Abstract
metastatisk nyrekreft manifesterer flere signaturer av genuttrykk. Avvik i uttrykket av modne miRNAs har vært knyttet til kreft hos mennesker. Viktigheten av MIR-21 i nyrecellekarsinomer foreslås fra profilerings studier med svulst vevsprøver. Imidlertid er rollen til mir-21 funksjon i å forårsake nyrekreftcelleformering og invasjon ennå ikke er vist. Ved hjelp av dyrkede nyrekreft celler, viser vi forbedret uttrykk for modne MIR-21 sammen med pre-og pri-MIR-21 ved økt transkripsjon i forhold til normal proksimale tubulære epitelceller. Overekspresjon av MIR-21 Sponge å slukke endogene MIR-21 nivåer hemmet spredning, migrasjon og invasjon av nyrekreftceller. I fravær av mutasjon i PTEN tumor suppressor genet, er PTEN protein nivåer ofte nedregulert av nyrekreft. Vi viser at Mir-21 mål PTEN mRNA 3’untranslated regionen for å redusere PTEN protein uttrykk og forsterker Akt fosforylering i nyrekreftceller. Nedregulering av PTEN samt overekspresjon av konstitutivt aktiv Akt kinase forhindret MIR-21 Sponge-indusert hemming av nyrekreft celleproliferasjon og migrasjon. Videre viser vi at MIR-21 Sponge inhiberte inaktivering av fosforyleringen av tumor suppressor protein tuberin og dempes TORC1 aktivering. Til slutt viser vi at uttrykket av konstitutivt aktiv TORC1 dempes MIR-21 Sponge-mediert hemming av proliferasjon og migrasjon av nyrekreftceller. Våre resultater avdekke et lag av post-transcriptional regulering av PTEN av transcriptional aktivering av MIR-21 for å tvinge den kanoniske onkogene Akt /TORC1 signaliserer kanal for å drive nyrekreftcelle spredning og invasjon
Citation. Dey N, Das F, Ghosh-Choudhury N, Mandal CC, Parekh DJ, Block K, et al. (2012) mikroRNA-21 regulerer TORC1 Activation i nyre kreftcelle spredning og invasjon. PLoS ONE 7 (6): e37366. doi: 10,1371 /journal.pone.0037366
Redaktør: Soumitro Pal, Barnesykehuset i Boston Harvard Medical School, USA
mottatt: 22 desember 2011; Godkjent: 20 april 2012; Publisert: 04.06.2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering: a. USA National Institutes of Health (NIH) RO1 DK50190 tilskudd til GGC støttet dette arbeidet. En del av dette arbeidet ble også støttet av VA Research Service Merit omtale tilskudd til GGC. GGC støttes også av Juvenile Diabetes Research Foundation 1-2008-185 tilskudd og er mottaker av VA Seniorforsker Karriere Scientist Award. NGC er støttet av VA Merit Review, NIH RO1 AR 52425 tilskudd og Ronald P. Williams Ortopedisk Oncology utviklingspsykologi Award fra Cancer Therapy and Research Center, San Antonio, Texas. KB, BSK og HEA er støttet med tilskudd, NIH RO1 CA 131272 (KB), NIH RO1 DK 077295 (BSK), NIH RO1 DK078971 (HEA), NIH Rc2a 036613 (BSK) og VA Research Service Karriere Scientist Award (KB) og Merit anmeldelse Awards (KB, BSK og HEA)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nyrecellekarsinom representerer den mest vanlige. nyre kreft; ca 70 000 nye tilfeller er rapportert i år 2011 (www.cancer.gov). Blant de fem undergrupper, klarcellet nyrekreft (RCC) står for ca 70% av tilfellene [1]. Omtrent 30% av pasienter med RCC utvikle invasiv sykdom som vanligvis metastasering til ben, lunge, hjerne og lever [2], [3]. Tap av VHL (von Hippel-Lindau) proteinekspresjon grunn av kimlinje-mutasjoner, biallellic somatisk mutasjon eller hypermethylation av dets gen locus utgjør en høy risiko for store celle nyrekarsinom, hemangiomas og feokromocytomer [4], [5]. Defekt VHL ekspresjon fører til stabilisering av Hifα transkripsjonsfaktorer som bidrar til den økte ekspresjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) for å opprettholde vaskulær natur av tumoren. Dessuten regulerer Hifα anaerob respirasjon ofte funnet i RCC [5]. Hifα-uavhengig funksjon av VHL er rapportert i kjørenyrekreft, inkludert regulering av senescens [5], [6]. Videre VHL positiv nyresvulster utnytte alternative mekanismer for å øke Hifα transkripsjonsfaktorer for VEGF uttrykk, og, Hifα uavhengig vekstfaktor reseptor oppregulering [5], [7].
