Abstract
Den ikke-inte laminin reseptoren, her betegnet 37-kDa /67-kDa laminin-reseptor (LRP /LR), er involvert i mange fysiologisk relevante prosesser, så vel som tallrike patologiske tilstander. Overekspresjon av LRP /LR på ulike kreftcellelinjer spiller viktige roller i tumormetastase og angiogenese. Denne studien undersøkte om LRP /LR er involvert i vedlikehold av mobilnettet levedyktighet i lunge og livmorhalskreft cellelinjer. Her vises en signifikant reduksjon i cellelevedyktigheten i de ovenfor nevnte cellelinjene som følge av den siRNA-mediert nedregulering av LRP. Denne reduksjonen i cellulær levedyktighet skyldes økt apoptotiske prosesser, som reflekteres av tap av nukleær integritet og betydelig økning i aktiviteten av caspase-3. Disse resultatene indikerer at LRP /LR er involvert i vedlikehold av mobilnettet levedyktighet i tumorigent lunge og livmorhalsen celler gjennom blokkering av apoptose. Knockdown av LRP /LR av siRNA kan representere en alternativ terapeutisk strategi for behandling av lunge og livmorhalskreft
Citation. Moodley K, Weiss SFT (2013) nedregulering av den ikke-Inte Laminin Receptor Reduserer Cellular levedyktighet av indusere apoptose i lunge og livmorhalskreftceller. PLoS ONE 8 (3): e57409. doi: 10,1371 /journal.pone.0057409
Redaktør: Elad Katz, AMS bioteknologi, Storbritannia
mottatt: 21 november 2012; Godkjent: 21 januar 2013; Publisert: 05.03.2013
Copyright: © 2013 Moodley, Weiss. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. NRF, Sør-Afrika. MRC, Sør-Afrika. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Laminins tilhører en stor familie av ekstracellulære matriks-proteiner som er involvert i en rekke biologisk viktige prosesser, blant annet celledifferensiering, migrasjon, adhesjon, vekst og signale [1]. Virkningene av laminins er ofte mediert via deres interaksjon med integrin og ikke-integrin-laminin-bindende proteiner, som virker som reseptorer og koblingen laminin i den ekstracellulære matriks til intracellulære signalkaskader [1].
En hoved laminin bindings partner er en multifunksjonell protein, betegnet her som 37-kDa /67-kDa laminin reseptoren (LRP /LR). 67-kDa laminin-reseptoren er dannet fra den 37-kDa laminin reseptor-forløperen [2], [3]. Den eksakte mekanismen for denne konverteringen er for tiden fortsatt unnvikende, men noen studier har antydet at ikke-glykosylerte 37-kDa formen blir acylert på Ser2 gjennom handling av fettsyrer; og denne acylering er et kritisk trinn i omdannelsen av 37-kDa formen til det 67-kDa-form [4], [5].
LRP /LR er et ikke-integrin celleoverflatereseptor som oppviser en høy affinitet til laminin-1 [6], og har blitt funnet å lokalisere i cytoplasma [7], [8], [9], på celleoverflaten [10], [11], i det perinukleære rommet [7], [12], [13] og i kjernen [12], [13]. I hver av disse stedene, er LRP /LR involvert i en rekke fysiologiske prosesser, inkludert protein syntese [8], modningen av 40S ribosomale subenheten [8], som fungerer som en reseptor for ekstracellulære matrisekomponenter f.eks karbohydrater og elastin [14], interaksjoner med celle prionproteinet [13], [15] og foreninger med histoner [12].
I tillegg til sine mange fysiologiske roller, LRP har vært innblandet i en rekke patologiske prosesser – det tjener som en reseptor for smittsomme prioner [16], visse bakterier [17], og forskjellige viruser [18], [19], [20]. Mest spesielt, en rekke krefttyper, for eksempel gastrisk [21], tykktarm [22], kolorektal [23], cervical [24], bryst [25], lunge [26], eggstokk [27], bukspyttkjertel [28] og prostata [29] kreftformer, viser en overekspresjon av 67-kDa LR på deres celleoverflate, ved bruk av anti-LRP /LR spesifikke antistoffer reduseres vesentlig adhesjon og invasjon av kreft-celler
in vitro product: [6 ], [30], viktige komponenter i metastasering. En sterk sammenheng er også etablert mellom LRP /LR og kreft angiogenese, med uttrykk av dette proteinet korrelere til økt tumor angiogenese [31]; Vi har nylig oppdaget at det LRP /LR spesifikt antistoff, W3, blokkerte angiogenese [32].
