Abstract
Tykktarmskreft er den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødelighet i verden – den viktigste årsaken til død av tykktarmskreft er levermetastaser, som kan behandles med isolerte lever perfusjon (IHP). Søker etter de mest klinisk relevante metoder for behandling av colorectal metastatisk sykdom ved isolert nedsatt perfusjon (IHP), utviklet vi bruk av oksaliplatin samtidig med hypertermi og humanisert død receptor 4 (DR4) antistoff mapatumumab (kart), og undersøkte de molekylære mekanismene for dette multimodalitet behandling i humane tykktarmskreft cellelinjer CX-1 og HCT116 så vel som menneskelige tykktarmskreftstamceller Tu-12, Tu-21 og Tu-22. Vi viste her, i denne studien, at den synergistiske virkning av den multimodalitet behandling apoptose var kaspase avhengig og aktivert død signalering via både den ytre apoptotiske reaksjonsvei og den indre vei. Døden signale ble aktivert av c-Jun N-terminal kinase (JNK) signalering som førte til BCL-xL fosforylering på serin 62, minkende anti-apoptotiske aktivitet av BCL-XL, noe som bidro til den indre vei. Den nedregulering av celle FLICE inhiberende protein lang isoform (c-FLIP
L) i den ytre vei ble oppnådd gjennom ubiquitinering ved lysinrest (K) 195 og proteinsyntese-inhibering. Overekspresjon av c-FLIP
L mutant (K195R) og BCL-xL mutant (S62A) fullstendig avskaffet synergistisk effekt. Det vellykkede resultatet av denne studien støtter bruk av multimodalitet strategi til pasienter med kolorektal levermetastaser som ikke klarer å svare på standard kjemoradioterapi som hovedsakelig er rettet mot mitokondrie apoptotiske sti
Citation. Song X, Kim SY, Lee YJ ( 2013) Bevis for to moduser av Synergistic Induksjon av apoptose av Mapatumumab og oksaliplatin i kombinasjon med hypertermi i menneske Colon kreftceller. PLoS ONE åtte (8): e73654. doi: 10,1371 /journal.pone.0073654
Redaktør: Raffaele A Calogero, Universitetet i Torino, Italia
mottatt: 31. mai 2013; Godkjent: 30 juli 2013; Publisert: 27 august 2013
Copyright: © 2013 Song et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: NCI tilskuddet fond (CA140554). Dette prosjektet brukte UPCI Kjerne Facility og ble støttet delvis av prisen P30CA047904. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP, noe som fører til ca 10% av kreftdødsfall i USA, er den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødeligheten i verden; død vanligvis resultater fra ukontrollert metastatisk sykdom. Dessverre er det bare 10-15% av innledende kolorektale levermetastaser vurderes resectable [1,2]. De inoperable tilfeller av levermetastatisk sykdom kan behandles med isolerte lever perfusjon (IHP), som innebærer en fremgangsmåte for å fullstendig vaskulær isolering av leveren for å tillate multimodalitet behandling av leversvulster [3-6].
Mapatumumab (kart) er et humant IgG1 agonistisk monoklonalt antistoff som utelukkende retter seg mot og aktiverer død receptor 4 (DR4) med høy spesifisitet og affinitet [7-9]. I korthet, kart binder seg til celleoverflaten av DR4 og utløser den ytre apoptotiske reaksjonsvei, hovedsakelig gjennom aktivering av pro-apoptotiske initiator caspase-8. Men fase II-studier viste liten eller ingen klinisk aktivitet av mono kart hos pasienter med avansert ildfast kolorektal kreft eller ikke-småcellet lungekreft [10,11]. Flere mulige molekylære mekanismer har blitt foreslått inkludert mutasjon /defekter i dødsreseptorer, dødsinduserende signale kompleks, capsases, proapoptotiske proteiner eller overekspresjon av anti-apoptotiske molekyler [12-14]. Det er således et kontinuerlig og stort behov for å utvikle gjelder strategier for å øke kart største effekt.
hypertermi, en behandling som ofte brukes sammen med isolerte lever perfusjon (IHP), maksimerer tumor skader og samtidig bevare den omgivende normalt vev [5, 6,15]. Oksaliplatin, en vanlig brukt kjemoterapeutisk middel for koloncancer, er antatt å utløse celledød hovedsakelig ved å indusere platina-DNA-addukt [3,16-18]. Vi har tidligere utviklet en multimodalitet behandling med oksaliplatin forbehandling i kombinasjon med kart og hypertermi å behandle menneskelige tykktarmskreft [19]. Imidlertid IHP levering av høye doser kjemoterapi eller biologisk behandling krever regionalt en standard operasjonsmetode, kontinuerlig intraoperativ lekkasje overvåking, og en ytre veno-pulmonal bypass [20]. Således oksaliplatin forbehandling ikke er oppnåelig i fremgangsmåten i IHP i klinikker, og alle komponenter i multimodalitet prosedyre må utføres samtidig.
