Abstract
Nyere arbeider med musemodeller av prostatakreft (CAP) har vist at inaktivering av TGFB signalering i prostata epitel kan samarbeide med sletting av
PTEN
tumor suppressor å drive lokalt aggressive kreft og metastatisk sykdom. Her viser vi at inaktivere TGFB veien ved å slette genet som koder for TGFB type II-reseptor (
Tgfbr2
) i kombinasjon med en sletting av
Apc
tumorsuppressorgenet spesielt i mus prostata epitel resulterer i raskt innsettende invasiv Cap. Mikrometastaser ble observert i lymfeknutene og lungene til en andel av de doble mutante mus, mens ingen metastaser ble observert i
APC
enkelt mutante mus. Prostataspesifikt
Apc; Tgfbr2
mutanter hadde en lavere frekvens av metastaser og overlevde betydelig lengre enn
PTEN; Tgfbr2
doble mutanter. Men alle
Apc; Tgfbr2
mutanter utviklet invasiv kreft ved 30 ukers alder, mens invasiv kreft ble sjelden observert hos
Apc
enkelt muterte dyr, selv etter ett års alder. Videre sammenligning av
PTEN Hotell og
APC
modeller av Cap avdekket flere forskjeller, inkludert adenosquamous karsinom i
Apc; Tgfbr2
mutanter som ikke ble sett i
PTEN
modell, og en mangel på robust induksjon av TGFB veien i
Apc
null prostata. I tillegg til å forårsake høyverdig prostata intra-epithelial neoplasi (HGPIN), sletting av enten
PTEN
eller
Apc
indusert senescence i berørte prostata kanaler, og denne tilbakeholdenhet ble overmannet av tap av Tgfbr2 . Oppsummert dette arbeidet viser at TGFB signale begrenser utviklingen av Cap indusert av ulike tumor suppressor mutasjoner, noe som tyder på at TGFfi signale utøver en generell svulst undertrykkende effekt i prostata
Citation. Bjerke GA, Pietrzak K, Melhuish TA , Frierson Jr. HF, Paschal BM, Wotton D (2014) prostatakreft indusert av Tap av Apc er behersket av TGFB signalering. PLoS ONE 9 (3): e92800. doi: 10,1371 /journal.pone.0092800
Redaktør: Kin Mang Lau, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 13 desember 2013; Godkjent: 25 februar 2014; Publisert: 20 mars 2014
Copyright: © 2014 Bjerke et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et program Prosjekt Grant fra National Cancer Institute (2P01CA104106 til B. Paschal og D. Wotton), og av en pilot stipend fra UVA Cancer Center (finansiert fra CCSG P30 CA44579, James og Rebecca CraigFoundation, og UVA kvinner Oncology fond) til D. Wotton. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (CAP) er en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall hos menn, med NCI spår mer enn 230.000 tilfeller og 29.000 dødsfall i USA i 2013 (www.cancer.gov/cancertopics/types/prostata). Flere signalveier er ofte forstyrret i menneskelig Cap, enten ved genetiske endringer eller endringer i uttrykket av sentrale deler av veien [1]. Mutasjon eller sletting av
PTEN
tumor suppressor genet finnes i mer enn 30% av primære humane prostata kreft og mer enn 60% av Cap metastaser [2] – [5]. Tap av
PTEN
lipid fosfataseaktivitet aktiverer PI3-kinase signalveien [6], [7], inkludert aktivering av den nedstrøms Akt /PKB-kinase, som selv er et onkogen [8] – [10]. Akt aktivering fremmer celleoverlevelse ved å hemme apoptose, og også regulerer proliferasjon og cellestørrelse [11], [12].