Siden den målretting av LRP /LR på kreftceller har vist seg å være vellykket med hensyn til reduksjon av tumormetastase [6], [30], er rollen til denne reseptoren på kreftcelle levedyktighet og overlevelse har blitt et tema av stor interesse. Denne studien er derfor rettet mot å vurdere effekten av den siRNA-mediert knockdown av LRP på levedyktigheten og overlevelse av lunge- og cervical kreft celler og for å bestemme den mulige mekanistiske tilnærminger til de observerte effekter. Lunge og livmorkreftceller ble valgt for denne studien som representerer de to øverste diagnostisert krefttyper i sørlige afrikanske menn og kvinner henholdsvis. Vi har vist i denne studien at siRNA-mediert knockdown av LRP /LR i A549 og HeLa-celler forårsaket en signifikant reduksjon i levedyktigheten til disse cellene. I tillegg ble det vist at denne reduksjonen i mobilnettet levedyktighet var som en konsekvens av cellene gjennomgår apoptose.
Materialer og Metoder
Cell Kultur og betingelser
A549 og HeLa-celler ble oppnådd fra ATCC, dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% penicillin /streptomycin og holdt i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 95% luft og 5% CO
2.
Flow cytometry
Strømningscytometri ble utført for å bestemme celleoverflate nivåene av LRP på A549 og HeLa-celler. I korthet ble cellene frittliggende, pelletert og fiksert i 4% paraformaldehyd. Cellene ble deretter inkubert i 30 ug /ml av de primære LRP-spesifikke antistoff IgG1-iS18 i Epics ™ skjermfluid i 1 time. Cellene ble deretter vasket i Epics ™ skjermfluid og inkubert i 30 ug /ml geit-anti-kanin-IgG humane objekter-FITC sekundært antistoff (Beckman Coulter) i Epics ™ skjermfluid. Deretter ble cellene vasket i Epics ™ skjermfluid og analysert.
Western blotting
Western blotting ble brukt for å bestemme de samlede og downregulated proteinnivåer av LRP (β-actin anvendt som en kontroll laste ) etter transfeksjon med siRNA-LAMR1. I korthet ble cellene lysert, proteinnivåer kvantifisert og 5 ug av urent cellelysat løst på en 12% polyakrylamidgel. Proteinene ble deretter overført til en nitrocellulosemembran ved halvtørr elektroblotting i 45 minutter. Membranen ble blokkert i 3% BSA, inkubert i en 1:10 000 oppløsning av LRP-spesifikke primære antistoff IgG1-iS18 i 3% BSA i PBS-Tween i 1 time ved 4 ° C med risting. Membranen ble deretter vasket i PBS-Tween, videre inkubert i en 1:10 000 oppløsning av anti-humant POD sekundært antistoff i 3% BSA i PBS-Tween i 1 time ved 25 ° C med risting, ble vasket som før og analysert.
siRNA-mediert nedregulering av LRP
A549 og HeLa celler ble transfektert for LRP knockdown med siRNA kjøpt fra Dharmacon, Cat # J-013303-08, ifølge produsentene instruksjon hjelp DharmaFECT® en transfeksjon reagens. Kontroll siRNA brukt – Cat # D-001810-01-05
MTT analysen
0,6 × 10
4 A549 og 3 × 10
3 HeLa-celler ble sådd i den. brønner i en 96-brønners plate. Cellene ble så transfektert med siRNA-scr eller siRNA-LAMR1, som beskrevet, og fikk inkubere i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 95% luft og 5% CO
2 i 72 timer. 10 ug av MTT oppløst i PBS ble deretter tilsatt til hver brønn en inkubert i 2 h som før. Mediet ble fjernet fra hver brønn og lilla formazankrystaller ble oppløst i 200 ul DMSO. Absorbansen av hver brønn ble målt ved 570 nm ved hjelp av en ELISA-plateleser.