I denne studien undersøkte vi det terapeutiske potensialet til klinisk relevant multimodalitet behandlingsplanen oksaliplatin og hypertermi i kombinasjon med kart på menneskelig tykktarmskreft cellelinjer og tykktarmskreft stamceller. Vi rapporterer her at multimodalitet behandling kan bevisstgjøre menneskelige tykktarmskreftceller til kart-indusert apoptose av flere molekylære virkningsmekanismer via både indre apoptotiske sti og den ytre vei.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC kulturer~~POS=HEADCOMP
Mennesketykktarmskreft CX-1 celler, som ble hentet fra Dr. JM Jessup (National Institutes of Health) [21], ble dyrket i RPMI-1640 medium (Gibco BRL) som inneholdt 10% føtalt bovint serum (HyClone). De humane kolorektalt karsinom HCT116-cellelinjer velvillig levert av Dr. B. Vogelstein (Johns Hopkins University) ble dyrket i McCoys 5A medium (Gibco-BRL) inneholdende 10% føtalt bovint serum [22]. Menneskelige tykktarmskreftstamceller, Tu-22, Tu-12 og Tu-21 [23], ble etablert av Dr. E. Lagasse (University of Pittsburgh) og dyrket i DMEM /F12 medium (Gibco BRL) inneholdende 0,5% storfefoster serum (HyClone) og 1% insulin, transferrin, og selen (ITS, Fisher Scientific). Alle cellene ble holdt i en 37 ° C fuktet inkubator med 5% CO
2.
Reagenser og antistoffer
oksaliplatin, MG132, cykloheksimid (CHX) og protease-inhibitor cocktail ble oppnådd fra Sigma Chemical Co. Mapatumumab (kart) var fra Human Genome Sciences (Rockville, MD, USA). JNK inhibitor (SP6001125) og G418 var fra Calbiochem. Anti-Flag, anti-caspase 8, anti-caspase 9, anti-caspase 3, anti-ubiquitin, anti-PARP, anti-fosforylert JNK /JNK og anti-BCL-xL antistoff var fra Cell Signaling. Anti-p-BCL-XL (S62) antistoff var fra Chemicon /Millipore. Anti-FLIP antistoff (Sf6) var fra Enzo miljø- og biovitenskap. Anti-aktin antistoff var fra Santa Cruz.
Behandling
Celler ble utsatt for hypertermi (42
° C) i nærvær /fravær av kart og oksaliplatin i 1 time, og deretter inkubert ved 37
° C i 3 timer eller 23 timer. For hypertermi ble celler forseglet med parafilm og plassert i et sirkulerende vannbad (Thomas Scientific), som ble opprettholdt i 0,02
° C over den ønskede temperatur.
Transient transfeksjon og stabil transfeksjon
For transient transfeksjon ble celler transfektert med Lipofectamine 2000 (Invitrogen), og ble behandlet 48 timer etter transfeksjon. For stabil transfeksjon ble cellene stabilt overekspresjon HA-BCL-xL villtype (WT) eller mutant typer utarbeidet ved trans CX-1 celler med HA-BCL-XL-WT, HA-BCL-XL-S62A (Ser62Ala), og HA-BCL-xL-S62D (Ser62Asp) og vedlikeholdes i 500 mikrogram /ml G418. CX-1-Bcl-xL S62A-celler ble transfektert med pLenti-Flag-FLIP
L og stabile kloner ble utvalgt med blasticidin (10 ug /ml). Bassenger med 3-kloner ble anvendt i forsøket.
MTS [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H tetrazodium, MTS] analyser
MTS studier ble utført ved hjelp av Promega CellTiter 96 vandige løsning Cell Proliferation Assay (Promega). CX-1-celler ble dyrket i vev-kultur-belagte 96-brønners plater, og behandlet som beskrevet i resultater. Cellene ble deretter behandlet med MTS /fenazin metosulfat løsning i 1 time ved 37 ° C. Absorbans ved 490 nm ble bestemt ved anvendelse av en enzymbundet immunosorbent assay-plateleser.