transformerende vekstfaktor (TGF) p-ligander montere en signalerings kompleks av type I og type II-reseptorer, hvori de type-II-reseptor-fosforylerer og aktiverer type i [13] – [15]. Den aktiverte type I reseptor phosphorylates deretter reseptor Smad (R-Smad) proteiner, som er de viktigste transkripsjonsfaktorer som medierer TGFB familien signalering. Smad2 og Smad3 er de primære R-Smads som reagerer på TGFB signalering. Fosforylerte R-Smads binde Smad4 og akkumuleres i kjernen hvor de regulerer genuttrykk [16]. I mange celletyper, inkludert epitelceller, TGFp signalering via Smad2 /3 bevirker en G1 cellesyklus-stans som forhindrer ukontrollert proliferasjon og spiller en rolle tumorundertrykkende [17], [18]. Den TGFp signalveien blir ofte forstyrret ved mutasjon eller tap av ekspresjon av spredningsveier komponenter i human Cap [19] – [21]. Redusert uttrykk for TGFB type I og type II-reseptorer (kodet av
TGFBR1 Hotell og
TGFBR2
gener) er assosiert med økt Gleason score og redusert overlevelse, og redusert SMAD4 uttrykk er også funnet i avansert menneskelig Cap [19], [22] – [24].
APC product: (
adenomatøs polypose coli
) genet koder for et tumor suppressor som er inaktivert i en stor andel av humane kolorektale cancere [25]. Tap av APC-funksjonen aktiveres nedstrøms komponenter av den kanoniske WNT signalveien [26], [27]. APC fungerer som et stillas som er rettet mot β-catenin for fosforylering og påfølgende proteasomal ødeleggelser. I nærvær av wnt ligander, eller en mutasjon i APC-genet, er β-catenin ikke lengre brytes ned og kan akkumuleres i både cytosol og kjernen, hvor den aktiverer target-genekspresjon primært via interaksjon med TCF /LEF DNA-bindende transkripsjon faktorer [28]. Selv om
APC
genet koder for en stor tumor suppressor genet for tykktarmskreft, og
APC
mutasjoner er funnet i enkelte andre kreftformer, inaktivere mutasjoner i
APC
genet er sjelden i menneskelig Cap [29]. Imidlertid, i de fleste tilfeller av avansert human Cap β-catenin er funnet i kjernen, noe som tyder på at denne veien er ofte de-regulert. Andre mekanismer for aktivering av denne veien har blitt identifisert i humant cap, inkludert metylering av
APC
genet [30], [31]. Aktivering mutasjoner i β-catenin selv (kodet av
CTNNB1
), som hindrer fosforylering og målretting til proteasome, har også blitt identifisert [32]. Mens de-regulering av denne reaksjonsvei synes å være ganske hyppig i human CAP, forblir betydningen av atom β-catenin i initiering av human hetten og progresjon til kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC) som skal belyses.
Nyere arbeider med genmanipulerte musemodeller har begynt å kaste lys over de kombinatoriske effekten av tumor suppressor mutasjoner i prostata kreft progresjon. Prostata-spesifikt sletting av
Tgfbr2 Hotell og
Smad4
gener har begge blitt testet på mus. Heller ikke mutasjonen alene er tilstrekkelig til å igang tumorgenese, men når det kombineres med en
PTEN
sletting, inaktivering av de TGFp reaksjonsveien resulterer i meget hurtig progresjon til lokalt invasive og metastatisk sykdom [33], [34]. Musemodeller der en stabilisert β-catenin transgenet ble uttrykt i prostata resulterte i høy grad prostata intra-epithelial neoplasi (HGPIN) [35], [36]. Sletting av
Apc
genet spesifikt i mus prostata epitel resulterer også i HGPIN med høy penetrans, men dette sjelden utvikler seg til invasiv kreft og metastaser ble ikke funnet [37]. Her viser vi at sletting av både
Tgfbr2 Hotell og
APC
gener i mus prostata epitel resulterer i rask progresjon til invasiv kreft, med metastaser til lymfeknuter og lunger i noen tilfeller. I tillegg viser vi at sletting av enten
