Abstract
microRNAs er små ikke-kodende RNA-molekyler som regulerer mRNA oversettelse og stabilitet ved å binde seg til komplementære sekvenser vanligvis innen 3 «un-oversatt regionen (UTR). Vi har tidligere vist at levertoksisitet forårsaket av vill-type adenovirus 5 (Ad5WT) i mus kan bli forhindret ved å innlemme 4 bindingssetene for den leverspesifikke mikroRNA, mir122, inn i det 3»-UTR av E1A mRNA. Dette viruset, kalt Ad5mir122, er en lovende virotherapy kandidat og forårsaker ingen åpenbare leveren patologi. Heri vi vise at Ad5mir122 opprettvilltype lytisk aktivitet i kreftceller ikke uttrykker mir122 og vurdere eventuelle effekter av mulig mir122 uttømming i vertsceller. Gjenta tilførsel av 2 × 10
10 viruspartikler av Admir122 til HepG2 svulst bærende mus viste betydelige anti-kreft effekt. RT-QPCR viste at E1A mRNA ble nedregulert 29 ganger i leveren i forhold til Ad5WT. Western blot for E1A bekreftet at alle proteinvarianter ble slått ned. RT-QPCR for modne mir122 i infiserte lever viste at mengden av mir122 forble upåvirket. Genome bredt mRNA microarray profilering av smittede lever viste at selv om karakternivået 3900 forskjellige mRNA endret seg mer enn to ganger etter Ad5WT infeksjon, mindre enn 600 ble endret av Ad5mir122. Disse ble deretter filtrert for å velge mRNA som bare ble endret ved Ad5mir122 og de resterende 21 mRNA-er ble sammenlignet med forutsagte mir122 mål. Ingen mir122 målet mRNA ble påvirket av Ad5 mir122. Disse resultatene viser at utnyttelsen av mikroRNA regulering for å kontrollere virusreplikasjon ikke nødvendigvis påvirke nivået av mikroRNA eller endogene mRNA-mål
Citation. Cawood R, Wong SL, Di Y, Baban DF, Seymour LW (2011) mikroRNA Kontrollert Adenovirus som megler Anti-Cancer effekt uten at det påvirker Endogen mikroRNA aktivitet. PLoS ONE 6 (1): e16152. doi: 10,1371 /journal.pone.0016152
Redaktør: Sebastien Pfeffer, IBMC-CNRS, Frankrike
mottatt: 13 august 2010; Godkjent: 13 desember 2010; Publisert: 10 januar 2011
Copyright: © 2011 Cawood et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. RC og YD støttes av Cancer Research UK (https://www.cancer.org.uk/), SLW er finansiert av en forskningsstudent fra Medical Research Council (www.mrc.ac.uk). Den microarray kjernefasiliteten er finansiert av Wellcome Trust. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Genetisk regulering av virusreplikasjon og uttrykk er en kraftig strategi for utvikling av sikrere viral terapi for vaksinering, genterapi og virotherapy. DNA-virus er ofte laget vev eller kreft selektivt ved utskifting av sterke virale promotorer med svakere humane endogene promotere. I motsetning til dette, har muligheter for kontroll av RNA-virusreplikasjon i stor grad fokusert på utvikling eller utnytte interferon følsomhet [1], [2] eller ved hjelp av svekkede vaksinestammer [3]. Ingen universell mekanisme av kontroll for alle virus eller virustransgener har vist seg vellykket. Imidlertid har oppdagelsen av mikroRNA regulatoriske nettverk tillates utformingen av virale vektorer i hvilke eteriske mRNA blir selektivt nedbrytes i vev som uttrykker et bestemt mikroRNA, å gi mulighet for kontroll gjennom vev-selektiv inaktivering av essensielle virale funksjoner.
microRNAs er ikke-kodende RNA-molekyler som negativt regulerer mRNA oversettelse gjennom binding til sekvenser vanligvis innenfor 3 «un-oversatt regionen (UTR) [4]. Nivået på komplementaritet mellom mikroRNA og målet påvirkninger enten mRNA er degradert (perfekt komplementaritet) eller danner en stabil translatorisk inaktiv kompleks. Inkludering av mikroRNA bindingssetene i det 3’UTR av mRNA som koder for viktige virale proteiner tillater den selektive destruksjon av mRNA og hindrer proteintranslasjon. Den forutsetning av alle virus å utnytte mRNA oversettelse for å gjenskape betyr at denne metoden for kontroll kan universelt brukes på alle virus infiserer en eukaryot celle.