Annexin V-binding
Celler ble oppvarmet i fravær eller nærvær av kart og høstet ved trypsinering, vasket med serum- fritt medium, og suspenderes i bindingsbuffer (Annexin V-FITC Staining Kit, PharMingen). Denne cellesuspensjonen ble farget med muse anti-humant Annexin V-antistoff og PI og umiddelbart analysert ved flow-cytometri.
kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) -analyse
Totalt RNA ble ekstrahert og renset fra dyrkede celler ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge produsentens instruksjoner. RNA ble kvantifisert ved å bestemme absorbansen ved 260 nm. To mikrogram av total RNA fra hver prøve ble reverstranskribert inn i cDNA ved å bruke høy-kapasitet cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Inc.) i et volum på 20 ul. Kvantitativ PCR (qPCR) ble utført ved anvendelse av Applied Biosystems utvikles TaqMan-analyser (20X Primer Probe mix) svarende til CASP8 og FADD-lignende apoptose regulator (CFLAR; assay ID Hs00153439_m1), og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH; assay ID Hs02758991_g1 ). Alle reaksjoner ble utført med 2 X TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) på en Applied Biosystems StepOne Plus Real-Time PCR System i henhold til standard protokoller.
Immunpresipitasjon
I korthet ble cellene lysert i CHAPS lysebuffer med proteasehemmer cocktail (Calbiochem). 0,5-1 mg lysat ble inkubert med 1,5 ug av anti-Flag /ubikvitin-antistoff eller kanin IgG (Santa Cruz) ved 4
° C over natten, etterfulgt av tilsetning av protein A-agarose-kuler (Santa Cruz) og rotasjon ved romtemperatur i 2 timer, etterfulgt av immunblotanalyse.
immunoblotanalyse
Celler ble lysert med Laemmli lyseringsbuffer og kokt i 10 min. Proteininnholdet ble målt ved hjelp av BCA Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL, USA), separert ved SDS-PAGE og elektroforetisk overført til nitrocellulosemembran. Nitrocellulosemembranen ble blokkert med 5% fettfri tørrmelk i PBS-Tween-20 (0,1% v /v) i 1 time og inkubert med primært antistoff ved romtemperatur i 2 timer. Pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin eller anti-mus-IgG ble brukt som det sekundære antistoff. Immunreaktivt protein ble visualisert ved kjemiluminescens-protokollen (ECL, Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Tettheter av band ble analysert ved hjelp av Gel-pro søknad fra Media Cybernetics. Noen av de vestlige blotter i de samme panelene ble ikke produsert fra de samme blotter og ble strippet og reprobed med anti-aktin antistoff for å normalisere for forskjeller i protein lasting for å sikre lik protein lasting.
[
35S ] metionin inkorporering analyse
Celler ble behandlet med medium inneholdende 4 uCi av [
35S] -L-metionin og utsatt for hypertermi (42
° C) i nærvær /fravær av oksaliplatin (10 ug /ml) i 1 time, og deretter inkubert ved 37
° C i 3 timer. Cellene ble solubilisert med 1 ml av 0,25 N NaOH og fullstendig lysert ved å pipettere forsiktig. [
35S] metionin-inkorporering ble analysert ved hjelp av Wallac 1409 væskescintillasjonsteller (PerkinElmer, MA, USA). [
35S] -L-metionin innlemmelse nivåene ble beregnet ved å normalisere [
35S] -L-metionin tellinger per minutt, korrigert for ikke-spesifikk bakgrunn, til de totale protein nivåer.
site mutagenese
Lys 106 til Arg (K106R) og K195R mutasjoner av plasmidet pCR3.V64-Met-Flag-FLIP
L, som var en gave fra Dr. Jurg Tschopp (University of Lausanne), ble innført i c-FLIP
L-genet ved hjelp av helt komplementære mutagene primere (Quickchange seterettet mutagenese kit fra Agilent Technologies). Følgende mutagenese oligonukleotider ble brukt: følelse 5′-GAGATTGGTGAGGATTTGGATAGATCTG-ATGTGTCCTCATTAAT-3 «og antisense 5′-ATTAATGAGGACACATCAGATCTAT-CCAAATCCTCACCAATCTC-3′ for K106R mutant, sanse 5»-CAAGCAGCAATCCA-AAAGAGTCTCAGGGATCCTTCAAAT-3 «og antisense 5»-ATTTGAAGGATCCCTGAG-ACTCTTTTGGATTGCTGCTTG -3 «for K195R mutant. Mutanter ble bekreftet ved sekvensanalyse.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført med Graphpad INSTAT 3 programvare (GraphPad Software). Data som viser sammenligninger mellom to gruppene ble vurdert ved hjelp av Student t-test. Sammenligninger mellom mer enn to gruppene ble gjort ved hjelp av ANOVA med riktig post hoc testing. Statistisk signifikans er merket med stjerne (*, p 0,05 og **, p 0,01).