immunfluorescens Mikros
4 × 10
5 A549 og 3,5 × 10
5 HeLa-celler ble sådd på Dekk i brønnene i en 6-brønners plate. -Celler ble transfektert med siRNA-scr og siRNA-LAMR1, som beskrevet og inkubert i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 95% luft og 5% CO
2 i 72 timer. Glassene ble fjernet og cellene fiksert i 1% paraformaldehyde, farget med Hoechst 33342 (1:10 000 i PBS) og analysert ved hjelp av fluorescens mikroskopi.
Caspase-3 Activation analysen
4 × 10
5 A549 og 3,5 x 10
5 HeLa-celler ble sådd inn i brønnene i en 6-brønners plate. -Celler ble transfektert med siRNA-scr og siRNA-LAMR1, som beskrevet og inkubert i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 95% luft og 5% CO
2 i 72 timer. Aktiviteten av caspase-3 ble analysert ved anvendelse av Caspase-3 Assay Kit (Sigma-Aldrich) i henhold til produsentens instruksjon.
statistisk evaluering
Data ble statistisk analysert med Dunnetts test ved bruk av GraphPad INSTAT. Resultatene ble ansett som statistisk signifikant når p-verdien var mindre enn 0,05.
Resultater
Lung og livmorhalskreft Cells Vis Høye celleoverflaten nivåer av LRP /LR og Total nivåer av LRP
Siden den overekspresjon av LRP er blitt observert i en rekke kreftcellelinjer, ble celleoverflate nivåene av LRP /LR og de totale nivåer av LRP på A549 og HeLa-celler bestemt ved strømningscytometrisk analyse og western blotting henholdsvis (figur 1). Strømningscytometri viste at 83% og 80% av A549 og HeLa-celler, henholdsvis, uttrykt LRP /LR på deres celleoverflate (figur 1A og 1B), disse verdiene er høye i forhold til LRP /LR celleoverflatenivå (57%) av den ikke-tumorigen cellelinje, NIH 3T3, (data ikke vist), og bekrefter resultatene oppnådd i tidligere studier [30]. LRP ble funnet å bli uttrykt i begge cellelinjer ved western-blotting, i tillegg, etter densitometrisk analyse av de oppnådde Western blot signaler viste at A549 og HeLa-celler viser tilsvarende nivåer av dette proteinet (figur 1C).
A) 83% av A549 og B) 80% av HeLa-celler som vises LRP /LR på sin overflate (venstre og høyre toppene er representative for ikke-merkede celler og celler inkubert først med anti-LRP IgG1-iS18-antistoff og deretter med geit anti -kaninIgG menneskelige annonser-FITC sekundært antistoff, henholdsvis). C) A549 (baner 1-3) og HeLa (baner 4-6) celler express LRP og densitometrisk analyse viste ikke signifikant (p . 0,05) forskjeller i total LRP nivåer mellom de to cellelinjene
Fastsettelse av siRNA-mediert nedregulering av LRP Expression i lunge og livmorhalskreft Cells
nivået~~POS=HEADCOMP LRP uttrykk i A549 og HeLa-celler etter transfeksjon med siRNA-LAMR1 ble bestemt ved hjelp av western blotting og kvantifisert ved densitometri (Figur 2). Densitometrisk analyse av de oppnådde Western blot signaler viste at A549 (figur 2A) og HeLa (figur 2B) celler transfektert med siRNA-LAMR1 uttrykte 80% og 60% mindre LRP, henholdsvis, sammenlignet med ikke-transfekterte kontroller som ble satt til 100% .
uttrykket nivået av LRP i A549 og HeLa-celler ble undersøkt 72 timer etter transfeksjon med siRNA-LAMR1. Densitometrisk analyse av western blot-signaler viste en signifikant (** p 0,01) 83% og 60% reduksjon i LRP protein ekspresjon i A) A549 og B) HeLa-celler, respektivt, sammenlignet med kontroll ikke-transfekterte celler (satt til 100% ).
