pro-tumorigen rollen PPARβ /δ i NSCLC. I tillegg fant vi at PPARβ /S agonister førte til induksjon av VEGF også gjennom en parallell ikke-transkripsjonen mekanisme knyttet til PI3K /Akt aktivering. Sammen er disse dataene indikerer at PPARβ /δ kan være et sentralt element i lunge kreft kontrollere flere prosesser og stier og dermed representerer et potensielt mål for utvikling av nye strategier for lungekreft behandling.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Menneskelig lunge carcinoma cellelinjer H358, H441, H23 og A549 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (LGC Promochem, Molsheim, F) og ble opprettholdt i RPMI supplert med 10% FBS. Cellene ble dyrket i fenol rød-fri RPMI supplert med 5% trekull-strippet serum (HyClone, Logan, UT, USA) før inkubasjon med PPAR ligander.
Kjemi
GW501516, LY294002 og ciglitazon ble kjøpt fra Alexis (Lausanne, Sveits). cPGI
2 ble kjøpt fra Biomol (Plymouth Meeting, PA). L165041 og NS398 ble oppnådd fra Sigma (Buchs, CH). Wortmannin ble kjøpt fra Calbiochem (Merk biovitenskap, Nottingham, UK). Den PPARβ /δ antagonist GSK0660 ble levert av Dr. A. Billin (GlaxoSmithKline, USA). Alle forbindelser ble oppløst i DMSO.
Pasientprøver
Lung kreftprøver (plateepitelkreft karsinomer og adenokarsinomer, scene IA til HIA) og tilstøtende prøver normale lungevev var fra Medical University of South Carolina (Charleston, SC, USA) og ble erholdt ved tidspunktet for kirurgi med pasientens informerte samtykke. Vevsprøver ble hurtigfrosset og lagret i flytende nitrogen. RNA ble isolert ved anvendelse av RNA STAT-60. RT-PCR ble utført ved anvendelse av 100 ng av total RNA og 0,4 pM av primere med Superscript Ett-trinns RT-PCR (Invitrogen). PCR-produktene ble analysert ved agarosegel-elektroforese, visualisert ved hjelp av AlphaImager (AlphaInnotech) og kvantifisert ved densitometrisk analyse ved bruk av AlphaImager programvare. Resultatene ble presentert som forholdet mellom det båndintensiteten i paret tumor og normale prøver normalisert til referanse-genet β-aktin. Pearson korrelasjonsanalyse ble utført på de normaliserte genuttrykk nivåer. Genom-wide transkriptom datasett fra menneskelig lungekreft og prøvene normale lungevev fra fire ulike studier (PMID: 18992152, 11707590, 20421987, 18641660) ble brukt for å undersøke sammenhenger mellom PPARβ /S og mulige målgener. Normaliserte genuttrykk verdier for hver avskrift ble lastet ned og Pearson korrelasjonskoeffisient og den tilsvarende p-verdi i forhold til PPARβ /δ ble beregnet for prøvene i hvert datasett.
Luciferase Assay
PPARβ /δ responsive reporter (DRE) ble levert av B. Vogel [3]. Cellene ble transfektert med DRE eller basisk pGL3 luciferase reporter sammen med PRL-SV40 kontroll plasmid hjelp Lipofectamine. Celler ble dyrket i RPMI medium supplementert med 5% trekull-strippet serum i 24 timer. Luciferase-aktivitet ble målt ved anvendelse av den doble luciferase-kit (Promega) som beskrevet [20].
celleproliferasjon og levedyktighet
Celler ble sådd ut i 96-brønners plater i fenolrødt-fritt RPMI supplert med 5% trekull-strippet serum. Etter 24 timer ble cellene behandlet med ligander eller DMSO (0,1%) i 0,1% trekull-strippet serum. Antall levedyktige celler ble bestemt ved å bruke MTT etter 72 h [20]. Alle analysene ble utført i triplikat og gjentatt i minst tre uavhengige eksperimenter. For cellesyklusanalyse-celler ble dyrket i 0,1% trekull-strippet serum og høstet etter 24 timers inkubering med ligander eller DMSO. Cellene ble deretter farget med propidiumjodid og analysert ved flowcytometri, som beskrevet [20].