Resultater
multimodalitet behandling av oksaliplatin /kart /hypertermi aktiverer både indre og ytre trasé i menneskelige kolon kreftceller
i denne studien har vi forsøkt å utvikle klinisk relevant multimodalitet terapi for tykktarmsmetastatisk sykdom som kan behandles ved IHP. Cellelinjene brukes inkluderer: human kolorektal metastaserende HCT116 og CX-1 celler, og menneskelige tykktarmskreftstamceller, Tu-12, Tu-21 og Tu-22, som ble etablert av Dr. E. Lagasse (University of Pittsburgh) fra leveren av metastaserende tykktarmskreftpasienter og kultivert innenfor passasjer 10-30 [23]. Cancer stamceller (CSC) er i stand til å fornye seg selv, er tumorigen, og er i stand til å produsere de heterogene linjer av kreftceller som omfatter svulsten. CSC skal ikke bare være tilknyttet startfasen og vekst, men sannsynligvis vil være ansvarlig for metastaser samt [24,25]. For å undersøke effekten av multimodalitet behandling av oksaliplatin /kart /hypertermi-indusert cytotoksisitet, ble cellenes levedyktighet bestemt ved MTS-analyse. Som vist i figur 1A og 1B, var synergistisk effekt observert i oksaliplatin /kart /hypertermi, sammenlignet med noen annen enkelt behandling eller bi-behandling i begge cellelinjene (P 0,01). Figur 1C viser tydelig at synergistisk induksjon av apoptotisk død oppsto under behandling med oksaliplatin /kart /hypertermi. Lignende resultater ble oppnådd i menneskelige tykktarmskreftstamceller Tu-12, Tu-21 og Tu-22 (figur 1F). Disse synergistiske effekter var på grunn av en økning i aktivering av kaspaser (figur 1D). Figur 1D viser at 100 ng /ml kart resulterte i en liten mengde av kaspase 8 og 3 aktiveres, og dermed PARP spaltning (kjennemerket trekk ved apoptose). Interessant, hypertermi fremmet aktivering av kaspase 8, mens oksaliplatin fremmet caspase 9 aktivering. Dessuten ble den synergistiske effekten av multimodalitet behandling blokkert av Z-IETD-FMK (kaspase 8-inhibitor), Z-LEHD-FMK (caspase 9-inhibitor), og Z-DEVD-FMK (kaspase 3 inhibitor) i begge cellelinjene ( Figur 1E), noe som indikerer at begge baner spilte en viktig rolle i den synergistiske effekten av multimodalitet behandlingen.
(A, B) CX-1 og HCT116-celler ble utsatt for normotermisk eller hypertermiske (42 ° C) betingelser i 1 time i nærvær /fravær av kart og oksaliplatin og så inkubert i 23 timer ved 37 ° C i nærvær /fravær av kart og oksaliplatin. Cellenes levedyktighet ble analysert ved MTS-analyse. Feilfelt representerer SD fra tredoble eksperimenter. Asterisk ** representerer en statistisk signifikant forskjell (P 0,01). (C) CX-1-cellene ble utsatt for hypertermi (42 ° C) i 1 time i nærvær /fravær av kart og oksaliplatin og deretter inkubert i 3 timer ved 37 ° C i nærvær /fravær av kart og oksaliplatin. Etter behandling ble cellene farget med fluorescein-isotiocyanat (FITC) -Annexin V og propidiumjodid (PI). Apoptose ble gjenkjent av strømningscytometrisk analyse. (D) Efter behandling spaltingen av kaspase 8, caspase 9, caspase 3, eller PARP ble påvist ved immunblotting. Aktin ble anvendt for å bekrefte lik mengde av proteiner som er lagt i hver kolonne. (E) CX-1 og HCT116-celler ble behandlet med eller uten 20 pM Z-IETD-FMK (kaspase 8-inhibitor), Z-LEHD-FMK (caspase 9-inhibitor), og Z-DEVD-FMK (kaspase 3 inhibitor) for μmin fulgt av oksaliplatin /kart /hypertermi og spalting av PARP ble oppdaget av immunblotting. (F) Menneskelig tykktarm kreft stamceller, Tu-12, Tu-21 og Tu-22, ble utsatt for normotermisk eller hyper (42 ° C) betingelser i 1 time i nærvær /fravær av kart og oksaliplatin ved den angitte konsentrasjon og så inkubert i 23 timer ved 37 ° C i nærvær /fravær av kart og oksaliplatin. PARP ble påvist ved immunblotting. Actin ble brukt som lasting kontroll.