Eksempler der teknikken har blitt brukt med hell er i styre den for replikasjon av poliovirus [5], Herpesvirus virus~~POS=HEADCOMP [6], vesikulær stomatitt virus [7], [8], Influensavirus [9] og Adenovirus type 5 (Ad5) [10], [11]. Virale vektorer som denne teknikken har blitt brukt til å styre transgene uttrykk omfatte Dengue-virus replikoner [12], Alphaviral replikoner [13], lentivirale vektorer [14] og adenovirusvektorer [15]. Basert på nåværende litteratur, er det klart at den virustype, det mikroRNA valg og vev i patologi er viktige i å definere det nivået som et virus er vellykket styres.
Ad5 har blitt grundig undersøkt i sammenheng med virotherapy og villtypestammen (Ad5WT) er blitt vist å ha kraftig anticancer aktivitet [16]. Men etter intravenøs administrasjon til mus, fører Ad5WT akutt levertoksisitet som, ved doser over 1×10
9 pfu, er jevnt dødelig [17]. Denne toksisitet er antatt å reflektere høye nivåer av ekspresjon av proteinet E1A i hepatocytter [18], [19]. Dette uttrykket blir så fulgt av nedstrøms viral genekspresjon og hepatocytter celledød.
For å oppheve denne giftighet, uten at det påvirker virusreplikasjon i kreftceller, vi satt inn fire helt komplementære bindingssteder for hepatocytter spesifikke mikroRNA mir122 inn 3 «UTR av E1A transkripsjonskassetten (et virus kalt Ad5mir122). Den perfekte komplementaritet mellom mir122 bindingssteder vi har satt inn og mikroRNA mir122 bør resultere i betydelig E1A mRNA cleavage gjennom en mekanisme som ligner på RNAi. Vi har tidligere vist at dette kan redusere levervirusreplikasjon, ALT utgivelsen og leverpatologi [10].
Lite er kjent om de potensielle uønskede cellulære konsekvenser for kontroll av virus ved hjelp mikroRNA bindingssteder. Mengden av cellulære mikroRNA kunne bli redusert ved tilsetning av virale mål-mRNA eller de virale mRNAer kan mette aktiviteten til mikroRNA og tillate forandringer i nivåene av endogene mRNA-mål. Tidligere studier med mikroRNA regulerte lentivirale vektorer har vist at dette kan forekomme når cellene utsettes for en høy infeksjonsmultiplisitet. Dette tyder på at regulerende effekt av microRNAs er mettes ved høye doser [20]. Under denne terskelen de mikroRNA endogene mRNA mål er rapportert å være uendret [21]. I denne studien vi dro ut for å finne ut om dosen av Ad5mir122 stand til å vise intravenøs effekt i behandling av kreft vil i betydelig grad påvirke lever nivåer av mir122 eller dets mRNA-mål.
Materialer og Metoder
adenovirus forberedelser
Adenovirus kloning har blitt beskrevet tidligere [10]. Alle adenovirus ble dyrket i A549 celler, renset ved å dobbelt banding i CsCI graderinger med benzonase behandling etter første banding. Viral partikkel (vp) tall ble bestemt ved å måle DNA-innhold ved anvendelse av en modifisert versjon av PicoGreen analysen (Invitrogen, Paisley, UK) [22]. TCID
50 beregnet ved Karber statistisk metode [23] ble brukt til å estimere adenovirus titer (TCID
50 enheter /ml) og korrigert for å bestemme plakkdannende enheter /ml (PFU /ml). Adenovirus fremstillings karakteristika er som følger: Ad5WT: 1,13 x 10
12 vp /ml, 1,98 x 10
11 pfu /ml og partikkel: smittsomhet (P: I) forhold på 5,6; Ad5mir122: 1,29 × 10
12 vp /ml, 2,01 × 10
11 pfu /ml og partikkel: smittsomhet (P: I) andel på 6,4
Vedlikehold av cellelinjer
HT29-Luc og Lovo-Luc kolorektal cellelinjer ble hentet fra Caliper Life Sciences (Runcorn, UK). Humane leverkreft HepG2 og Hep3b cellelinjer og A549 lunge carcinoma-celler ble oppnådd fra European Collection of Cell Cultures (Porton Down, UK), og holdt i DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS) (PAA Laboratories, Yeovil, UK) inkludert penicillin (25 U /ml) og streptomycin (10 mg /ml).
luciferase analysene
celler ble sådd i tre eksemplarer i 48 brønners plater på 2,5 × 10
4 celler /godt. Virusinfeksjoner ble utført ved 10 vp /celle. 24 timer etter infeksjon ble mediet fjernet, og 150 ul rapportørcellelyseringsbuffer (Promega) ble tilsatt. Celler ble frosset ved -80 ° C i 1 time før tining. Luciferin (25 ul) (Promega, Southampton, UK) ble tilsatt til 25 ul av cellelysatet og relativ luminescens ble målt ved luminometry (Lumat LB 9507, Berthold Teknologier, Redbourn, UK).