den siRNA-mediert knockdown av LRP Expression Forårsaker en betydelig reduksjon i levedyktigheten til Lung og livmorhalskreft Cells
effekten av siRNA-mediert nedregulering av LRP protein uttrykk på cellulær levedyktighet i A549 og HeLa-celler, ble bestemt ved bruk av et MTT-assay. Celler ble inkubert med 8 mM PCA (en forbindelse som er kjent for å redusere cellulær levedyktighet gjennom induksjon av apoptose [33]) som en positiv kontroll og transfektert med et ikke-målsøkende siRNA (siRNA-SCR) som en negativ kontroll. 8 mm PCA og siRNA-LAMR1 verdier ble sammenlignet med siRNA-scr verdier, som hadde blitt satt til 100%. Resultatene fra denne analyse tyder på at signifikant (* p 0,05, ** p 0,01) reduksjon i levedyktigheten til A549 og HeLa-celler (13% og 18%, henholdsvis) er som et resultat av den reduserte ekspresjon av dette proteinet (Figur 3).
Levedyktigheten til A549 og HeLa-celler ble analysert 72 timer etter transfeksjon ved hjelp av et MTT-assay. A) A549 og B) HeLa-celler transfektert med siRNA-LAMR1 viste en signifikant (* p 0,05, ** p 0,01) 13% og 18% reduksjon i cellulære levedyktighet, henholdsvis, sammenlignet med siRNA-scr som var blitt satt til 100% (8 mm PCA ble brukt som positiv kontroll).
Den siRNA-mediert nedregulering av LRP Expression fører til tap i Nuclear morfologi i lunge og livmorhalskreft Cells
for å undersøke en mulig mekanisme for den observerte bort i cellulær levedyktighet i respons til LRP knockdown i A549 og HeLa-celler, ble kjernemorfologi av de nevnte cellene vurdert. A549 og HeLa-celler ble transfektert med siRNA-LAMR1, inkubert med 8 mM PCA (en kjent induser apoptose [33]) som en positiv kontroll og transfektert med siRNA-scr (negativ kontroll). Cellene ble deretter farget med det fluorescerende fargestoff atom Hoechst 33324 og vises på en immunfluorescens mikroskop. Atom bildene innhentet for siRNA-LAMR1 ble sammenlignet med siRNA-scr – kjerner vises innsnevret og klart tap av kjernefysisk morfologi og integritet er observert (Figur 4-hvite piler). I tillegg, ble prosentandelen av celler som viser morfologiske endringer bestemmes ved å telle antallet celler med og uten atom morfologiske endringer i 3 mikrografer. 56% av A549-celler og 91% av HeLa-celler utviste atom morfologiske forandringer i respons til siRNA-LAMR1 behandling (7% og 8% av siRNA-scr behandlede A549-celler og HeLa-celler, henholdsvis, viste atom morfologiske endringer).
72 timer etter transfeksjon, A549 og HeLa celler ble farget med Hoechst 33342 og sett av immunfluorescens mikroskopi. Celler transfektert med siRNA-LAMR1 utstillings redusert kjernekraft integritet – angitt med hvite piler (8 mm PCA ble brukt som positiv kontroll)
siRNA-mediert knockdown av LRP forårsaket en betydelig økning i Caspase-3 aktivitet. i lunge og Cervical Cancer Cells
aktiviteten av apoptose-assosierte effektor protein, caspase-3, som svar på den siRNA-mediert nedregulering av ekspresjon i LRP A549 og HeLa-celler ble vurdert ved hjelp av en caspase-3 aktivering analyse. A549 og HeLa celler ble transfektert med siRNA-LAMR1, inkubert med 8 mm PCA (en apoptose indus [33] – positiv kontroll) og transfektert med siRNA-SCR (negativ kontroll). Aktiviteten av caspase-3 fra celler transfektert med siRNA-LAMR1 ble sammenlignet med de som er transfektert med siRNA-scr (som var blitt satt til 100%); Disse resultatene viser en signifikant (** p 0,01, *** p 0,001). økning av caspase-3 aktivitet i A549 og HeLa-celler transfektert med siRNA-LAMR1 (9% og 83%, henholdsvis) (figur 5)
aktiviteten av apoptose-assosierte proteiner, caspase-3, A549 og HeLa-celler ble analysert 72 timer etter transfeksjon. A) A549 og B) HeLa-celler transfektert med siRNA-LAMR1 viser en signifikant (* p 0,05, ** p 0,001) 9% og 83% økning av caspase-3 aktivitet, respektivt, sammenlignet med siRNA-scr som har er satt til 100% (8 mm PCA ble brukt som positiv kontroll).