Dose svarene av oksaliplatin og hypertermi på kart-indusert apoptose
Vi har observert at når doser av kart og oksaliplatin økt, caspase 8/9 /3 aktivering og PARP-spaltning ble forbedret, noe som indikerer at den synergistiske virkning av den multimodalitet behandling apoptose var doseavhengig (figur 2A). Videre er resultatene tyder på at både de indre og ytre apoptotiske reaksjonsveier var involvert i den synergistiske effekten av multimodalitet behandling. Lignende data ble oppnådd i HCT116-celler (figur 2B).
(A) CX-1, og (B) HCT116-celler ble utsatt for hypertermi (42 ° C) i 1 time i nærvær /fravær av kart og oksaliplatin og inkubert i 3 timer ved 37 ° C i nærvær /fravær av kart og oksaliplatin. Etter behandling, ble spaltingen av kaspase 8, caspase 9, kaspase 3 eller PARP påvist ved immunblotting. Aktin ble anvendt for å bekrefte lik mengde av proteiner som er lagt i hver kolonne. (C) CX-1-cellene ble utsatt for hypertermi (42 ° C) i 1 time i nærvær /fravær av 100 ng /ml kart og 10 ug /ml oksaliplatin og deretter inkubert i 3 timer ved 37 ° C i nærvær /fraværet av kart og oksaliplatin. Etter behandling ble cellene immunoblottet med anti-fosfo-JNK /JNK, anti-fosfo-Bcl-xL /Bcl-XL og anti-FLIP-antistoffer. (D) CX-1-cellene ble utsatt for hypertermi (42 ° C) i 1 time i nærvær /fravær av kart (100 ng /ml-1000 ng /ml) og oxaliplatin (10 ug /ml-100 ug /ml) og inkubert i 3 timer ved 37 ° C i nærvær /fravær av kart og oksaliplatin. Etter behandling ble fosfor-JNK /JNK, fosfor-BCL-XL /BCL-xL og FLIP
L oppdaget av immunblotting. Aktin ble anvendt for å bekrefte lik mengde av proteiner som er lagt i hver kolonne. (E) HCT116-celler ble utsatt for hypertermi (42 ° C) i 1 time i nærvær /fravær av kart (10 ng /mL-100 ng /ml) og oxaliplatin (10 ug /ml-100 ug /ml) og deretter inkubert i 3 timer ved 37 ° C i nærvær /fravær av kart og oksaliplatin. Etter behandling ble fosfor-JNK /JNK, fosfor-BCL-XL /BCL-xL og FLIP
L oppdaget av immunblotting. Actin ble brukt til å bekrefte lik mengde proteiner som er lagt i hvert kjørefelt.
Multimodalitet behandling-indusert JNK-aktivering, BCL-xL fosforylering og reduksjon i c-FLIP
L nivå
for ytterligere å forstå mekanismene for hvordan de indre og ytre trasé var involvert i multimodalitet behandling-indusert apoptose, undersøkte vi BCL-xL samt c-FLIP. Figur 2C viser at det var ingen forandring i mengden av Bcl-xL protein, men fosforyleringen av Bcl-xL dramatisk øket, fulgt av JNK fosforylering. I tillegg var nivået av c-FLIP
L redusert betraktelig i løpet av multimodalitet behandling i CX-1-celler. Figur 2D viser at JNK ble aktivert og Bcl-xL ble fosforylert ved serin 62 på en doseavhengig måte i CX-1-celler. Interessant, nivået av c-FLIP
L dramatisk redusert når oksaliplatin ble kombinert med hypertermi. Lignende data ble innhentet i HCT116-celler (figur 2E).
kinetikk multimodalitet behandling i CX-en og HCT116 cellene
Vi observerte at effekten av multimodalitet behandlingen økte ettersom tiden kommet i CX-1 (figur 3A) og HCT116-celler (Figur 3B). JNK aktivering nådd maksimum 4 timer etter første behandling og gradvis redusert i løpet av multimodalitet behandling. Data fra immunoblot og bildebehandling gel Analyser viser at BCL-xL fosforylering nådde toppen rundt 12 timer etter behandlingen indikerer at JNK aktivisering var en tidlig hendelse og kan regulere BCL-XL fosforylering. I CX-1-celler nivået av c-FLIP
L dramatisk redusert ved 4 timer etter behandling av oksaliplatin i kombinasjon med hypertermi, mens i HT116 celler, nådde minimum 24 timer etter behandlingen.