MTS Assays
Celleviabilitet ble bestemt ved bruk av CellTiter 96 Aqueuos en løsning Cell Proliferation Assay (Promega). Celler ble sådd ut ved 1 x 10
4 /brønn i 96-brønners plater i 100 ul media. Etter 24 timer, ble virus tilsatt ved 10 og 100 vp /celle i 100 ul media. Celler ble forlatt for enten 3 eller 6 dager. På hvert tidspunkt mediet ble fjernet, og 20 ul MTS-reagens i 180 ul medium ble tilsatt og cellene ble inkubert i 30 minutter. Platene ble avlest ved 490 nm i 0,1 sekunder. Blanke brønner som inneholder MTS-reagens og media, men ingen celler fungerte som bakgrunn og ikke-infiserte celler representerer 100% overlevelse i hver celletype. N = 5 for hver analyse.
Primær hepatocytter kultur
Frozen humane primære hepatocytter (NHeps, CC-2591), hepatocytter Basal medium HBM
TM (CC-3199), kosttilskudd og vekstfaktorer HCM
TM SingleQuots (CC-4182) ble kjøpt fra Lonza. Celler ble sådd ut og manipulert i henhold til Lonza protokoll. En 96-brønners plate ble belagt med rottehale kollagen type 1 (Sigma, C3867) ved 60 ug /cm
2. Celler ble tint ved 37 ° C i et vannbad, sentrifugert ved 4 ° C i 3 minutter ved 50 g og deretter vasket i kaldt kulturmedium. Cellene ble resuspendert og antallet og levedyktighet ble bekreftet ved hjelp av trypanblått fargestoffeksklusjonsmetode. Den oppnådde levedyktighet var 60% ved poding. Celler ble sådd ut i 5 x 10
4 /brønn med 120 ul medium hver brønn. Mediet ble endret i det hele 3 timer etter utsåing. Virusinfeksjoner ble utført 24 timer etter utsåing av 100 ul friskt medium ved en vp /celle, ble ytterligere 100 ul medium ble tilsatt ved 2 timer etter infeksjonen. 100 ul medium ble byttet hver dag og inntil forsøket er fullført (72 timer). Supernatanten ble fjernet ved aspirasjon, og cellene ble lysert i 100 pl Promega reporter lyseringsbuffer (E397A) og frosset ved -80 ° C før kvantitering luciferase.
Western avsetninger
Protein ble ekstrahert fra muse- leveren ved homogenisering i Promega lyseringsløsning ved 80 mg /ml våt vekt. Prøvene ble span ved 2000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C for å fjerne celleavfall. 30 ug lever protein ble applisert på en 10% polyakrylamidgel etter kvantifisering ved anvendelse av en QuantiPro BCA-analyse (Sigma Aldrich, katt: QPBCA-1KT). Gelen ble kjørt ved 160V i 1 time og deretter protein ble blottet på en nitrocellulosemembran over natten ved 4 ° C ved 30V. Nitrocellulosemembran ble farget med Ponceau løsning for å bekrefte lik belastning (data ikke vist) og deretter blokkert ved bruk av 5% melkepulver (Fluka, Sigma Aldrich) i 2 timer (E1A), eller over natten (Aldolase A). Membranen ble vasket to ganger med PBS 0,1% Tween 20, og deretter en gang med PBS. For E1A western blot, primært antistoff som gjenkjenner E1A (Abcam, Cambridge, UK, katt nummer: Ab33183) ble tilsatt ved 1:500 fortynning i 2,5% melkepulver i PBS i 1 time. Membranen ble vasket som ovenfor. Sekundær anti-kanin HRP-merket antistoff ble tilsatt i 1:1000 fortynning i 2,5% melkepulver i 1 time. For Aldolase A western blot, primært antistoff som gjenkjenner Aldolase A (Sigma-Aldrich, katt nummer: AV48130) ble tilsatt ved 1:1000 fortynning i 2,5% melkepulver i PBS i en time. Membranen ble vasket som ovenfor. Sekundært antistoff var den samme som anvendt for Adenovirus E1A western blot, men anvendt ved en 1:4000 fortynning i 1 time. Membranene ble vasket som ovenfor, og deretter badet i ECL western blotting deteksjonsreagensen (Amersham, GE Healthcare) ved 0,125 ml /cm
2 i 1 minutt. Blot ble visualisert i en Alpha Innotech gel dokumentasjonssystem for 1, 5 og 10 minutter ved hjelp av kjemi-luminescens deteksjon.