RNA interferens
For knock-down eksperimentene ble cellene sådd ut ved lav konsentrasjon (30-50% konfluens ) og transfektert med 10 nM siRNA (Ambion, Huntingdon, UK) rettet mot PPARβ /δ (siPPARβ /δ) og ildflue luciferase (siGL3) med Interferin henhold til produsentens foreslåtte protokoll (Polyplus). Transfeksjon av siRNA ble gjentatt hver tredje dag for tre ganger. Celleviabilitet ble bestemt ved hjelp av MTT etter 72 timer med vekst i 0,1% av kull-strippet serum fra siste transfeksjon. Apoptose ble likeledes vurderes etter 72 timer ved Annexin V-FITC og flowcytometri som beskrevet [20].
RNA Isolation og RT-PCR
Cells (1 × 10
6 celler) ble sådd ut i 60-mm skåler, dyrket i serum og fenol rød fri RPMI i 24 timer, og deretter inkubert med forskjellige forbindelser i 18 timer. RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol (Invitrogen) og RNeasy MINIKIT (Qiagen). RT-PCR ble utført under ikke-mette forhold ved hjelp av Super ™ III One-Step RT-PCR System (Invitrogen) og gen-spesifikke primere (Tabell S1) [20]. PCR-produktene ble separert på 2% agarosegeler, farget med GelRed (Biotium, Basel, CH) og kvantifisert ved anvendelse av den AlphaImager som beskrevet ovenfor.
Immunoblotting
Celler ble lysert som beskrevet [13] . Lysatene ble sentrifugert ved 14.000 x g i 10 minutter for å fjerne eventuelle rester og proteinkonsentrasjonen ble bestemt. Proteiner ble lastet på 10-12% polyakrylamidgeler og analysert ved immunblotting. Procaspase-3 (302), ble PDK1, PTEN, Akt, og fosfo-Akt (Ser 473) antistoffer kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Cox-2 (E-29) og PPARβ /δ (H-74) antistoffer ble oppnådd fra St. Cruz (Heidelberg, Tyskland). Tubulin (Ab-1) antistoff ble kjøpt fra Oncogene (Merk biovitenskap, Nottingham, UK).
Chromatin Immunpresipitasjon (chip)
Celler ble dyrket til konfluens i 75-cm
2 kolber, utsultet, og inkubert med GW501516 eller vehikkel i 18 timer. Brikken ble utført som beskrevet [21] med 4 ug anti-PPARβ /δ-antistoff eller anti-IgG som en negativ kontroll. PCR ble utført med primere som spenner over regionene fra -527 til -298 og fra -1338 til -1123 av VEGF-promoteren i nærvær av betain og DMSO ved hjelp av AmpliTaq Gold (Applied Biosystem, Foster City, CA). Densitometrisk analyse ble utført ved hjelp av AlphaImager programvare.
Hans-merket PPARβ /δ Pull-down og Immunpresipitasjon
Hans-PPARβ /δ ekspresjonsvektor ble beskrevet tidligere [13]. Den His-merket N- og C-terminal avkortede konstruksjoner av PPARβ /δ ble generert av nettstedet mutagenese. Cellene ble transfektert med Lipofectamine, vokst til samløpet og inkubert med og uten PPARβ /S ligander. Celler ble lysert i RIPA-buffer i 30 minutter på is og utsatt for rullegardin med His-select nikkel affinitetsgel (Sigma). Proteiner ble eluert med Laemmli-buffer. Ekvivalente alikvoter av lysater, gjennomstrømning og eluatene ble tilsatt geler og analysert ved immunblotting. Immunpresipitasjon (IP) ble utført ved hjelp av anti-p85α serum (en gave fra M. Thelen, IRB, Bellinzona, CH) og A /G sepharose perler (Thermo scientifics). Hans-PPARβ /δ ble oppdaget med en anti-His antistoff (Sigma).