mirnas er korte kodende oligonukleotider med ufullkommen komplementaritet overveiende til den 3’untranslated region (UTR) av mål-mRNA [8], [9], [10]. Nesten 1000 mirnas i mennesker regulere ekspresjonen av en tredjedel av det totale protein-kodende transkriptomet ved posttranskripsjonelt og translasjonelle nivå [9]. mirnas hovedsakelig virker ved å inhibere mRNA oversettelse selv om mRNA degradering og mRNA, kan spaltingen også bidra til nedregulering av proteinnivåer. Upassende ekspresjon av mirnas har vært knyttet til onkogenesen [10], [11]. mirnas er kodet av intronic og intergeniske samt ekson-sekvenser i genomet [12]. De syntetiseres hovedsakelig ved RNA polymerase II-avhengig transkripsjon for å fremstille pri-miRNA hårnål, som binder drosha /DGCR8 kompleks. Den dobbelt-trådet RNA-bindende protein DGCR8 gjenkjenner de proksimale baser (~ 10 bp) av pri-miRNA stammen etterfulgt av dens spaltning av det RNase III enzymet drosha for å frigjøre den pre-miRNA kort hårnål [13]. Exportin-5 og sin partner Ran-GTP indusere kjernefysiske eksport av pre-MIR til cytoplasma hvor det er behandlet av dicer RNase III /TRBP å gi ~22 nucleotide små RNA duplex. Førings tråd blir deretter inkorporert inn i effektor argonaute kompleks for dannelse av RISC (RNA-indusert demping kompleks) og til å binde seg med ufullkommen komplementaritet til mRNA for translasjonsbevegelse undertrykkelse [12].
Nylige rapporter har etablert et fast rolle spesifikk miRNA signatur i nyre tumorigenesis. Profilerings eksperimenter viste at flere mirnas er nedregulert i RCC enn oppregulert [14], [15], [16], [17]. For eksempel, i en første skjermbildet av 470 miRNAs ble bare seks mirnas funnet å være oppregulert i RCC mens 15 ble nedregulert [16]. I en annen studie ble det bare to mirnas økt i RCC inkludert Mir-21, mens uttrykket av 17 miRNAs ble redusert [17]. Tilsvarende er en mer fersk rapport viste økt uttrykk av MIR-21 mellom 9 mirnas mens uttrykket av 26 miRNAs ble undertrykt [14]. Nylig har en omfattende studie ved hjelp av et stort antall cancerprøver fra 31 forskjellige faste tumorer er beskrevet en betydelig økning i MIR-21 antyder dets funksjon i onkogenesen [18]. Imidlertid har det funksjonelle rolle i mange kreftformer, inkludert nyrekarsinom ikke blitt klarlagt. I denne studien finner vi økt uttrykk av moden, pre- og pri-MIR-21 i nyrekreftceller sammenlignet med normale proksimale tubulære epitelceller. Denne økningen i MIR-21 var assosiert med reduserte PTEN nivåer. Nøytralisering av MIR-21 hindret spredning, migrasjon og invasjon av disse cellene samtidige med økt PTEN og redusert tuberin fosforylering og mTORC1 aktivering.