RNA ekstraksjon og revers-transkripsjon kvantitativ PCR for E1A mRNA
Total RNA fra mus lever ble hentet ved hjelp av Mirvana miRNA isolasjon kit (Ambion) uten at miRNA berikelse trinn. Reaksjoner ble utført ved anvendelse av TaqMan RNA-til-C
T 1-trinns kit (Applied Biosystems), som følge produsentens protokoll. PCR-sykluser som var som følger: 95 ° C 10 minutter, og deretter 40 sykluser ved 95 ° C i 15 sekunder, 60 ° C 1 minutt. Primer sekvenser for å målrette E1A 13S var: Fwd – ATG TTT GTC TAC AGT CCT GTG TCT GAA, Rev – GAT AGC AGG CGC CAT TTT AGG og probe – CCA GAA CCG GAG CCT GCA AGA CCT AC (Sigma-Aldrich), dual-merket på 5 «enden med 6-carboxyfluorescein og 3» ende med 6-carboxytetramethylrhodamine. Resultatene ble analysert med StepOne Plus Real-Time PCR Systems programvare (Applied Biosystems). Standardkurver ble laget ved seriefortynninger av kjente mengder av E1A DNA ved hjelp av et Ad5 E1A kodende plasmid og går ut i fra 100% utvinning effektivitet.
dyremodeller
Nu /nu CD1-hunnmus ble erholdt fra Charles elver Laboratories på 4-6 uker gammel. 5 x 10
6 HepG2-celler ble injisert subkutant. Musene ble randomisert før behandling. Innledende tumor størrelser var typisk 10-20 mm
3. Alle ble forbehandlet med bisfosfonat liposomer (100 IL /mus, hentet fra Dr Nico van Rouijen) 24 timer før den første dosen av virus. I studiet av intravenøse effekt mus mottok bisfosfonat liposomer to ganger på dagene -1 og 18. Alle kontrolldyr fikk denne behandlingen. 10 dyr ble brukt i hver gruppe.
Tumor dimensjonering og Kaplan Meier analyse
Tumor volum ble målt ved hjelp av håndholdte kalippere og er definert som størrelsen av de største svulst i hver mus. Tumor volum beregnes som en ellipsoide [24]. Kaplan Meier analyse ble utført ved hjelp av Prism programvare og vises som prosentandelen gruppe overlevelse ved hvert tidspunkt.
Imaging
In vivo
virusaktivitet ble vurdert av ikke-invasiv luciferase bildebehandling ved hjelp av en IVIS 100-systemet (Xenogen, MA). D-Luciferin (kaliumsalt) (Gold Biotechnology inc) ble fremstilt i PBS ved 15,8 mg /ml. 100 ul Luciferin ble administrert via intra peritoneal injeksjon og mus ble fotografert 4 minutter senere.