Resultater
Uttrykk for PPARβ /δ i ikke-småcellet lungekreft
Vi vurderte nivået av PPARβ /δ sammen med PPARy, CPLA
2, COX-2, PGES og PGIS i NSCLC-cellelinjer. Ekspresjonen av disse genene varierte betydelig mellom de cellelinjer (Fig. 1A). H441 celler hadde høye nivåer av PPARβ /δ, Cox-2, CPLA
2, PGES og PPARy. H358 og H23 celler hadde middels nivå av PPARβ /δ og lav /moderat uttrykk for Cox-2, PGES, CPLA
2 og PPARy. Interessant, A549 celler, som er blitt anvendt i mange studier for å teste effekten av PPARβ /S agonister, hadde det laveste nivået av PPARβ /δ og PGES, mens hadde relativt høy ekspresjon av PPARy og Cox-2. Forskjellen i PPARβ /δ nivå mellom H441 og A549-celler ble bekreftet ved anvendelse av en selektiv PPARβ /δ responsive luciferase reporter [3] (Fig. 1B), og var i samsvar med tidligere data fra vår gruppe på protein-nivå, og som reaksjon på ligandaktivering i to cellelinjer [13]. Interessant nok er de fleste av NSCLC-cellelinjene uttrykte ikke PGIS, med unntak av H23-celler i hvilken et lavt nivå av PGIS mRNA ble detektert. Dette antydet at PGI
2 er usannsynlig å bli produsert endogent i de fleste NSCLC celler.
(A) RNA isolert fra de angitte cellelinjer ble forsterket av RT-PCR for å vurdere nivået på PPARβ /δ, PPARy, CPLA
2, Cox-2, PGIS, og PGES RNA. GAPDH ble brukt som en referanse genet. (B) H441 og A549 celler ble transfektert med et PPARβ /δ responsive luciferase reporter (DRE) eller basisk pGL3 luciferase reporter (Basic). Luciferase-aktivitet ble målt etter 24 timer. * P 0,01. (C) RNA isolert fra lungesvulster og tilstøtende normalt lungevev ble analysert ved RT-PCR med primere som er spesifikke for PPARβ /δ og β-aktin.
Deretter undersøkte vi uttrykket av de samme genene i normale lunge og tumor vevsprøver fra pasienter med NSCLC (figur S1). Vi fant økt PPARβ /δ mRNA i mange svulster i forhold til de sammenkoblede normale lungeprøver (Fig. 1C). For å sammenligne mønsteret av ekspresjon i hele prøvesett, ble mRNA nivå av hvert gen bestemmes ved densitometrisk analyse, normalisert til p-aktin og presentert som forholdet mellom nivået i hvert par av tumor /normal-matchede prøver (fig. 2). PPARβ /δ mRNA var markert oppregulert (T /N-forholdet ≥4) i omtrent 50% av tumorer. Dette er i tråd med tidligere rapporter om over uttrykk for dette NHR i mange humane kreftformer, inkludert NSCLC [1], [22]. Cox-2, CPLA
2 og PGES ble også oppregulert i de fleste tumorprøver (fig. 2). Oppregulering av disse genene var spesielt tydelig i tumorer med PPARβ /δ over-ekspresjon. Spesielt, PGIS ble detektert i normal lunge og bare endres litt i en liten brøkdel av tilfellene. PPARy ble moderat økt i noen tumorer, men oftere nedregulert, i samsvar med den antatte tumor suppressor rolle tilskrives dette NHR. VEGF, som er en antatt mål for PPARβ /δ og Cox-2, ble også oppregulert i mange tumorer med PPARβ /δ over-ekspresjon (Fig.). Spesielt, nivået av PPARβ /δ korrelerte signifikant med uttrykk for Cox-2 (Pearson coeff 0,76;. P-verdien, 2.91E-05), CPLA
2 (Pearson coeff 0,69;. P-verdien 2.72E- 04) og VEGF (Pearson coeff 0,54;. p-verdi 0,018). For å gi ytterligere støtte til koblingen mellom PPARβ /δ, VEGF og Cox-2 vi undersøkt nivået av disse genene i offentlig tilgjengelige genuttrykk datasett fra normale og lungekreft vevsprøver. Vi fant signifikante sammenhenger av PPARβ /δ med VEGF og Cox-2 mRNA uttrykk i flere datasett (Tabell S2). Tatt sammen indikerer disse data hyppig og samtidig oppregulering av PPARβ /δ, VEGF og komponenter av Cox-2 /prostaglandin synteseprosess i en undergruppe av NSCLC og gi støtte til hypotesen om at aktiveringen av disse reaksjonsveier, kan spille en rolle i lunge kreftutvikling.