Resultater
økt uttrykk av MIR-21 i nyrecellekarsinom
miRNA uttrykket profilering ved hjelp av tumorprøver fra pasienter med nedsatt carcinoma har blitt rapportert. I tre studier, ble ekspresjonen av MIR-21 funnet å være økt [14], [17], [19]. Men i en annen studie i 16 klarcellet nyrekreft og 4 chromophobe nyrekreft prøver, MIR-21 ble ikke oppdaget [16]. Vi brukte et panel av tumorvev fra klar celle renale karsinomer for å påvise ekspresjon av modent MIR-21. Sanntid QRT-PCR avslørte betydelig økt uttrykk av moden MIR-21 i alle klasse 2 (3 av 3) og klasse 3 (3 av 3) nyrecellekarsinom prøver (fig. S1 A og S1B). Deretter undersøkte vi ekspresjonen av MIR-21 i ACHN renal karsinom celler. Vi har funnet signifikant økt ekspresjon av modent MIR-21 i ACHN-celler sammenlignet med de HK2 normale proksimale tubulære epitelceller (Fig. 1A). Lignende resultater ble oppnådd i en annen nyrecancercellelinje Caki-2 (fig. S2). Nylige rapporter viser at MIR-21 er regulert ved nivået for modning [20]. Derfor har vi undersøkt nivåene av pre-MIR-21. Sanntid QRT-PCR viste tydelige uttrykk for pre-MIR-21 i ACHN celler sammenlignet med HK2 celler (Fig. 1B). Tilsvarende økte ekspresjon av pri-MIR-21 ble også påvist i de ACHN-celler (fig. 1C). Denne økningen i pri-MIR foreslo en transkripsjonen mekanisme MIR-21 uttrykk. Til direkte undersøke transcriptional regulering av MIR-21 uttrykk, brukte vi en MIR-21 promoter-drevet ildflue luciferase reporter konstruksjon (MIR-21-Luc). Forbigående transfeksjon forsøk i ACHN-celler avslørte betydelig økt transkripsjon av rapportørgenet (fig. 1 D). Disse resultatene tyder på at økt nivå av modne MIR-21 i nyrekreft celler kan skyldes økt transkripsjon av MIR-21 genet for å produsere pri-mir-21
(A – C). Totalt RNA fra HK2 proksimale tubulære epitelceller og ACHN nyrekreftceller ble anvendt for å detektere modne MIR-21 (panel A), forhånds-21 MIR (panel B) og pri-MIR-21 (panel C) av sanntids-QRT-PCR som beskrevet i Materialer og metoder. Gjennomsnitt ± SE av 4 målinger er vist. I panelene A og B, * p = 0,004 vs HK2 celler. I panel C, * p = 0,02 vs HK2 celler. (D) HK2 og ACHN celler ble transfektert med MIR-21-Luc reporter sammen med Renilla null plasmid. Cellelysatene ble anvendt for å bestemme luciferase-aktivitet som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Gjennomsnitt ± SE av 6 målinger er vist. * P = 0,001 vs HK2 celler. (E) Økt fosforylering av p65 NFkB hos nyrekreftceller. Lysates av HK2 og ACHN celler ble immunoblottet med fosfor-P65 (Ser-536), P65 og aktin antistoffer. (F) Mutant p65 S536A hemmer MIR-21 transkripsjon. ACHN nyrekreftceller ble transfektert med MIR-21-Luc og p65 S536A ekspresjonsvektor. Luciferaseaktiviteten ble bestemt i cellelysatene. Gjennomsnitt ± SE av kvadruplikeres målinger er vist. * P = 0,02 vs vektor. Bunnfeltene viser ekspresjon av HA-merket p65 S536A og aktin.
Transkripsjon av MIR-21-genet har nylig blitt vist å være regulert av NFkB [21]. NFkB er oppregulert i nyrekreft [22], [23]. Den transkripsjonelle aktivitet av p65-subenheten av NFkB er avhengig av dets fosforylering i Ser-536 [24]. Derfor undersøkte vi fosforylering av p65. Som vist på fig. 1E, fosforylering av p65 i Ser-536 var signifikant økt i de renale ACHN-kreftceller i forhold til de HK2 cellene. Videre forbedret P65 nivåer ble også observert (Fig. 1E, midtre panelet). Deretter testet vi involvering av NFkB i transkripsjon av MIR-21 i nyrekreftceller. MIR-21-Luc reporter ble kotransfektert med enten S536A mutant av p65 eller med et vektor-plasmid. Uttrykk av p65 S536A hemmet reporter aktivitet i ACHN celler betydelig. Disse dataene indikerer at oppregulering av MIR-21 kan delvis skyldes økt NFkB aktivitet i nyrekreftceller.
MIR-21 Regulerer spredning og invasjon av nyrekreftceller
MIR-21 er ansett å være en onko-Mir i mange kreftformer. Imidlertid har sin rolle i nyrecellekarsinom ikke blitt utforsket. Derfor, testet vi involvering av MIR-21 i mitogenese av ACHN-celler, ved hjelp av en plasmid vektor som uttrykker syv kopier av bulet MIR-21 bindingssete plassert i 3′-enden av CMV-promoter-drevet GFP-mRNA (fig. S3) [ ,,,0],25]. Uttrykk av denne konstruksjonen fungerer som en «svamp» som slukker nivåene av endogent MIR-21 [25], [26]. ACHN celler ble transfektert med denne konstruksjonen (MIR-21 Sponge). DNA-syntese ble målt som
3H-tymidin inkorporering. Uttrykk av MIR-21 Sponge betydelig hemmet DNA-syntese i ACHN celler (Fig. 2A og S4A fig.). For å bekrefte denne observasjonen, utførte vi proliferasjonsanalyse ved å telle antallet celler etter transfeksjon MIR-21 svamp. Uttrykk av MIR-21 Sponge trykkes cellevekst (Fig. 2B og S4B fig.).