Måling av serum alaninaminotransferase (ALAT)
50 mikroliter blod ble tatt fra mus ved haleblødning og lov å koagulere (15 minutter, romtemperatur) og sentrifugert ved 1200 g i 10 min. Serum ble isolert og umiddelbart frosset ved -20 ° C. Prøver av tint serum (5 ul) ble tilsatt til ALT-reagens (995 ul, Microgenics) i en 1 ml kyvette kvarts, inkubert ved 37 ° C, og forandringen i absorbans (340 nm) per minutt ble målt. Enheter av ALT per liter ble beregnet i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av følgende ligning:. Aktiviteten i enheter /liter = Ä Absorbance endring per minutt x faktor (faktor = totalt reaksjonsvolum × 1000 /6,3 × prøvevolum × banelengde)
mikroRNA Kvantitering
RNA ble ekstrahert fra muse-lever som beskrevet ovenfor, og ble fortynnet til 1 ng /mL i nuklease fritt vann. Eldre mir122 nivåer ble kvantifisert ved hjelp av en TaqMan mikroRNA-analysen (Applied Biosystems) spesifikk for mir122 (delenummer: 4427975 Analyse ID: 002130). Kort, Revers transkripsjon (RT) reaksjoner (15 mL) ble satt opp i henhold til produsentens retningslinjer til hjelp Multiscribe revers transkriptase (50 U /reaksjon), dNTP (1 mm endelig konsentrasjon), 0,188 mL RNase hemmer, 1,5 mL 10X RT buffer, 3 il 5X mir122 TaqMan mikroRNA RT primer og 5 mL RNA prøve (1 ng /mL). Reaksjonsbetingelsene var 30 minutter 16 ° C, 30 minutter 42 ° C og 5 minutter 4 ° C. cDNA (1,33 mL av RT-reaksjon) ble tilsatt til 1 pl 20X Mir122 Taqman-analyse mikroRNA, 10 ul 2X TaqMan PCR Universal Master mix og gjort opp til 20 pl ved hjelp av nuklease fritt vann. Real-time PCR-betingelsene var 10 minutter ved 95 ° C, etterfulgt av 40 sykluser av 15 sekunder ved 95 ° C og deretter 1 minutt ved 60 ° C. Prøvene ble kjørt på en Step One Plus real-time PCR system (Applied Biosystems). Den mikroRNA let7a ble brukt som en intern standard ved anvendelse av betingelsene beskrevet ovenfor, og ved bruk av TaqMan®-analysen mikroRNA (Applied Biosystems) som er spesifikke for modent let7a RNA (delenummer: 4427975 Assay ID: 000377). Relative standardkurver ble fremstilt ved ti-gangers seriefortynninger av lever RNA ekstrahert fra en mus mottok PBS. Reaksjons egenskaper var som følger; mir122 analysen: helling 3.28, 101,78%, effektivitet 2,02 og la 7a analysen skråning 3,268, 102,29%, effektivitet 2.01. Relative uttrykk ble beregnet ved hjelp av fremgangsmåten publisert av Pfaffl, M [25]. Prober ble merket ved 5 «enden med 6-carboxyfluorescein og på 3» ende med en ikke-fluorescerende drikk koblet til en mindre groove bindemiddel (MGB).
mRNA microarray analyse
RNA ble ekstrahert fra muse-lever som beskrevet ovenfor. Hver gruppe inneholder 3 mus og uavhengige chips ble anvendt for hver prøve. Hel-genom analyse av genuttrykk ble utført ved hjelp av Illumina Enkel farge Mouse WG-6_V2_0_R0_11278593_A BeadChip med direkte hybridisering analysen (Illumina, Essex, UK) i henhold til produsentens anvisninger som starter med 300 ng total RNA fra hver prøve. Biotinylated cRNA ble utarbeidet etter den Illumina TotalPrep-96 RNA Amplification Kit (# 4393543 Ambion, Inc., Austin, TX). Dette kort inneholder en første- og andre-tråd revers transkripsjonstrinn, etterfulgt av en enkelt
in vitro transkripsjon
(IVT) amplifikasjon som inneholder biotin-merkede nukleotider. Påfølgende trinn inkluderer rekke hybridisering, vasking, blokkering, og streptavadin-Cy3 farging. Fluorescens utslipp med Cy3 ble kvantitativt oppdaget av BeadArray Scanner for nedstrøms analyse. GenomeStudio Data Analysis Software ble brukt til å visualisere og analysere data generert. Denne programvaren gir resultater i standard filformater som kan lett bearbeidet med de fleste kommersielle uttrykk-analyse programmer. Data ble importert til GeneSpring GX 11.0.2 (Agilent Technologies, Inc, Santa Clara CA) normalisert med Shift til 75-persentilen og baseline forvandlet til medianen av alle prøvene for detaljert analyse for å identifisere vesentlig forskjellig uttrykt gener. Dataene omtalt i denne publikasjonen er MIAME kompatibel og har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus [26] og er tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE23854 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc Cgi? acc = GSE23854).
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med vilkårene i UK hjemmekontoret retningslinjer og UKCCCR retningslinjer for dyrevelferd i Experimental neoplasi. Hjemmekontor prosjekt lisensnummeret som disse forsøkene ble gjennomført er PPL 30/2333. Alle forsøkene ble utført med godkjenning av dyreetikk Committee, University of Oxford i Medical Sciences.