Apc
eller
PTEN
alene induserer senescence i prostata kanaler med HGPIN og at ytterligere tap av
Tgfbr2
genet vinner dette senescence sjekkpunkt. I sammendrag, tyder dette arbeidet som TGFp aliserte grenser progresjon fra HGPIN til invasiv prostatakreft, uavhengig av tumoren initiere mutasjonen. Dermed TGFB signalering spiller en nøkkel svulst undertrykkende rolle i prostata epitel
Diskusjon
Dødelig prostatakreft i
Apc
r /r
Resultater og;. Tgfbr2
r /r
mutanter
Homozygot sletting av
Apc
i mus prostata epitel resultater i HGPIN med plateepitel differensiering i alle prostata lapper, selv om det sjelden utvikler seg til lokalt invasiv kreft og metastaser har ikke blitt oppdaget [37]. TGFp signale begrenser utviklingen av prostatakreft initiert ved tap av tumor suppressor PTEN [33], [34]. For å teste om TGFB signalering spiller en tilsvarende rolle i prostata når Apc er tapt, vi brukte musemodeller for å kombinere mutasjoner i
Tgfbr2 Hotell og
Apc
gener. Betingede, loxP-flankert alleler av både
Apc Hotell og
Tgfbr2
gener ble kombinert med
PbCre4
transgenet, som uttrykkes bare i prostata epitel [38]. De rekombinert alleler, generert av prostata epitel spesifikke uttrykk for PbCre4, omtales heretter som
Apc
r /r Hotell og
Tgfbr2
r /r
. Som en første test på om å kombinere
Apc Hotell og
prostatakreft progresjon Tgfbr2
mutasjoner fremmer, vi fulgte en kohort av
Apc
r /r Hotell og
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
mus til ett års alder. I løpet av denne tiden selvfølgelig, ingen av
Apc
r /r
mus viste tegn på stress, mens alle de doble mutanter viste en svulst byrde som kreves dødshjelp før 30 ukers alder (figur 1A) . Til sammenligning har vi også analysert en rekke
PTEN
r /r Hotell og
PTEN
r /r, Tgfbr2
r /r
mus i samme periode. Alle bortsett fra ett av
PTEN
enkelt mutanter levd ett år, mens ingen av de doble mutanter overlevde etter 16 uker, i tråd med vår forrige analyse (figur 1A og [33]). Ved 18 ukers alder, prostata av
Apc
enkelt null mutanter var nesten umulig å skille fra villtype, mens, prostataforstørrelse var åpenbart i
PTEN
nullverdier (Figur 1b). Ved 52 uker,
Apc
null prostatakreft var tydelig, men var fortsatt mye mindre enn de i
Apc; Tgfbr2
dobbel null mus ved 16 ukers alder (figur 1B). Dermed sletting av
Tgfbr2
genet i bakgrunnen for tap av enten
PTEN
eller
APC
hadde en svært signifikant effekt på tumorvekst, og reduserte median overlevelsestid til henholdsvis 82 dager og 148 dager (figur 1A og C). Det var også en betydelig overlevelse forskjell mellom de to doble mutante kombinasjoner som er sannsynlig på grunn av de spesielle veier som berøres av tap av PTEN og Apc.
(A) Kaplan-Meier overlevelseskurver for hver genotype som angitt . Antallet dyr for hver enkelt er vist ovenfor. P-verdier (log-rank test) er vist for
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
versus
PTEN
r /r, Tgfbr2
r /r
, for
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
versus
Apc
r /r
, og for
PTEN
r /r, Tgfbr2
r /r
versus
PTEN
r /r
. (B) Brutto anatomi av prostatakreft er vist for hver på følgende tider: villtype (18 uker),
PTEN
r /r plakater (18 uker),
PTEN
r /r, Tgfbr2
r /r plakater (13 uker),
Apc
r /r
(18 og 52 uker), og
Apc
r /r ; Tgfbr2
r /r plakater (15 uker). (C) Overlevelses data for hver av de doble nullpunkter er vist, sammen med en oppsummering av metastaser til lumbale lymfeknuter (LN) og lunge. Andelen av mus med metastaser er vesentlig forskjellig, sammenligne
PTEN
r /r, Tgfbr2
r /r Hotell og
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
grupper i C (p 0,01).