ACHN celler ble transfektert med MIR-21 Svamp eller vektor plasmider. (A) Serum-sultet celler ble inkubert med
3H-tymidin og dens inkorporering i DNA ble bestemt som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder [115]. Gjennomsnitt ± SE av 12 målinger er vist. * P = 0,004 vs vektor alene. (B) Cellene ble tellet ved angitte tidsperioder, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Diamond og firkantede symboler representerer vektor og Mir-21 Sponge-transfekterte celler, henholdsvis. Betyr ± SE av tredoble målinger er vist. * P 0,05 vs vektor alene. (C) Serum-sultet celler ble sådd på membranen i en trans-brønn kammer. Migrasjon Analysen ble utført, og de migrerte celler på den motsatte side av membranen ble farget som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder [111]. (D) De flekker i de migrerte cellene i panel C ble eluert som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder [111]. Gjennomsnitt ± SE av tredoble målinger er vist. * P 0,0001 vs vektor-transfekterte celler. (E) Transfekterte serum-sultet celler ble sådd på kollagen innleiret membran i en trans-brønn kammer. Invasjon Analysen ble utført, og den invaderte celler på den motsatte side av membranen ble farget som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder [111]. (F) Flekker i invaderte celler i panelet E ble eluert som beskrevet i Materialer og metoder [111]. Gjennomsnitt ± SE av tredoble målinger er vist. * P. 0,001 vs vektor-transfekterte celler
Nyrecellekarsinom er ofte svært metastatisk. Vi testet om Mir-21 styrer ACHN celle migrasjon ved hjelp av trans-brønn kammer analysen. Celler dyrket i et serumfritt medium på toppen av membranen overføres til bunnen av membranens (fig. 2C, panel A). Uttrykk av MIR-21 Sponge hindret migrasjon av ACHN celler (Fig. 2C og S4C fig.). Kvantifisering av disse resultatene viser signifikant hemming av migrasjon av nyrekreftceller i respons til Mir-21 Sponge (Fig. 2D).
Det første trinnet i metastase består av lokale invasjon av kreftceller (intravasation). For å undersøke metastatisk potensial for ACHN nyrekreftceller, ansatt vi en invasjon analyse ved hjelp av kollagen-embedded membraner i trans-brønner. Vector-transfektert ACHN celler viste markant invasjon (Fig. 2E, panel a). Uttrykk av MIR-21 Sponge blokkert invasjonen av tumorceller (Fig. 2E og Fig. S4D). Kvantifisering viste signifikant hemming av invasjonen av ACHN celler ved MIR-21 Sponge (Fig. 2F).
Mir-21 Targets PTEN i nyre kreft celler
Mutasjon i PTEN tumor suppressor gen eller sin reduserte uttrykket bidra til tumorgenese og metastasering av mange kreft [27], [28]. Imidlertid er PTEN mutasjon ikke ofte funnet i nyrecellekreft [29]. PTEN har blitt validert for å være et mål av MIR-21 [30]. Vi undersøkte nivåene av PTEN i ACHN nyrekreftceller. Som vist på fig. 3A, overflod av PTEN i ACHN ble betydelig redusert sammenlignet med den i HK2 celler. Identiske resultater ble oppnådd i Caki-2 renal karsinom-cellelinje (Fig. S5a). PTEN reduserer nivåene av PIP
3, som kontrollerer fosforylering /aktivering av Akt [27], [31], [32]. Redusert PTEN nivåer i ACHN og Caki-2-celler var assosiert med økt fosforylering av Akt på Thr-308 og Ser-473 (Fig. 3B og S5b fig.), Noe som indikerer dens aktivisering [32].
(A ) De lysater av celler fra tre uavhengige brønner HK2 og ACHN-celler ble immunoblottet med PTEN og actin-antistoffer. (B) De samme cellelysatene ble immunoblottet med fosfor-Akt (Thr-308), fosfo-Akt (Tjen-473) og Akt antistoffer.