CX 1 (A) og (B) HCT116-celler ble utsatt for hypertermisk (42 ° C) betingelser i 1 time i nærvær /fravær av kart og oksaliplatin og inkubert ved 37 ° C i nærvær /fravær av kart og oxaliplatin 3 t, 7 h, 11 h og 23 h. Etter behandling, spalting av caspase 8/9/3 og PARP, fosfor-JNK /JNK, fosfor-BCL-XL /BCL-xL og FLIP
L ble oppdaget av immunblotting. Aktin ble anvendt for å bekrefte lik mengde av proteiner.
Kravet til JNK-aktivering og Bcl-xL fosforylering i multimodalitet behandling apoptose
JNK inhibitor SP6001125 delvis reduserte oksaliplatin /kart /hypertermi-indusert PARP-spaltning i CX-1-celler, noe som indikerer at JNK-reaksjonsveien var avgjørende for behandling multimodalitet-indusert apoptose (figur 4A). Merkbart, SP6001125 sterkt redusert nivå av BCL-xL fosforylering i CX-1 celler, som gir sterke bevis for at multimodalitet behandling-indusert BCL-xL fosforylering krever JNK aktivering. Zhao et al. rapportert at JNK aktivering formidler c-FLIP downregulation [26]. Denne mulighet ble undersøkt i figur 4A. Vi har observert at ingen gjenopprettelse av c-FLIPL oppstått under behandling med SP6001125. Denne observasjonen var i samsvar med andre forskeres rapporter [27,28].
(A) Cellene ble forbehandlet med JNK inhibitor 25 mikrometer SP6001125 fulgt av oksaliplatin /kart /hypertermi og immunoblottet med anti-PARP, anti-fosfor -Bcl-xL og anti-BCL-xL antistoff. (B) transfektanter med kontroll plasmid (pcDNA), vill-type BCL-XL (BCL-XL-WT), Ser62 /Ala fosfor-defekt BCL-xL mutant (BCL-XL-S62A), eller Ser62 /Asp fosfor-ligne BCL-xL mutant (BCL-xL-S62D) ble behandlet med oksaliplatin /kart /hypertermi og immunoblottet med anti-PARP eller anti-BCL-xL antistoff. Actin ble brukt til å bekrefte lik mengde proteiner som er lagt i hvert kjørefelt.
For å evaluere effekten av BCL-xL fosforylering på Ser62 på sin anti-apoptotisk aktivitet, vi etablert CX-en-avledet celle linjer stabilt overekspresjon villtype BCL-xL (BCL-xL-WT), Ser62Ala fosfor-defekt BCL-xL mutant (BCL-xL-S62A), Ser62Asp fosfor-ligne BCL-xL mutant (BCL-xL-S62D), eller den tilsvarende tom vektor (pcDNA). Som forventet, overekspresjon av Bcl-xL-WT forhindret oksaliplatin /kart /hypertermi-indusert PARP cleavage. Interessant, overekspresjon av Bcl-xL-S62D forbedret PARP cleavage, mens det av BCL-XL-S62A hemmet PARP cleavage (figur 4B). Disse dataene tyder på at nivået av Bcl-xL og dets fosforylering ved S62 spiller en viktig rolle i den multimodalitet-indusert apoptose.
Reduksjon i c-FLIP
L nivå følgende hypertermi og oksaliplatin i CX-1 cellene
c-FLIP er den viktigste inhibitor for den ytre apoptotiske reaksjonsvei gjennom hemming av caspase-8-aktivering, og vi har observert at nivået av c-FLIP
L ble redusert etter hypertermi ved 42 ° C i 1 time i CX-1-celler som vist i figur 5A. Imidlertid c-FLIP
L ble gjenopprettet til det normale nivå etter 3 timer inkubering ved 37 ° C som var i overensstemmelse med våre tidligere papir [24]. Oxaliplatin (10 ug /ml, 4 H) alene ikke redusere nivået av c-FLIP
L. Interessant, nivået av c-FLIP
L ble opprettholdt ved et redusert nivå når hypertermi i kombinasjon med oxaliplatin.