Vi har tidligere funnet ut at en relativt høy andel (~ 66%) av
PTEN
r /r; Tgfbr2
r /r
mus utviklet metastaser til de lumbale lymfeknuter eller lunge [33]. I denne studien ble mikrometastaser funnet i lumbar lymfeknuter av 18% av
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
mus, og i lungene til 12% av
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
mus. Dermed metastaser i
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
mus var signifikant mindre hyppig (p 0,01) enn i
PTEN
r /r; Tgfbr2
r /r
mutanter undersøkt her, og i vår forrige analyse (figur 1C). Vi har aldri observert metastaser i
APC
r /r
enkelt mutante mus, selv etter ett år, og bare én av fjorten
APC
r /r
mus analysert på enten 36 eller 52 ukers alder viste tegn til lokalt invasiv kreft. Disse data viser tydelig at kombinasjonen av mutasjoner i
Apc Hotell og
Tgfbr2
gener kan akselerere tumorprogresjon til invasiv og metastatisk sykdom over at sett med tap av
Apc
alene .
Inaktivering av TGFfi signalering, enten ved sletting av
Tgfbr2
eller
Smad4
, akselererer utviklingen av
PTEN
null CAP, og
Tgfbr2
sletting har også vist seg å samvirke med en konstitutivt aktiv Akt transgenet for å drive invasiv kreft [33], [34]. Ekspresjon av en dominant negativ TGFp type II reseptor transgenet i prostata var i stand til å øke graden av tumorer som initieres av prostata spesifikt ekspresjon av T-antigen, og resulterte i økte metasases [39]. I hvert tilfelle blir progresjon til invasive og metastatisk sykdom akselerert ved tap av TGFfi signalering, også når den initierende mutasjonen ikke på egen hånd resultat i metastaser, som vist her med
APC
mutanter. I sammendraget, resultatene av disse musemodeller av CAP sammen med de data som presenteres her tyder på at TGFB signale spiller en stor svulst undertrykkende rolle i Cap
Adenosquamous carcinoma in
Apc
r /r.; Tgfbr2
r /r
mutant prostata
på grunn av forskjellene i overlevelse og i brutto utseende av svulstene fra
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r Hotell og
PTEN
r /r, Tgfbr2
r /r
mus vi utført en mer detaljert sammenligning av disse svulstene, samt av prostata fra enkelt null mutanter. Som tidligere rapportert, gjorde histologisk analyse avdekket ingen forskjeller mellom villtype og
Tgfbr2
null prostata (figur 2 og [33]). Sammenligning av
PTEN Hotell og
Apc
enkle mutanter avslørt HGPIN i prostata i begge genotyper, med plateepitel differensiering i
Apc
null som ikke ble sett i
PTEN
null. Innføring av en
Tgfbr2
mutasjon førte til progresjon til dårlig differensiert adenokarsinom (PDA) i alt
PTEN; Tgfbr2
doble mutanter. Når det kombineres med
Apc
mutasjon, sletting av
Tgfbr2
genet i prostata resulterte i progresjon til invasiv kreft, selv om de fleste av
Apc
r /r; Tgfbr2
r /r
svulster beholdt plateepitel fenotype sett i
Apc
enkeltnullverdier (figur 2). Legg merke til fremtredende foci av keratin i
Apc
null HGPIN (pil, figur 2) og adenosquamous differensiering angitt i
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
svulst vist i figur 2 (pilspisser). I tillegg til det histologiske utseende, økt ekspresjon av keratin 1 og 10 har blitt brukt som en markør for differensiering squamous i
APC
null prostata [40]. Vi har derfor farget deler av villtype og mutant prostata for keratin 10. Som vist i figur 3, sterk farging for Krt10 ble observert i celler som ligger til grunn for den prominente foci av keratin til stede i
APC
r /r
HGPIN, med lite eller ingen flekker tydelig i villtype,
Tgfbr2
null eller
PTEN
null prostata. I
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
svulster store regioner av Krt10 positive celler var tilstede hele svulsten, mens i
PTEN; Tgfbr2
doble mutanter bare sjeldne spredte Krt10 positive celler ble sett (figur 3)
H . E farget seksjoner er vist for de seks angitte genotyper, hentet fra mus ved følgende aldre. Pil viser keratin innskudd i
Apc
r /r
, og pilspisser indikerer et område på adenosquamous differensiering i
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
prostata. Wild Type: 21 uker,
PTEN
r /r
: 22 uker,
Apc
r /r
: 36 uker,
Tgfbr2
r /r product:: 70 uker,
PTEN
r /r, Tgfbr2
r /r
: 11 uker, og
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
: 17 uker. Bilder tatt på 10 × og 40 × forstørrelse vises.