Resultater
Ad5mir122 viser redusert E1A uttrykk i primære humane hepatocytter
Vi har tidligere vist at inkluderingen av mikroRNA bindingssetene innenfor 3’UTR av adenovirus E1A mRNA fører til lavere E1A protein i både muse-lever
in vivo
og i de mir122 positiv human hepatom-cellelinje Huh7
in vitro
. Imidlertid Huh7-celler uttrykker bare 8% av mir122 nivåer av primære humane hepatocytter [27]. Vi ønsket derfor å måle nivået av kontroll av viral transgene uttrykk som kan oppnås i primære humane hepatocytter som et surrogat for human lever. Primære humane hepatocytter (1 × 10
4 /brønn) ble inkubert med enten Ad5WT koding luciferase C-terminalt smeltet til E1A protein (Ad5WTLuc) eller tilsvarende virus som inneholder fire mir122 bindingsseter i E1A-luciferase 3’UTR ( Ad5mir122luc). Etter 72 timer ble luciferase-nivåene var 30 ganger lavere i celler infisert med Ad5mir122luc (9,5 x 10
2 RLU /mg) sammenlignet med Ad5WTluc (2,7 x 10
4 RLU /mg) (Figur 1) . Dette er den første demonstrasjonen av kontroll over en mikroRNA regulert virus i primære humane celler og fremhever den potensielle kliniske nytteverdien av å utnytte mikroRNA regulering i terapeutiske virus.
Primære humane hepatocytter ble infisert med enten Ad5mir122luc eller Ad5WTluc på en vp /celle. Luciferase nivåer er vist 3 dager etter infeksjon (n = 3) som relative lysenheter pr mg totalt protein. Feilfelt representerer standardavvik.
Ad5mir122 dreper mir122 negative celler med Ad5WT potens
Evnen Ad5mir122 til å drepe kreftceller ikke uttrykker mir122 ble sammenlignet med Ad5WT. Flere cellelinjer ble inkubert ved 10 og 100 vp /celle og celle-levedyktigheten ble bestemt etter 3 eller 6 dager ved MTS-analyse. Lik celle drapet ble observert med både virus i begge Mois etter dag 3 (data ikke vist). Nesten fullstendig celledreping i noen cellelinjer ble observert ved høyere MOI ved dag 6 (Figur 2). Interessant, cellelinjen mest utsatt for å bli drept av begge virus ble HepG2 humane leverkreft, som er rapportert å være mir122 negative [27]. Gitt at reduksjon i mir122 nivåer i primær hepatoma er en indikator på dårlig prognose [28], HepG2 celler representerte et lovende tumormodell som bør maksimere den terapeutiske indeks oppnås ved å Ad5mir122 mellom tumorvev og primær lever.
Sammenligning av Ad5mir122 og Ad5WT i cancercellelinjer inkubert ved en multiplisitet av infeksjon på 100 viruspartikler per celle. Prosentandelen celleoverlevelse er vist 6 dager etter infeksjon (n = 5) under anvendelse av en MTS-celle overlevelse analyse. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en vei ANOVA. (* = P 0,05, NS = ikke signifikant)
Farmakodynamikk-ledede bestemmelse av optimale virus doser
De optimale doser av Ad5mir122 og Ad5WT ble bestemt for å definere en protokoll som ville tillate gjenta levering i en kreft effekt modell. Selv om vi tidligere har definert enkelt injeksjon maksimal tolerert dose i normal mus av Admir122 (6 × 10
10 vp), behandling av xenograft bærende hårløse mus kan kreve en annen protokoll, og derfor en farmakodynamikk-ledede doseeskaleringsstudie ble utført .
Ad5WT og Ad5mir122 ble administrert intravenøst til CD1 nakne mus med HepG2 xenografter, med serum ALAT målt etter hver dose (figur 3a). Startdosen for både virus var 6 × 10
9 vp /mus, tilsvarende 8,8 × 10
8 pfu for Ad5WT, noe lavere enn den publiserte høyeste tolererte dose (MTD, 1 x 10
9 pfu ) [17]. For å aktivere avbildning av virusaktivitet hver dose inneholdt 10% Ad5mir122luc.