(A) Cellene ble utsatt for 37 ° C eller 42 ° C i 1 time i nærvær /fravær av 10 pg /ml oksaliplatin og deretter høstet umiddelbart eller 3 timer etter inkubering ved 37 ° C. c-FLIP
L ble undersøkt med Western blot analyse. (B) Celler ble utsatt for 37 ° C eller 42 ° C i 1 time i nærvær /fravær av 10 pg /ml oksaliplatin og deretter inkubert i 3 timer ved 37 ° C. Kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) ble utført for å måle relativ c-FLIP-mRNA-nivå. Baren diagrammet representerer middelverdier (+ SD) fra tredoble eksperimenter. (C) Cellene ble utsatt for 37 ° C eller 42 ° C i 1 time i nærvær /fravær av 10 pg /ml oksaliplatin og deretter inkubert i 3 timer ved 37 ° C. Proteinsyntesen ble målt ved [
35S] metionin innlemmelse. (D) Celler ble behandlet med 30 ug /ml CHX, eller utsettes for hypertermi i nærvær eller fravær av CHX. Nivåene av c-FLIP
L og lasting kontroll aktin ble målt ved Western blot analyse. (E) Celler ble eksponert for hypertermi i 30 eller 60 minutter i nærvær /fravær av MG132. Lysatprøvene ble immunopresipitert med anti-ubiquitin-antistoff og protein G-Sepharose. Den ubiquitinmolekyler FLIP ble påvist ved Western-blot med anti-FLIP-antistoff. (F) Cellene ble transient transfektert med 4 ug plasmid inneholdende uekte, K106R (106 lysinrest ble erstattet med arginin), K195R, eller villtype (WT) c-FLIP
L. Etter 48 timers inkubering ble cellene eksponert for hypertermi ved 42 ° C i 1 time. Nivået av c-FLIP
L ble påvist ved hjelp av anti-FLIP-antistoff. Aktin ble anvendt som en intern kontroll. (G) Celler ble transient transfektert med flagg-merket c-FLIP
L WT eller K195R plasmid; 48 timer senere ble cellene underkastet hypertermi ved 42 ° C i 1 time. Nivåene av ubiquitinmolekyler c-FLIP
L ble oppdaget av IP med anti-Flag antistoff fulgt av Western blot hjelp av anti-ubiquitin antistoff. Tilstedeværelsen av transfekterte c-FLIP
L i lysatene ble bekreftet ved Western blot. Aktin ble vist som en indre standard. (H) Cellene ble transient transfektert med c-FLIP
L WT, K106R, eller K195R plasmid; 48 timer senere ble cellene oppvarmet ved 42 ° C i 1 time i nærvær /fravær av kart (100 ng /ml) og oxaliplatin (10 ug /ml) og deretter inkubert ved 37
° C i 3 timer. Lysater inneholdende like mengder protein ble immunoblottet med anti-PARP og anti-FLIP-antistoff. Aktin ble vist som en indre standard. (I) Cellene ble transient transfektert med c-FLIP
L WT, K106R, eller K195R plasmid; 48 timer senere ble cellene oppvarmet ved 42 ° C i 1 time i fravær eller nærvær av kart (100 ng /ml) og oxaliplatin (10 ug /ml), og deretter inkubert i 24 timer ved 37 ° C. Cellenes levedyktighet ble analysert ved MTS-analyse. Feilfelt representerer SD fra tredoble eksperimenter. Asterisk * representerer en statistisk signifikant forskjell (P 0,05).
Kvantitativ RT-PCR viste at ingen signifikant inhibering av c-FLIP ekspresjon på mRNA-nivå var tydelig etter hypertermi, oksaliplatin, eller kombinasjonen (figur 5B). Vi har observert i figur 5C at 25% av proteinsyntese ble inhibert i hypertermi, mens det var 46% proteinsyntese-inhibering i oksaliplatin i kombinasjon med hypertermi. Figur 5D viser at reduksjon av c-FLIP
L-nivå ved 42 ° C i 1 time oppvarming alene var mer enn det ved 30 ug cyclohexmide som inhiberer proteinsyntese med 99% [28]. Disse resultatene foreslår at proteinsyntese-inhibering alene er ikke en viktig faktor for nedregulering av FLIP
L av hypertermi. Bemerkelsesverdig, c-FLIP
L ble gjenfunnet i løpet av tre timer fra normotermisk tilstand, noe som indikerer at c-FLIP
L ble resyntetisert. Men oppgangen ble forsinket ved behandling med hypertermi og oksaliplatin, som proteinsyntesen var betydelig hemmet.