prostates av de angitte genotypene ble analysert ved IHC for Keratin 10, som en markør for squamous differensiering. Aldre er som i figur 2.
For å bedre sammenligne frekvensene av fenotyper som er beskrevet ovenfor vi samlet data om de dominerende fenotyper i hver genotype som scoret i en blindet måte basert på etablerte muse prostata fenotyper [41 ] – [43]. I
APC
r /r
mus fleste prostata analysert ved 8-24 ukers alder hadde HGPIN med squamous differensiering (adenosquamous HGPIN, ASQ-HGPIN) og etter 36-52 uker hadde denne fenotype (Figur 4A). Bare én av de
Apc
nuller utviklet regioner av lokalt mikro-invasiv kreft (36 uker), og dette var betydelig mindre hyppig (p 0,02) enn forekomsten av invasiv kreft i
PTEN
r /r
mus i 36-52 uke aldersgruppe (figur 4A). Sammenligning av
Tgfbr2
sammensatte mutanter viste at alt
PTEN
r /r, Tgfbr2
r /r
mus hadde PDA uten plateepitel differensiering, mens alle unntatt én av de
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
mus avlives for tumorbyrde hatt omfattende adenosquamous karsinom (figur 4B). Vi har også sammenlignet fenotyper hos mus med middels genotyper, der en eller annen mutasjon var heterozygot (noen av de
PTEN
+ /r, Tgfbr2
r /r Hotell og
PTEN
r /r, Tgfbr2
+ /r
mus inkludert i denne fenotype sammendraget ble analysert for å overleve i ref [33]). For denne analysen ble mus analysert når tumorbyrden ble for mye, eller når mus nådd minst ett års alder. Dette viste at hyppigheten av invasiv kreft var signifikant høyere i
PTEN
r /r, Tgfbr2
+ /r
enn i
Apc
r /r, Tgfbr2
+ /r
mus (p 0,05), og i
PTEN
+ /r, Tgfbr2
r /r
enn i
Apc
+ /r; Tgfbr2
r /r
prostata (p 0,001), støtter ideen om at tapet av
PTEN
resulterer i en mer aggressiv fenotype enn tap av
Apc plakater (figur 4B).
(A) fenotyper av
Apc
r /r Hotell og
PTEN
r /r
mus vises, gruppert etter to aldersgrupper: 8 24 uker og 36 til 52 uker. Alle dyr som ble analysert hadde noen prostata svulst fenotype, som er klassifisert som Focal PIN, HGPIN, eller HGPIN med adenosquamous differensiering (ASQ-HGPIN). Dyr med mikro-invasiv kreft og ASQ-HGPIN eller en blanding av HGPIN og PDA er gruppert separat. Antall dyr analysert vises over hver kolonne, og fordelingen av fenotyper er vist i prosent. Andelen av dyr med noen tegn på invasiv kreft på 36-52 uker, er signifikant forskjellig mellom de to genotyper (p 0,02). (B) Antallet mus med hver fenotype er vist for dyr med forskjellige kombinasjoner av mutasjoner i begge
Apc Hotell og
Tgfbr2 plakater (ovenfor), eller i begge
PTEN
og
Tgfbr2 plakater (nedenfor). For hver genotype antall dyr med hverandre fenotype er vist. Normal – ingen svulst fenotype tydelig. HGPIN og adenosqamous HGPIN – omfattende HGPIN uten tegn på invasjon. PDA og adenosqamous carcinoma – omfattende lokalt invasiv kreft. Alle mus ble avlivet på mer enn ett år, med mindre de måtte ofres for tumorbyrde i yngre alder. Det ble observert signifikant flere dyr med invasiv kreft i
PTEN
r /r, Tgfbr2
+ /r Hotell og
PTEN
+ /r, Tgfbr2
r /r
grupper enn i
Apc
r /r, Tgfbr2
+ /r Hotell og
Apc
+ /r, Tgfbr2
r /r
grupper (14/14 vs 2/4; p 0,05, og 15/17 vs 0/6, p 0,001). En av de
Apc
r /r, Tgfbr2
+ /r
mus (scoret som PDA) hadde bare små invasive foci. Alle andre hadde omfattende lokal invasjon hvis scoret som PDA eller ASQ-karsinom.