Neste, vi undersøkt om Mir-21 mål PTEN . Vi brukte en reporter konstruksjon der 3’UTR av PTEN mRNA er klonet nedstrøms ildflue luciferase genet (PTEN 3’UTR-Luc) [25]. ACHN celler ble transfektert med denne reporteren og vektor eller MIR-21 uttrykk plasmid. Uttrykk av MIR-21 hemmet reporteren aktivitet (Fig. 4A og S6a fig.) Betydelig. For å bekrefte denne observasjonen, brukte vi MIR-21 Sponge. Uttrykk av MIR-21 Sponge betydelig økt luciferase aktivitet av PTEN 3’UTR-Luc (Fig. 4B og S6B fig.). Disse resultater antyder at i nyrekreftceller, kan PTEN være en nedstrøms mål for MIR-21. For å teste dette, undersøkte vi PTEN protein nivå i MIR-21 Sponge-transfekterte ACHN celler. MIR-21 Sponge økte overflod av PTEN (fig. 4C og fig. S6C), samtidig med redusert fosforylering av Akt på Thr-308 og Ser-473 (fig. 4D).
(A og B) ACHN-celler ble transfektert med pCMV-MIR-21 ekspresjonsplasmid (A) eller MIR-21 Sponge (B) og vektor sammen med PTEN 3’UTR-Luc reporter-konstruksjonen. Cellelysatene ble anvendt for å bestemme luciferase-aktivitet som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Gjennomsnitt ± SE av 6 målinger er vist. I panel A, * p = 0,02 vs vektor alene. I panel B, * p = 0,002 vs vektor alene. (C og D) Lysates av MIR-21 Sponge-transfekterte ACHN celler ble immunoblottet med PTEN og aktin antistoffer (panel C), og fosfor-Akt (Ser-473), fosfo-Akt (THR-308) og Akt antistoffer (panel D).
MIR-21 Regulerer nedsatt Cancer Cell Proliferation og migrasjon via PTEN /Akt Axis
Våre resultater ovenfor tyder på at Mir-21 fremmer Akt aktivering ved å redusere PTEN nivåer i nyre kreftceller (fig. 4). For å direkte undersøke hvilken rolle denne signalveien i nyrekreftcelle spredning, transfektert vi ACHN og Caki-2 celler med MIR-21 Sponge og sirnas målretting PTEN (siPTEN). Som forventet, MIR-21 Sponge hemmet DNA-syntese (Fig. 5A og S7A fig.). I motsetning til transfeksjon av siPTEN vesentlig forhindret MIR-21 svamp-induserte inhibering av DNA-syntese (fig. 5A og fig. S7A, S7b og S7C). Tilsvarende siPTEN snudd nedgangen i spredning av ACHN celler indusert av MIR-21 Sponge (Fig. 5B og S8 fig.). Deretter fant vi ut effekten av siPTEN på ACHN og Caki-2 celle migrasjon. Uttrykk av MIR-21 Sponge redusert migrasjon av begge disse nyrekreft cellelinjer. siPTEN trykt den hemmende effekten av MIR-21 Sponge betydelig på celle migrasjon (fig. 5C, 5D og fig. S9 og S10).
ACHN celler ble transfektert med MIR-21 Sponge sammen med siRNA bassenger rettet mot PTEN mRNA som angitt. (A)
3H-tymidin inkorporering ble bestemt som beskrevet i Materialer og metoder [115]. Gjennomsnitt ± SE av 6 målinger er vist. * P 0,05 vs vektor; ** P 0,05 vs Mir-21 Sponge-transfekterte celler. (B) Transfekterte celler ble tellet ved angitte tidsperioder. Den symboler diamant, firkantet og kors representerer vektor, MIR-21 Sponge og Mir-21 Sponge pluss siRNA pool mot PTEN, henholdsvis. Gjennomsnitt ± SE av tredoble målinger er vist. * P 0,05 vs vektor alene; ** P 0,01 vs Mir-21 Sponge alene. (C) Transfekterte celler ble sådd ut på membran i trans-brønners kamre og de migrerte celler ble farget som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder [111]. (D) Flekker fra membranene i panel C ble eluert og absorbansen ved 590 nm ble målt. Gjennomsnitt ± SE av 3 uavhengige kamre vises. * P 0,001 vs vektor alene; ** P. 0,001 vs Mir-21 Sponge
lipid fosfatase aktivitet av PTEN er kjent for å regulere Akt fosforylering [27]. Vi har vist ovenfor at reduserte PTEN nivået i nyrekreftceller er assosiert med økt fosforylering av Akt (fig. 3 og fig. S5). Siden MIR-21 regulerer PTEN-protein-nivå, som i sin tur aktiverer Akt, testet vi rollen til denne kinasen i nyrekreftcelleformering i forhold til MIR-21. Vi transfektert ACHN og Caki-2-celler med konstitutivt aktiv Gag-Akt sammen med MIR-21 Sponge [33]. Uttrykk for Gag Akt vesentlig tilbake hemming av DNA-syntese indusert av MIR-21 Sponge (Fig. 6A, fig. S11A og S12 fig.). Uttrykk for Gag Akt også reversert cellen spredning av MIR-21 Sponge (6B og S13A fig.). Tilsvarende konstitutivt aktiv Akt vesentlig hindret inhibering av migrering av ACHN-celler i respons til MIR-21 sponge (fig. 6C, 6D og S13B fig.). Identiske resultater ble oppnådd med Caki-2 nyrekreftceller (fig. S14A, S14B og S14C). Disse resultatene indikerer at MIR-21 mål PTEN mRNA for å undertrykke dens protein ekspresjon, noe som fører til Akt-avhengig proliferasjon og migrering av nyrekreftceller.