Diskusjoner
rolle laminin reseptoren i kreft progresjon har vært et tema av stor interesse for mange år og har derfor blitt grundig undersøkt. Tallrike studier har implisert celleoverflate LRP /LR i utviklingen av kreft – denne reseptoren blir overuttrykt på overflaten av en rekke kreftcellelinjer, for å gi dem mulighet til å metastasere, og invadere omgivende vev [6], [30]. Gitt at LRP /LR er involvert i en rekke cellulære prosesser og finnes i en rekke cellulære steder (celleoverflaten, cytoplasma, det perinukleære rommet og nucleus), flere roller for denne reseptor i progresjon av kreft er blitt foreslått.
for å bekrefte uttrykket av LRP /LR i A549 og HeLa-celler, celleoverflaten og totale nivåer av dette proteinet ble undersøkt ved hjelp av flowcytometri og western blotting, henholdsvis (figur 1). De tumorigene lunge- og livmorhalscancerceller vises både LRP /LR på sin overflate, og nivået av dette proteinet på overflaten av disse cellene ble funnet å være høyere enn nivået observert i den ikke-tumorigen cellelinje NIH 3T3 (mus embryo fibroblast ). Dette funn bekrefter tidligere forskning, og antyder en rolle for denne reseptoren i progresjonen av celler fra å være normal til å bli kreft. I tillegg er tumorigene lunge- og cervikale kreftceller uttrykker begge LRP internt, og forskjellen i den interne nivået av dette proteinet i disse cellelinjene er ubetydelig.
For å undersøke rollen til LRP /LR i cancer /cytotoksisk prosesser, uttrykket ble betydelig redusert i tumorigent lunge og livmorhalskreftceller. siRNA rettet mot LRP mRNA ble transfektert inn i de nevnte celler og andelen av LRP nedregulering vurdert ved densitometrisk analyse av oppnådde Western blot-signaler (figur 2). Nivået av LRP-ekspresjon ble redusert med 83% og 60% i A549 og HeLa-celler, henholdsvis, noe som indikerer effekten av siRNA anvendes.
Virkningen av knockdown av LRP ekspresjon på levedyktigheten av kreftceller , som er en viktig egenskap av sykdommen, ble undersøkt. LRP nedregulering ble funnet å korrelere med en betydelig reduksjon i levedyktigheten til A549 og HeLa-celler (figur 3), noe som indikerer en viktig rolle for LRP i denne prosessen. Ettersom vedlikehold av cellulær levedyktighet er absolutt nødvendig for formering av kreftceller, antydet at LRP er involvert i opprettholdelsen av denne prosessen ytterligere impliserer dette proteinet i sykdommen.
En reduksjon i cellelevedyktigheten ble imidlertid også bemerket mellom ikke-transfektert og siRNA-SCR prøver i HeLa celler (data ikke vist) og DharmaFECT® en transfeksjon reagens ble vist seg å være den utløsende agent i denne reduksjonen (se utfyllende data – Figur S1).
i for å undersøke om apoptose (en form for programmert celledød) ble indusert i tumorigen lunge og cervikale kreftceller som en konsekvens av LRP knockdown, og følgelig å være ansvarlig for den observerte reduksjon i cellulære levedyktighet, vurderte vi mulige endringer i atom morfologi cellen og graden av aktivitet av apoptose-assosierte effektorproteinet – caspase-3 (nøkkelprosesser som indikerer apoptoseinduksjon [34], [35], [36], [37], [38]). Tilstedeværelsen av apoptotiske A549 og HeLa-celler etter transfeksjon med siRNA-LAMR1 ble identifisert ved synlige forstyrrelser i sin kjernemorfologi (figur 4), så vel som ved den betydelige økning i aktiviteten caspase-3 (Figur 5).