I sammendraget, antyder denne analysen at fenotyper observert er ganske spesifikk for hver prostatakreft modell, og at det innenfor hver modell er det liten variasjon i tumortype. For alle kombinasjoner testet
PTEN
mutasjon fører til en mer aggressiv, invasiv kreft enn
Apc
sletting. Interessant, ingen av
Apc
heterozygoter utviklet svulster, selv i nærvær av en homozygot delesjon av
Tgfbr2
, mens flertallet av
PTEN
heterozygoter utviklet PDA hvis de var null for
Tgfbr2
. Dette er konsistent med inaktivering av de resterende
PTEN
allele, som har blitt foreslått å være en stor rute der
PTEN
heterozygote mus prostata utvikle en fenotype [44]. TGFp signale ser ut til å hemme progresjonen av HGPIN til både dårlig differensiert adenokarsinom og til adenosquamous karsinom, med den forskjell i fenotypen er avhengig av tumor initiering mutasjonen. Mens atom akkumulering av β-catenin er funnet i en høy andel av menneskelig cap, er det ingen enighet om hvordan APC /β-catenin veien kan bli forstyrret i menneskelig Cap. Den plateepitel differensiering indusert av tap av
Apc
er relativt sjelden i menneskelig cap, selv om det er mer vanlig etter androgen deprivasjon terapi [45]. Tilstedeværelsen av adenosquamous carcinoma in
Apc; Tgfbr2
doble nullverdier tilsier at tap av TGFB signale ikke hindrer plateepitel differensiering indusert av tap av
Apc
. Tilsvarende, kan kombinasjonen av en
PTEN
mutasjon med en stabilisert β-catenin transgenet i prostata resultater i tumorer med skvamøs differensiering, noe som tyder på at dette kan være den dominerende fenotypen til tidlig aktivering av β-catenin [40]. Kanskje den økte kjernefysisk β-catenin sett i avansert menneskelig Cap er et senere fenotype, eller skjer til et lavere nivå enn sett med transgen manipulasjon hos mus, og kan derfor ikke kjøre plateepitel differensiering.