RNA ble ekstrahert fra svulster og tilstøtende normalt lungevev fra pasienter med ikke-småcellet lungekreft og undersøkt ved RT-PCR. Data representerer forholdet av genekspresjon i tumorer i forhold til den sammenkoblede normalt vev basert på densitometrisk analyse og normalisert til p-aktin anvendt som referanse-genet. Svarte striper markere svulstene med høyeste uttrykk for PPARβ /δ (T /N-forholdet ≥4).
PPARβ /δ Fremmer spredning og overlevelse av ikke-småcellet lungekreft celler
deregulert uttrykk for PPARβ /δ kan favorisere spredning og overlevelse av kreftceller. Men studier gjort i ulike cellemodeller, blant annet lungekreft cellelinjer unnlatt å gi konsistente resultater [9], [23]. Dataene som er beskrevet ovenfor tyder på at sammenhengen som noen studier ble gjort var ganske heterogen og kan påvirke de ulike cellulære responser til PPARβ /δ aktivering. Vi fant ut at PPARβ /S agonister økt spredning og fremmet overlevelse av NSCLC celler. Aktivering av PPARβ /δ ved cPGI
2 i lav serummedium økt celleformering og levedyktighet (fig. 3A). Lignende effekter ble sett med en annen PPARβ /δ agonist, L165041 (Fig. 3B). Konsekvent, viste cellesyklus analyse en økning på S-fase celler etter behandling med cPGI
2 i lav serum medium mens G1 fase celler redusert (fig. 3C). Spesielt, var alle disse effektene tydelig i celler med høy ekspresjon av PPARβ /δ (f.eks, H441 og H358), mens det var ingen eller minimal effekt på vekst og cellesyklus i A549-celler med lavt nivå av reseptoren (fig. 3a- C). Disse pro-vekst og overlevelse effekter var spesifikke for PPARβ /S agonister som inkubasjon med PPARy agonist ciglitazon hemmet cellevekst (figur S2). I tillegg ble høy ekspresjon av PPARβ /δ forbundet med redusert følsomhet for NSAID og COX-2-hemmere, som sulindac sulfid, sulindac sulfon og NS398, i H441-celler sammenlignet med A549 celler med lav PPARβ /δ uttrykket (fig S2). Til støtte for en pro-overlevelsesfunksjonen, knock-down av PPARβ /S ved hjelp av små interfererende RNA (siRNA) påvirket celleviabilitet (Fig. 3D). PPARβ /S knock-down økte også antallet Annexin V-positive apoptotiske celler (fig. 3E) og induserte caspase-3-aktivering, en kjent markør for celledød ved apoptose (fig. 3F). Samlet utgjør disse dataene indikerer at aktivering av PPARβ /δ fremmer overlevelse og spredning av NSCLC celler som uttrykker høye nivåer av reseptoren.
(A) H441, H358 og A549 celler ble inkubert med cPGI
2 i serumfritt medium og cellelevedyktigheten ble bedømt etter 72 timer med MTT-analyse. * P 0,01 i forhold til kontrollceller. (B) Celler ble inkubert med L165041 som ovenfor. * P 0,01 i forhold til kontrollceller. (C) Cellene ble inkubert med cPGI
2 (10 uM) i 24 timer og analysert ved hjelp av strømningscytometri.
Topplate
, representant flowcytometrisk profilen til H358-celler inkubert med og uten cPGI
2.