ACHN-celler ble transfektert med MIR-21 sponge sammen med konstitutivt aktiv Gag Akt plasmider som angitt. (A)
3H-tymidin inkorporering ble bestemt som beskrevet i Materialer og metoder [115]. Gjennomsnitt ± SE av 6 målinger er vist. * P 0,01 vs vektor; ** P 0,001 vs Mir-21 Sponge alene. (B) Transfekterte celler ble tellet ved angitte tidsperioder. Den symboler diamant, firkantet og kors representerer vektor, MIR-21 Sponge og Mir-21 Sponge plus Gag Akt ekspresjonsplasmider, henholdsvis. * P 0,01 vs vektor alene; ** P 0,001 vs Mir-21 Sponge alene. (C) Transfekterte celler ble sådd ut på membran i trans-brønners kamre og de migrerte celler ble farget som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder [111]. (D) Flekker fra membranene i panel C ble eluert og absorbansen ble målt. Gjennomsnitt ± SE av 3 uavhengige kamre vises. * P 0,001 vs vektor alene; ** P. 0,001 vs Mir-21 Sponge
MIR-21 modulerer TORC1 aktivitet for å indusere Nedsatt Cancer Cell Proliferation og migrasjon
Aktivert Akt phosphorylates tumor suppressor protein tuberin på Thr -1462 som fører til inaktivering, og rheb-mediert aktivering av TORC1 [34], [35], [36]. Vi har fastslått at nedregulering av PTEN på grunn av økt MIR-21 ekspresjon i renale kreftceller aktiverer Akt (fig. 3), noe som bidrar til proliferasjon og migrering av disse cellene (fig. 5 og 6). Vi testet den rollen MIR-21 i tuberin fosforylering. ACHN celler ble transfektert med MIR-21 Sponge. På grunn av økt Akt aktivering, ACHN-celler viser forbedret fosforylering av tuberin (Fig. 7A, kolonne 1). Uttrykk av MIR-21 Sponge hemmet fosforylering av tuberin (Fig. 7A og S15A fig.). I likhet med økt tuberin fosforylering, ACHN-celler viste augmented fosforylering av S6-kinase ved Thr-389 (fig. 7B, kolonne 1), målt som et surrogat for TORC1 aktivitet. MIR-21 Sponge blokkert S6 kinasefosforylasjon (Fig. 7B). Denne reduksjonen i S6 kinasefosforylasjon av MIR-21 Sponge var forbundet med hemming av mTOR fosforylering ved Ser-2448 (Fig. 7C). Disse resultater antyder at MIR-21 regulerer TORC1 aktivitet i nyrekreftceller. For å undersøke hvorvidt MIR-21 svamp-avhengig mTOR-hemming er på grunn av inaktivering av rheb, kotransfektert vi ACHN-celler med MIR-21 svamp og en konstitutivt aktiv rheb ekspresjonsplasmid, og resultatene ble sammenlignet med det i MIR-21 svamp-transfekterte celler. mTOR-aktivering ble undersøkt i cellelysatene. Uttrykk av konstitutivt aktiv rheb reversert den hemmende effekten av MIR-21 Sponge på S6 kinasefosforylasjon (Fig. 7D og S15B fig.). Tilsvarende redusert fosforylering av mTOR ved MIR-21 sponge ble også forhindret av konstitutivt aktiv rheb (fig. 7E og fig. S15C). Disse resultatene entydig viser at Mir-21-mediert fosforylering /inaktivering av tuberin aktiverer rheb å øke mTOR-aktivitet.