rollen til LRP i opprettholdelse av cellelevedyktighet har blitt rapportert i tidligere studier [7], i tillegg, induksjon av apoptose i kreftceller i respons til LRP nedregulering er også blitt vist [39]. Dette studium bekrefter rollen til LRP i opprettholdelse av cellelevedyktighet så vel som induksjon av apoptose etter den knockdown av dette protein. Dessuten har denne studien viste at induksjon av apoptose er mediert av både et tap i kjerneintegritet og betydelig økt aktivitet av kaspase-3 i disse cellene.
Siden den laminin-reseptoren er fysiologisk funksjonelt i det perinukleære rommet [ ,,,0],7], [12], [13] og kjernen [12], [13], var det ikke overraskende at knockdown av denne reseptoren vil påvirke integriteten til kjernen. Både avbrudd av kjernefysiske morfologi og den økte aktiviteten av apoptose-assosierte proteiner, caspase-3, er tegn på apoptose, hvilket antyder en viktig rolle for LRP /LR i blokkering av denne form for celledød. Imidlertid kvantifisering viste at 91% av siRNA-LAMR1 behandlede HeLa-celler, men bare 56% av siRNA-LAMR1 behandlede A549-celler viste atom morfologiske endringer (7% og 8% av siRNA-scr behandlet A549 og HeLa-celler, henholdsvis, avslørte atom morfologisk Endringer). Siden knockdown av LRP i HeLa-celler (60%) ble lavere sammenlignet med A549 celler (83%), foreslår vi at LRP /LR hindrer apoptose i større grad i livmorhalskreftceller sammenlignet med lungekreft celler. Siden 83% av HeLa-celler, men bare 9% av A549-celler viste økt caspase-3-aktivitet etter siRNA-LAMR1 behandling, vi foreslår videre at apoptose i lungekreftceller kan oppstå hovedsakelig via caspase-3 uavhengige mekanismer som EndoG og /eller AIF medierte prosesser
funksjonene til LRP /LR i kreft forplantning er mange:. økt invasjon [6], [30], metastase [6], [30] og cellulær proliferasjon [7], så vel som nedsatt cellulær levedyktighet [7] og apoptose [39] blir mediert av dette proteinet. Målrette LRP /LR kan derfor utvikles som en strategi for å hindre de ovennevnte prosesser involvert i kreft progresjon. I tillegg er rettet mot LRP /LR for den mulige behandling av disse prosessene har blitt oppnådd i en rekke kreftcellelinjer. Dette antyder derfor at en LRP /LR relatert terapi kan potensielt bli anvendt for behandling av mange forskjellige kreftformer. Det må imidlertid understrekes at denne reseptoren er involvert i mange fysiologiske prosesser i normale celler, inkludert cellevekst, differensiering, bevegelse og feste [9], [11], og den knockdown av LRP i disse celler vil resultere i uønskede homeostatiske forstyrrelser. Satsingen på LRP utelukkende på kreftceller er derfor avgjørende for dens bruk som en terapeutisk alternativ.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
effekten av siRNA-scr og DharmaFECT® en reagens på mobilnettet levedyktighet. Celler ble inkubert med siRNA-scr, DharmaFECT® en reagens eller begge deler, og 72 timer senere, cellelevedyktigheten ble bedømt ved bruk av et MTT-assay. Celler transfektert med siRNA-scr viser lignende levedyktighet, mens DharmaFECT® 1 og siRNA-scr + DharmaFECT® 1 behandlede celler viser en 8% og 9% reduksjon i celleviabilitet, respektivt, sammenlignet med kontrollceller (inkubert i 72 timer i DMEM som inneholdt 10% (v /v) FCS)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0057409.s001 plakater (TIF)
takk
Vi takker Uwe Reusch, Stefan Knackmuss og Melvyn lite for å få hjelp produsere IgG1-iS18. Vi takker Dr. Clement Penny for å få hjelp med immunfluorescens mikroskopi.