Bunnplate
, cellesyklus distribusjon i celler etter 24 timers inkubasjon med og uten cPGI
2. Økningen i S-faseceller i H441 og H358-celler bestemt in triplo forsøk var statistisk signifikant (P 0,01). (D) H441 celler ble transfektert med siRNA for PPARβ /δ og GL3 og cellelevedyktigheten ble bestemt etter 72 timer med MTT. * P 0,01 i forhold til kontrollceller. (E) H358-celler transfektert med PPARβ /δ siRNA og GL3 ble farget med annexin V og propidiumjodid og analysert ved strømningscytometri. Prosentandelen av annexin V-positive celler (apoptotiske celler) er angitt i hvert panel. P 0,05. (F) H358-celler ble transfektert med siRNA for PPARβ /δ og GL3, lysert og analysert ved immunblotting med et caspase-3 antistoff. * P. 0,01
PPARβ /δ Aktivering induserer Cox-2 og VEGF Expression
Cox-2 og PPARβ /δ kan funksjonelt samvirke og gjensidig regulere hverandre. Samtidig oppregulering av PPARβ /δ og komponenter av Cox-2 /prostaglandin synteseprosess hos NSCLC vev og cellelinjer støttes videre denne linken og induserte oss å teste om PPARβ /δ kan påvirke Cox-2 uttrykk i NSCLC celler. Vi observerte en økning på Cox-2 mRNA ved behandling av NSCLC celler med PPARβ /δ ligand GW501516 (fig. 4A). Spesielt, har COX-2-mRNA ikke øke i A549-celler tyder på at effekten avhengig av nivået av endogent PPARβ /δ. GW501516 induserte også transkripsjonen av adipose differensiering-relatert protein (ADRP) genet, som er et kjent mål for PPARβ /δ, i H358 og H441-celler, og bare i liten grad i A549-celler (fig. 4A). Tvert imot, PDK, et PPARβ /δ målgenet rapportert i andre studier [24], ble ikke påvirket (fig. 4A). En tids kurs analyse viste at endringene i Cox-2 og ADRP mRNA-nivået var tydelige i løpet av 4-8 timer fra tilsetningen av liganden og økes ytterligere ved 24 timer (fig. 4B).
(A ) H358, H441 og A549-celler ble dyrket til konfluens, sultet i 24 timer og deretter behandlet med GW501516 (5 uM) i 18 timer. Totalt RNA ble isolert og undersøkt ved hjelp av RT-PCR. (B) H358-celler ble inkubert med GW501516 i de angitte tidsrom før RNA-ekstraksjon og analyse.
PPARβ /δ og Cox-2 kan utgjøre en feed-forward reguleringssløyfe opprettholde celle overlevelse og spredning. I tillegg ble PPARβ /δ identifisert som en viktig del av den angiogene bryter under tumorprogresjon [25] og VEGF, som er den viktigste formidler av angiogenese, ble identifisert som et mål for PPARβ /δ [18]. Analyse av VEGF-ekspresjon i NSCLC og normal lungeprøver viste økt ekspresjon av VEGF og høy korrelasjon med PPARβ /δ i lunge cancer (Fig. 2 og Tabell S2), i overensstemmelse med ideen om at PPARβ /δ kunne regulere VEGF-ekspresjon. For å teste effekten av PPARβ /δ på VEGF uttrykk, behandlet vi NSCLC celler med GW501516. VEGF mRNA økte i H358 og H441-celler ble inkubert med GW501516, mens endret seg ikke i A549-celler (Fig. 4A). Som sett for Cox-2 og ADRP, økt VEGF mRNA innen 4-8 timer og økt ytterligere etter (4B Fig.) 24 timer. Til vår overraskelse, var uttrykk for VEGF reseptorer VEGFR1 og VEGFR2 redusert ved behandling med GW501516 (Fig. 4A-B).