Økt stroma og invasiv kreft med
Tgfbr2
sletting
Undersøkelse av seksjoner farget med H E avdekket bevis for lokalt invasiv kreft, med økt stroma i både
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r Hotell og
PTEN
r /r, Tgfbr2
r /r
prostata. For å visualisere utvidelse av stroma, beiset vi seksjoner med Masson er Trichrome. I villtype og
Tgfbr2
null prostata, kanalstrukturen var like, og det var minimal bindevev mellom prostatic kanalene. I områder med HGPIN i
PTEN
r /r
dyr var det fokusområder for økt fibrose og i
Apc
null betydelig fibrose ble sett mellom kanaler med HGPIN (figur 5). I områder av invasiv kreft både i
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r Hotell og
PTEN
r /r, Tgfbr2
r /r
prostata, økt fibrose var til stede, og dette var spesielt tydelig i
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
mus (figur 5)
.. Massons Trichrome farget prostata seksjoner er vist, fra mus ved følgende aldre. Wild Type: 25 uker,
PTEN
r /r
: 18 uker,
Apc
r /r
: 36 uker,
Tgfbr2
r /r product:: 18 uker,
PTEN
r /r, Tgfbr2
r /r
: 12 uker, og
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
. 17 uker
Vi neste undersøkt fordelingen av kanalstrukturen i hver av de to prostatakreft modeller. Farging for kollagen IV, som en markør for basalmembran integritet, viste at basalmembran var intakt i både villtype og
Tgfbr2
null prostatakjertler. I
Apc Hotell og
PTEN
mutanter (på 36 og 21 ukers alder henholdsvis), var det minimal basalmembran sammenbrudd rundt gang med HGPIN (figur 6). Alderen på disse musene er godt utover midtoverlevelsestider av 21 og 12 uker for hvert av de doble mutanter. I motsetning til undersøkelse av doble mutante dyr som ble avlivet på grunn av tumorbelastning viste fullstendig nedbrytning av basalmembran i områder av invasiv kreft (figur 6). For å undersøke invasiv fenotype, farget vi seksjoner for Foxa1, som en epitelial markør, og for Sma å identifisere de stromale celler. I både villtype og
Tgfbr2
null, prostata kanaler ble helt omsluttet av Sma positive stromale celler. Selv om det var klare bevis for HGPIN i
Apc Hotell og
PTEN
null prostata, i de fleste tilfeller kanalene var fortsatt omgitt av Sma-positive stroma i alderen betydelig større enn median overlevelsestider de doble mutanter (figur 7). I motsetning, i
Apc
R /R; Tgfbr2
r /r Hotell og
PTEN
R /r, Tgfbr2
r /r
dyrene, tydelig skille mellom stroma og kanalene har tydelig brutt ned, som kanalen struktur er ikke lenger tydelig ved overgang til invasiv kreft (figur 7). Samlet utgjør disse analysene tyder på at selv om det er noen forskjeller i histologisk type kreft initiert av tap av PTEN eller APC, den ekstra inaktivering av TGFB veien forårsaker rask progresjon til lokalt invasiv kreft.
Indirekte immunfluorescens er vist for β-catenin (grønn) og kollagen IV (rød) på deler av prostata fra mus av de angitte genotypene. Wild Type: 21 uker,
Tgfbr2
r /r
: 44 uker,
PTEN
r /r
: 21 uker,
PTEN
r /r ; Tgfbr2
r /r
: 11 uker,
Apc
r /r
: 36 uker, og
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
. 24 uker gammel
FoxA1 (rød) og Sma (grønn) farging er vist ved indirekte immunfluorescens på deler av prostata fra mus av de angitte genotypene. Ages av mus er som i Figur 6.
For å teste for bevis av epitelial til mesenchymale overgang (EMT) vi undersøkt uttrykk for E-cadherin og vimentin. TGFp-signalering er et vel kjent driver av EMT og økt TGFp signale ofte resulterer i økt ekspresjon vimentin og en reduksjon i E-cadherin uttrykk, som kan bidra til nedbrytning av epiteliale celle veikryss og en invasiv fenotype [46]. Som vist i figur 8, er E-cadherin robust uttrykk og nåtid på celle periferien i de fleste av epitelceller i
Apc Hotell og
PTEN
enkelt mutanter. E-cadherin uttrykk vises fortsatt i stor grad normal i
PTEN
r /r, Tgfbr2
r /r
mus, til tross for den klare nedbryting av kanalstruktur. Noen bevis for E-cadherin de-lokalisering fra cellemembranen ble sett i
Apc
r /r, Tgfbr2
r /r
prostata, sammen med en reduksjon i samlet signal i forhold til
Apc
r /r
. Men selv i de to doble mutante prostata, epiteliale celler veikryss synes å være stort sett intakt med klar E-cadherin farging (figur 8). Vimentin farging viste liten endring i de epitelceller i noen av mutanter, selv om det var noen økt vimentin uttrykk i stroma av
Apc Hotell og
PTEN
enkelt null og
Apc; Tgfbr2
dobbel null prostata (figur 8). Disse data tyder på at selv om svulstene i
PTEN, Tgfbr2 Hotell og
Apc; Tgfbr2
doble nuller er invasiv og kan metastasere, dette ikke er ledsaget av en stor skala EMT fenotype. Med den rollen TGFp signalering i kjøre EMT, kan det forventes at dobbeltnull tumorene ikke ville ha nedregulert E-cadherin og oppregulert vimentin, som de har mistet en nøkkelkomponent i TGFp signaltransduksjonsbane. Disse resultatene gjør, men la åpne spørsmålet om hvordan disse svulstene blir metastatisk. En mulighet er at sjeldne epitelceller i svulsten har gjennomgått EMT, antagelig drevet av en annen enn TGFB signal. En annen interessant mulighet er at de doble null epitelcellene gjennomgå en eller annen form for kollektiv invasjon, hvori små grupper av epitelceller blir invasiv og bevegelige, og samtidig opprettholde sin celle veikryss. Denne type invasjonen har vært å tiltrekke mer interesse som en potensiell sjåfør for metastasering [47], [48], og det vil nå være av interesse å undersøke hvordan svulstene undersøkt her bli invasiv og metastatisk.