Figur 5E viser at ubiquitinering av endogen c-FLIP
L økes ved hypertermi behandlinger. Videre proteasominhibitor MG132 blokkert nedbrytning av c-FLIP
L, som bekrefter eksistensen av proteasomal-mediert degradering av proteinet etter hypertermi.
Den elektroniske programvare UbPred, som spår protein ubiquitinering områder, viste at lysin 106 og 195 hadde de høyeste poengsummene. Vi har erstattet 106 og 195 lysin med arginin og undersøkt stabiliteten av full-lengde c-FLIP
L som bærer den resulterende punktmutasjon. Som vist på figur 5F, i transfeksjon gruppen, c-FLIP
L K106R var lett nedbrutt når de utsettes for hypertermi mens K195R var motstandsdyktige overfor nedbrytning ved hypertermi. Figur 5G bekrefter at C-FLIP
L villtype (WT) ble effektivt ubiquitinmolekyler men ikke den K195R mutant, som ble funnet praktisk talt uten ubiquitinering. Vi observerte at c-FLIP
L K195R uttrykkende celler var de mest motstandsdyktige mot behandling multimodalitet-indusert apoptotisk celledød (figur 5H og 5I). Disse resultater antyder at den forbigående hypertermi-mediert nedbrytning av c-FLIP
L involvert ubiquitinering av K195, og K195R mutant dratt motstand mot multimodalitet behandlings-indusert apoptotisk død.
oppheving av den synergistiske virkning ved overekspresjon av c-FLIP
L K195R og Bcl-xL-S62A i CX-1 og HCT116-celler
til slutt sammenlignet vi effekten av multimodalitet behandling i CX-1 og HCT116-celler overuttrykkes med c-FLIP
L WT, BCL-xL-S62A, BCL-xL-S62A + c-FLIP
L WT (Figur 6A og 6B) og c-FLIP
L K195R, BCL-xL-S62A, Bcl- xL-S62A + c-FLIP
L K195R (figur 6C og 6D). Vi observerte at c-FLIP
L WT /K195R eller Bcl-xL-S62A delvis blokkerte effekten av multimodalitet behandling. Av notatet, ble multimodalitet behandling-indusert apoptose nesten helt blokkert av overekspresjon av både c-FLIP
LWT /K195R og BCL-XL-S62A (Figur 6A og 6C), noe som indikerer c-FLIP
L og Bcl- xL var uavhengige faktorer som bidrar til den synergistiske effekten av multimodalitet behandling. Lignende resultater ble oppnådd i celleviabilitet analysen (figur 6B og 6D). Våre resultater tyder på at (a) reduksjon av c-FLIP
L-nivå og (b) Bcl-xL fosforylering ved Ser62 begge er ansvarlig for den synergistisk induksjon av apoptose av de klinisk relevante multimodalitet behandling.
( A) CX-1-celler som stabilt uttrykt med pcDNA, c-FLIP
L WT, BCL-xL-S62A og c-FLIP
L WT + BCL-xL-S62A, og tre stabile kloner ble slått sammen, og cellene ble oppvarmet ved 42 ° C i 1 time i nærvær /fravær av kart (10 ng /ml) og oxaliplatin (10 ug /ml) og deretter inkubert ved 37
° C i 3 timer. Spaltingen av PARP, og nivået av c-FLIP
L og Bcl-xL ble påvist ved Western blot-analyse. (B) Cellelevedyktigheten ble analysert ved hjelp av MTS-analyse 24 timer etter behandling. Feilfelt representerer SD fra tredoble eksperimenter. Asterisk ** representerer en statistisk signifikant forskjell (P 0,01). (C) HCT116-celler ble transient transfektert med lik mengde plasmid som inneholder uekte, c-FLIP
L K195R, BCL-XL-S62A og c-FLIP
L K195R + BCL-XL-S62A. Etter 48 timers inkubering ble cellene oppvarmet ved 42 ° C i 1 time i nærvær /fravær av kart (10 ng /ml) og oxaliplatin (10 ug /ml) og deretter inkubert ved 37
° C i 3 timer.