PPARβ /δ er direkte involvert i reguleringen av VEGF transkripsjon
Induksjon av VEGF-ekspresjon ved PPARβ /δ kunne representerer en viktig funksjon av reseptoren. For å gi bevis for involvering av PPARβ /δ i induksjon av VEGF vi slo det ned ved hjelp av RNA-interferens. Effektiviteten av siRNA-mediert knock-down ble bekreftet ved RT-PCR (fig. 5A). PPARβ /S knock-down redusert basalnivå av VEGF mRNA og evnen til å indusere GW501516 VEGF mRNA sammenlignet med kontroll transfekterte celler (Fig. 5A). Effekten av PPARβ /δ uttømming ble mer tydelig i H358 enn H441-celler, sannsynligvis på grunn av det lavere utgangsnivå av reseptoren. Lignende resultater ble oppnådd med den direkte PPARβ /δ target ADRP. Basal ADRP ekspresjon og responsen på GW501516 var lavere i PPARβ /δ uttømte celler sammenlignet med kontroll transfekterte celler (Fig. 5A). Interessant, knock-down av PPARβ /S svakt redusert basalnivå av VEGFR1 og VEGFR2 og forbedret, i stedet for å motvirke effekten av GW501516 (Fig. 5A). Dermed uttømming av PPARβ /δ hadde motsatt effekt på VEGF og VEGFRs, i samsvar med den oppfatningen at PPAR kan påvirke genuttrykk ved forskjellige mekanismer [26].
(A) H358 og H441 celler ble transfektert med PPARβ /δ siRNA og kontroll GL3 og deretter behandlet med GW501516 (5 uM) i 18 timer. Gen-nivåer ble bestemt ved RT-PCR. (B) Celler ble inkubert i 2 timer med GSK0660 (10 uM) og deretter med GW501516 (5 uM) i 18 timer før analyse ved hjelp av RT-PCR. (C) H358-celler ble behandlet med GW501516 i 18 timer og behandlet til kromatin immunoutfelling under anvendelse av anti PPARβ /S og anti-IgG-antistoffer. Den delen av VEGF arrangøren inneholder en PPRE (-527 /-298) og en ikke-målrettede region (-1338 /-1123) ble PCR forsterket. Den PPRE inneholdende regionen i ADRP promoteren ble amplifisert som positiv kontroll.
Topplate
, representant gel scan.
Bunnplate
, densitometrisk kvantifisering av tre uavhengige eksperimenter i H441 celler. * P. 0,01
I tillegg til siRNA-mediert knock-down, testet vi PPARβ /δ antagonist GSK0660 [27]. Celler ble inkubert i 2 timer med GSK0660 (10 pM) før behandling med GW501516. Denne dosen av GSK0660 påvirket ikke celleviabilitet men effektivt hemmet PPARβ /δ aktivitet. GSK0660 hadde begrenset effekt på den basale nivået av VEGF mRNA, men blokkert induksjon av VEGF med GW501516 (Fig. 5A). GSK0660 hadde en lignende virkning på ADRP mRNA i både basal tilstand og ved ligandaktivering. GSK0660 reduserte også nivået av VEGFR1 og VEGFR2 mRNA sammenlignet med kontrollceller både i basale betingelser og i nærvær av GW501516 (Fig. 5B). Dermed både siRNA mediert knock-down og PPARβ /δ antagonist blokkert VEGF transkripsjon, i samsvar med hypotesen om at PPARβ /δ var direkte involvert i prosessen, og fungerte som en transkripsjonen aktivator.
For å avgjøre om PPARβ /δ regulert VEGF-ekspresjon ved direkte binding til VEGF-promoteren, utførte vi kromatin immunpresipitering og vurderes binding av PPARβ /δ til et område av VEGF-promoteren (-527 /-298) inneholdende en PPRE [28]. En oppstrøms område av VEGF-promoteren (-1338 /-1123) som mangler PPREs ble anvendt som negativ kontroll. Ved ligandaktivering, ble binding av PPARβ /δ detektert til PPRE inneholdende området mens ingen binding ble detektert i den fjerne regionen (fig. 5C). Densitometrisk analyse av resultatene bekrefter binding av PPARβ /δ til VEGF-promoteren ved ligandaktivering, mens det ikke var noen binding i fravær av ligand og i IgG-kontrollprøver (fig. 5C). Videre er omfanget av PPARβ /S binding til VEGF arrangøren var sammenlignbar til ADRP promoter, en kjent av PPARβ /δ target (Fig. 5C).