ACHN celler ble transfektert med MIR-21 Svamp eller vektor. Cellelysatene ble immunoblottet med fosfor-tuberin (Thr-1462), tuberin (panel A), fosfor-S6 kinase (Thr-389), S6 kinase (panel B), fosfor-mTOR (Ser-2448) og mTOR (panel C). MIR-21 bruker rheb aktivering for TORC1 aktivitet. ACHN celler ble transfektert med MIR-21 Sponge og CA rheb plasmid. Cellelysatene ble immunoblottet med fosfor-S6 kinase (Thr-389), S6 kinase (panel D), fosfor-mTOR (Ser-2448) og mTOR (panel E).
For å belyse hvorvidt MIR-21-aktivert TORC1 bidrar til spredning av nyrekreftceller, kotransfektert vi ACHN og Caki-2 celler med MIR-21 Sponge og en konstitutivt aktiv mTOR ekspresjonsvektor.
3H-tymidin inkorporering ble bestemt. Ekspresjon av konstitutivt aktiv mTOR betydelig hindret ved inhibering av DNA-syntese ved MIR-21 sponge (fig. 8A, fig. S16 og S17 fig.). Tilsvarende konstitutivt aktiv mTOR inhiberte MIR-21 svamp-formidlet reduksjon i ACHN-celle proliferasjon (Fig. 8B og fig. S18A). Neste undersøkte vi effekten av konstitutivt aktiv mTOR på nyrekreft celle migrasjon. MIR-21 Sponge avskaffet migrasjon av ACHN og Caki-2 celler (Fig. 8C, Fig. S18B og S19 fig.). Men koekspresjon av konstitutivt aktiv mTOR med MIR-21 Sponge vesentlig tilbake hemming i migrasjon av både nyrekreft cellelinjer som svar på MIR-21 Sponge (fig. 8C, 8D og S19 fig.). Tatt sammen Disse resultater viser at MIR-21 bidrar til renal cancer celleproliferasjon og migrering via TORC1.
ACHN-celler ble transfektert med MIR-21 sponge sammen med konstitutivt aktive mTOR plasmider som angitt. (A)
3H-tymidin inkorporering ble bestemt som beskrevet i Materialer og metoder [115]. Gjennomsnitt ± SE av 6 målinger er vist. * P 0,001 vs vektor; ** P 0,001 vs Mir-21 Sponge alene. (B) Transfekterte celler ble tellet ved angitte tidsperioder. Den symboler diamant, firkantet og kors representerer vektor, MIR-21 Sponge og Mir-21 Sponge pluss konstitutivt aktive (CA) mTOR ekspresjonsplasmider, henholdsvis. * P 0,01 vs vektor alene; ** P 0,001 vs Mir-21 Sponge alene. (C) Transfekterte celler ble sådd ut på membran i trans-brønners kamre og de migrerte celler ble farget som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder [111]. (D) Flekker fra membranene i panel C ble eluert og absorbansen ved 590 nm ble målt. Gjennomsnitt ± SE av 3 uavhengige kamre vises. * P 0,001 vs vektor alene; ** P 0,001 vs Mir-21 Sponge
Diskusjoner
I nyrekreftceller, gir vi bevis for uttrykket av pri-MIR-21 for å produsere pre- og moden. MIR-21, noe som bidrar til proliferasjon og migrasjon /invasjon. Vi viser en invers korrelasjon mellom MIR-21 nivåer og PTEN overflod. Vi viser at Mir-21-sensitive PTEN regulerer spredning og migrasjon av nyrekreftceller via aktivering av Akt. Til slutt, etablerer vi en rolle for MIR-21-stimulert TORC1 av nyrekreft celleproliferasjon og migrasjon (Fig. 9).
Forbedret MIR-21 demper PTEN protein nivåer, noe som resulterer i aktivering av Akt, som inaktiverer tuberin å øke TORC1 aktivitet fører til spredning, migrasjon og invasjon av nyrekreftceller.