A) Serum alanin transaminaser (ALAT) nivåer fra mus som fikk Ad5mir122, Ad5WT eller PBS. ALAT verdier for hver gruppe blir vist på dager 2, 5 og 8 (n = 3) etter den første injeksjonen. Dataene er presentert som ALT-enheter per liter ved å bruke ligningen i materialer og metoder. B) Luciferase bildebehandling 2 dager etter første injeksjon av Ad5mir122 (venstre panel) eller Ad5WT (høyre panel). C) Luciferase bildebehandling åtte dager etter første injeksjon. Mus som fikk en enkelt injeksjon av Ad5WT vises i panelet til høyre og mus som fikk tre injeksjoner av Ad5mir122 vises i det venstre panelet. Bildene er alle presentert på samme skala. D) Dosering og behandlingsplan for Ad5mir122 og Ad5WT. Virale doser som er angitt over hver linje, og omfatter 10% av et luciferase reporter virus (Ad5mir122luc). Alle mus ble behandlet med bisfosfonat liposomer på dag -1
To dager etter administrasjon av 6 × 10
9 vp Ad5WT, mus viste dramatisk forhøyet ALAT. ( 1000 enheter /L) noe som tyder på betydelig levertoksisitet (figur 3a). Imaging viste høye nivåer av lever- luciferase uttrykk, som bekrefter virusaktivitet i leveren med liten eller ingen tumor signal (figur 3b). Selv om ALAT verdiene falt jevnt og trutt over dager 2-8 (figur 3a), flere dyr (6 av 10) viste betydelig vekttap ( 5%) og en ble satt ned (vekttap 15%). Følgelig er denne dose av Ad5WT ble tatt som MTD, og behandlingen ble ikke videresendt.
I motsetning til dette, to dager etter administrering av den samme dose (6 x 10
9 vp) av Ad5mir122, mus viste ALT opplesninger som ligner PBS-kontroller (figur 3a). Imaging data bekreftet dette resultatet uten påvisbare lever luciferase (figur 3b). Lite eller ingen svulst infeksjon ble observert med denne dosen.
Dosen av Ad5mir122 ble derfor økt med en halv log til 2 × 10
10 vp, tre dager etter første injeksjon. Imaging på dag fem viste noen luciferase-aktivitet (som angir ekspresjon av E1A) i både tumor og lever, selv om absolutte verdier varierte mellom mus (data ikke vist). Gjennomsnittlig ALAT verdier viste en økning til 222 ALT enheter /L sammenlignet med 42 ALT enheter /L fra kontroller (figur 3a). På dagen seks dosen ble ytterligere økt med en halv log 6 × 10
10 vp. Imaging på dag åtte viste signifikant luciferase aktivitet i svulstene, men dette ble kombinert med målbar luciferase aktivitet også i leveren (figur 3c). ALT målinger viste bare en liten økning fra forrige dose (figur 3a). Denne studien bekreftet at 6 × 10
10 vp av Ad5mir122 var nær MTD for Admir122, i samråd med våre tidligere data i normale mus.
Gjenta administrasjon av Adenovirus kan forårsake kumulativ toksisitet [10]. For vurdering av effekt var det ønskelig å administrere virus ved flere anledninger, og dermed for gjentatte administrasjoner vi valgt dosenivåer som var en halv log lavere enn de beregnede MTDs av Ad5mir122 (2 × 10
10 vp /mus) og Ad5WT (2 × 10
9 vp /mus).
Effekt av Ad5mir122 og Ad5WT i en hepatoma xenograft modell
for å bestemme anti-kreft aktivitet av Ad5mir122, nakne mus med etablerte HepG2 xenografter var administrert 2 × 10
10 vp intravenøst på dag 0, 3, 19 og 22, mens kontrolldyrene fikk enten 2 × 10
9 vp av Ad5WT eller PBS. Behandling begynte med svulster mellom 10-20 mm
3 i størrelse. Tumorveksten ble undersøkt med hensyn til effektivitet og en overlevelses endepunkt (for Kaplan Meier grafen) ble innført da enkelte tumorvolumet nådde 400 mm
3. Dyr som viser den raskeste tumorveksten ble tillatt å fortsette utover dette punktet (opp til 1000 mm
3) for å tillate gruppe gjennomsnittlig tumorstørrelse til å nå 400 mm
3. Mus administrert Ad5mir122 viste signifikant reduserte tumorvolum fra dag 20 sammenlignet med PBS-kontroller (figur 4a). Imidlertid mus som mottok Ad5WT også vist betydelig anti-kreft-effekt. Dette er kanskje raskende i betraktning at Ad5WT har vist seg å ha kraftig anticancer aktivitet [29]. Det er viktig å understreke at de doser av Ad5mir122 og Ad5WT ikke ble equitoxic. Etter 4 dager i behandling med Ad5WT en mus ble satt ned på grunn av vekttap ( 15%) og levertoksisitet (figur 4b). Ingen slike bivirkninger forekom i gruppen som fikk Ad5mir122 på en 10 ganger høyere dose.