prostates av de angitte genotyper, valgt for å være representative for den mest vanlige fenotypen av hver, ble analysert ved indirekte immunofluorescens for E-cadherin (rød) og vimentin (grønn). Ages er som følger, villtype: 21 uker,
PTEN
r /r
: 45 uker,
Apc
r /r
: 52 uker,
Tgfbr2
r /r
: 70 uker,
PTEN
r /r, Tgfbr2
r /r
: 12 uker, og
Apc
r /r; Tgfbr2
r /r
. 23 uker
Apc
sletting aktiverer ikke TGFB signalering i prostata
sletting av
PTEN
i mus prostata initierer tumorigenesis og induserer aktiviteten av TGFp veien [33], [34]. Tilsvarende uttrykk for en konstitutivt aktiv
akt1
transgenet i prostata epitel øker TGFB signaliserer [33], noe som tyder på at Akt aktivering, som oppstår nedstrøms PTEN tap, er tilstrekkelig til å aktivere denne veien. Gitt at sletting av
Tgfbr2
genet tillatt for progresjon fra HGPIN til invasiv kreft i
Apc
null prostata, undersøkte vi om TGFB veien ble indusert i denne modellen. Sletting av enten
Apc
eller
PTEN
resulterte i liten endring i det totale β-catenin nivåer, mens phospho-Akt nivåene økte spesielt i
PTEN
null prostata (figur 9 ). For å teste om TGFB veien ble påvirket av
Apc
sletting, vi først analysert nivåer av TGFB type II reseptor og den intracellulære mekler, Smad4. Mens begge ble betydelig økt i
PTEN
null, var det ingen signifikant økning i enten Smad4 eller Tgfbr2 nivåer i
Apc
mutant prostata sammenlignet med de fra villtype mus (figur 9). Som en indikasjon på vei aktivering, vi neste analysert nivåer av Smad2 fosforylert ved karboksylterminale seriner som er et substrat for type I TGFp-reseptorer. Fosfor-Smad2 ble betydelig økt i
PTEN
null, men ikke i
Apc
null prostata, noe som indikerer at veien aktivering skjer med tap av PTEN, men ikke med tap av Apc. Induksjon av TGFp signalering ved
PTEN
sletting kan være drevet av signaloverførings hendelser nedstrøms for Akt-aktivering, eller kan være en konsekvens av den type av differensiering i denne modellen – dårlig kjertel differensiering i
PTEN
null snarere enn plateepitel differensiering sett med
Apc
sletting. Men det klare samarbeids effektene av
Apc Hotell og
Tgfbr2
sletting tyder på at selv lave nivå av basal TGFB signale stede i
Apc
muterte tumorer er viktig for besøksforbud kreft progresjon til lokalt invasiv og metastatisk sykdom.
Western blot er vist av lysatene fra de ventrale prostata av tre villtype, 3
Apc
r /r Hotell og 3
PTEN
r /r
mus som angitt.