Endrede genuttrykk kontroller signalnettverk for å regulere de biologiske utganger, som bidrar til celle transformasjon og metastasering. Selv transcriptional regulering av gener for å produsere mRNA formidler et vesentlig bidrag til onkogenese, er nylige oppdagelsen av miRNAs spille en rolle som ligner på DNA-bindende transkripsjonsfaktorer etablert i regulering uttrykk for målgener ved post-transcriptional mekanisme. Mange mirnas har blitt identifisert og karakterisert som tumorpromotorer, så vel som tumor-suppressorer. For eksempel, den allestedsnærværende uttrykt miRNA, MIR-21, blir ofte oppregulert i mange kreftformer, inkludert bryst, lunge, neuroblastom, glioblastom, leukemi, magekreft, kolangiokarsinom, tykktarmskreft og leverkreft [37], [38], [39] , [40], [41], [42]. Men informasjon om den funksjonelle rollen MIR-21 er bare tilgjengelig fra
in vitro
studier. Bare nylig
in vivo
rollen MIR-21 i utvikling av kreft, er påvist i pre-B-cellelymfom og ikke-småcellet lungekreft. I begge disse kreftformene, er ekspresjon av MIR-21 en signifikant økning [43], [44], [45]. Ved hjelp av musemodeller av overekspresjon samt sletting av MIR-21, Medina et al og Hatley et al viste nylig en svært spesifikk rolle denne miRNA i utviklingen av pre-B-cellelymfom og ikke-småcellet lungekreft, henholdsvis [ ,,,0],46], [47].
MIR-21 regulerer spredning og mitokondrie apoptotiske trasé kontrollert av tumor suppressor proteiner, cellesyklus regulatorer og vekstfaktorer [48], [49]. MIR-21 er uttrykt veldig i nyre proksimale tubuli [50]. I dyremodeller, økt ekspresjon av MIR-21 er assosiert med fibrotiske lidelser i nyre og renal iskemisk skade [51], [52], [53], [54]. Nylig har vi rapportert økt uttrykk av MIR-21 i en modell av type 1 diabetes nefropati [25]. Vi viste at Mir-21 regulerer hypertrofi av proksimale tubulære epitelceller, indikerer patologisk rolle denne miRNA i nyresykdommer [25]. Tilsvarende miRNA profilering studier identifisert økt uttrykk av MIR-21 i både klart celle og papillær nyrecellekarsinomer [14], [19], [55]. I motsetning til dette, i en fersk mikromatriseanalyse av 30 karakterer 1 og 2 klarcellekarsinom nyrekarsinom vev, ble MIR-21 rapportert å bli nedregulert ved mer enn to ganger [56]. Interessant nok var en svak gjensidig sammenheng oppdaget mellom overlevelse av pasienter med klarcellet nyrekreft og Mir-21 uttrykk [55]. I denne rapporten nedregulering av MIR-21 ble funnet i VHL mangel RCC4 nyrekreft cellelinje [55]. Tilberedning av VHL resulterte i økt uttrykk av MIR-21 i en Hifα uavhengig. Det skal bemerkes at 42% av de klare celle svulster viser VHL mutasjon og 10% av tumorene bærer metylering i VHL promotoren [57], [58], [59]. I den foreliggende undersøkelse, viser vi en betydelig økning i MIR-21 ekspresjon i VHL positiv ACHN og Caki-2 nyrecancerceller sammenlignet med normale proksimale tubulære epitelceller (fig. 1 og S2 Fig.) [60]. Videre viser vår resultatene betydelig forbedret MIR-21 uttrykk i 100% av karakteren 2 og klasse 3 nyre tumorvev i forhold til (fig. S1) matchet kontrollgruppe vev. I tillegg, ved bruk av en VHL negativ nyrecancercellelinje, 786-O, fant vi betydelig økt ekspresjon av MIR-21 sammenlignet med HK2 proksimale tubulære epitelceller (fig. S20). Disse resultatene viser at uavhengig av VHL status, nyrekreftceller uttrykker høye nivåer av MIR-21.
metastatisk nyrekreft celler DISPLAY økt TGFB avhengig Smad 2/3 signaliserer [61]. Nylig en rolle av TGFp i å øke nivåene av modne MIR-21 er blitt rapportert [62]. Disse forfatterne beskrev en transkripsjon uavhengig funksjon av TGFB spesifikke Smad proteiner, som er rekruttert inn i RNase III drosha gjennom interaksjon med RNA helicase p68. Denne mikroprosessor komplekset rekrutterer pri-MIR-21 for å lette produksjon av pre-MIR-21, og dermed øke nivåene av modne MIR-21 [62]. Denne studien fant ingen økning i pri-MIR-21 som svar på TGFB.