Gjenta administrasjon av Ad5mir122 (n = 10 mus) ved behandlingsdosen bestemmes fra figur 2 (2 × 10
10vp ) på dag 0, 3, 19 og 22 ved intravenøs injeksjon. Kontrolldyrene fikk gjentatt administrasjon av 2 × 10
9 vp Ad5WT eller PBS ved intravenøs injeksjon (n = 10 mus). A) Tumor volum av mus som fikk PBS eller Ad5mir122 eller Ad5WT ble beregnet som volumet av en ellipsoide [24]. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av en enveis ANOVA med Bonferroni en stolpe test (ns = ikke signifikant, * = P 0,05, ** = P 0,01) ved hvert tidspunkt. Feilfelt vises som standard feil. B) Kaplan Meier overlevelsesanalyse viser økt overlevelse av mus som fikk Ad5mir122 og Ad5WT i forhold til å styre mus som fikk PBS. Etter 4 dager i behandling med Ad5WT en mus ble satt ned på grunn av toksisitet. Ingen behandlingsrelaterte toksisitet ble observert under Ad5mir122 behandling eller behandling med PBS. Dager som vises på begge de horisontale aksen representerer antall dager siden den første viruset injeksjon.
Kaplan Meier analyse av mus administreres Ad5mir122 viste økt overlevelse med alle mus overlever lenger enn alle kontroller (figur 4b). Disse data viser at gjentatt administrasjon av Ad5mir122 ved doser over MTD av Ad5WT kan ha betydelige anti-kreft effekt uten toksisitet.
Vurdering av intrahepatisk Ad5mir122 E1A aktivitet
For å kvantifisere både E1A mRNA og protein som produseres av Admir122 på det optimale behandlingsdosen i forhold til Ad5WT, Balb /C-mus ble injisert med 2 x 10
10 op og leveren ble høstet etter 48 timer. Som ytterligere kontroller mus ble administrert PBS eller en E1A slettes ikke-reproduserende adenovirus type 5 koding luciferase (AdLuc) med samme dose. RNA ble ekstrahert og den store E1A 13S transkriptet ble målt ved hjelp av RT-QPCR. Ad5mir122 viste en 29 gangers nedgang i nivået av 13S E1A transkripsjons kopier sammenlignet med Ad5WT. E1A mRNA kopier per nanogram av total RNA var 4,57 × 10
6 og 1,54 × 10
5, henholdsvis. Dette bekreftet at stabiliteten av mRNA i seg selv er direkte påvirket av mikroRNA regulering, som ville være forventet (figur 5a).
A) RT QPCR for 13S E1A mRNA-transkript i leveren hos mus 48 timer etter intravenøs injeksjon med 2 × 10
10 vp av Ad5mir122, Ad5WT, Ad5Luc eller PBS. Ad5mir122 viser betydelig redusert E1A mRNA i løpet av leverinfeksjon i forhold til Ad5WT (N = 3). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en to tailed student T-Test (* P = 0,05). B) Western blot for å bekrefte at alle E1A proteiner variantene er slått ned. Hvert kjørefelt representerer protein hentet fra en individuell mus. Kontroll baner som inneholder lever fra mus behandlet med enten en E1A slettet Ad5Luc vektor eller PBS viser ingen E1A signal. Ad5WT behandling viser 3 klart definerte bånd tilsvarende proteiner fremstilt fra 13 S (36 kDa), 12S (26 kDa) og en mindre svakere bånd som kan representere 11S eller 10S E1A transkripsjon produkt. Behandling med Admir122 viser betydelig knockdown i E1A proteinnivåer for alle spleisevarianter. Blottet ble utsatt for 1, 5 og 10 minutter med 5 minutters eksponering presenteres her. Molekylvekt ble beregnet mot en tofarget molekylvekt stige (Bio-Rad).
For å bekrefte at redusert nivå av E1A mRNA resulterte i redusert E1A proteinproduksjon, og for å bekrefte at effekten var ikke E1A 13S spesifikk, leverproteinekstrakter ble analysert ved hjelp av western blot for E1A protein.