PI3K aktivering er involvert i VEGF Induksjon av PPARβ /δ
Vi utforsket hvorvidt ytterligere veier som har vært forbundet til PPARβ /δ kan bidra til regulering av VEGF svar på PPARβ /s agonister. Den PI3K /akt-veien aktiveres i mange kreftformer, og er involvert i tumor angiogenese [29]. ILK og PDK, to nedstrøms mål kinaser av Akt, ble vist å være regulert av PPARβ /δ [24] og aktivering av PPARβ /δ øket fosforylert Akt (pakt) på endoteliale progenitorceller [30] og NSCLC-celler [31]. Derfor undersøkte vi om PI3K /Akt veien var involvert i VEGF induksjon PPARβ /S agonister i NSCLC celler. Cellene ble forbehandlet i 2 timer med PI3K inhibitor LY294002 fulgt av GW501516. Pre-inkubasjon med LY294002 i doser som er kjent for å hemme Akt phopshorylation redusert ekspresjon av VEGF og hindret induksjon av VEGF som respons på PPARβ /δ-ligand (fig. 6A). LY294002 hadde en lignende effekt på ADRP. Men den PI3K hemmer ikke blokkere nedregulering av VEGFR1 og VEGFR2 indusert av GW501516. Wortmannin, en potent inhibitor PI3K, hadde lignende effekt på VEGF, ADRP og VEGFRs (Fig. 6A).
(A) H358-celler ble dyrket til konfluens, sultet i 24 timer og deretter inkubert i 2 timer med LY294002 (25 uM) eller Wortmannin (200 nM), etterfulgt av GW501516 (5 uM) i 18 timer. RNA ble ekstrahert og analysert ved RT-PCR. (B) H358 og H441-celler ble inkubert med og uten GW501516 for den angitte tid. Cellelysater ble undersøkt ved immunblotting med antistoffer for total og fosforylert Akt, PTEN og p85α. (C) H358-celler ble transfektert med His-PPARβ /δ eller tom vektor pcDNA3.1 og inkubert med og uten GW501516 i 18 timer. Cellene ble lysert i RIPA buffer og Hans-PPARβ /δ ble revet med Hans-select nikkel affinitet gel. Immunoblotter ble utviklet med antistoffer for PPARβ /δ og p85α. (D) H358-celler ble transfektert med pcDNA3.1, full lengde His-PPARβ /δ (PPARβ /δ 1-441), eller avkortet PPARβ /S beholde den N-terminale del (PPARβ /δ 1-168) og C- terminal del (PPARβ /δ 168-441), lysert i RIPA buffer og under immunoutfelling med anti-p85α antistoff. Immunoblotter av helcellelysater og immunpresipitatene (
midtre og nedre panelet
, henholdsvis) ble utført med antistoffer rettet til p85α, tubulin og Hans-tag. Pilene viser full lengde og avkortede PPARβ /S oppdaget i immunoblotter av helcellelysater og immunpresipitatene.
Topplate
, skjematisk fremstilling av PPARβ /δ struktur og domene organisasjon.
Sammen utgjør disse dataene indikerte at PI3K bidratt til PPARβ /δ mediert induksjon av VEGF. Den fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom 10 (PTEN) er en viktig regulator av PI3K aktivitet [29]. Modulering av PI3K /Akt veien i respons til aktivering av PPAR’er er blitt tilskrives endringer i PTEN nivå. PPARy-agonister øker PTEN med derav følgende hemning av PI3K [32]. På den annen side, aktivering av PPARβ /S redusert PTEN fører til økt pakt [22], [31]. Men når vi behandlet H441 og H358-celler med GW501516 vi ikke observere noen konsekvent endring i PTEN nivå (Fig. 6B). Videre fant vi at GW501516 indusert Pakt på et veldig tidlig tidspunkt. Økt Pakt ble sett i løpet av 1-2 timer etter behandling, og ble opprettholdt i minst 4 timer (Fig. 6B). Total Akt, PTEN og p85α var ikke eller minimalt påvirket på denne tiden, noe som tyder på at endringer i nivået av disse proteinene var usannsynlig å gjøre rede for induksjon av Pakt ved PPARβ /δ agonist.
Flere studier har vist som PI3K kan aktiveres ved fysisk interaksjon av PI3K regulatoriske subenhet p85α med NHRs.
