Abstract
LIN28B er involvert i «stemness» og tumorgenesen av negativt regulere modning av
la-7
mikroRNA familiemedlemmer. I denne studien viste vi at LIN28B uttrykk fremmer migrasjon og tilbakefall av kreft i tykktarmen. Immunhistokjemi og revers-transkripsjon polymerase kjedereaksjoner ble utført for å påvise LIN28B uttrykk i tykktarm kreft microarray, parafininnstøpte kirurgiske resected vev og kreftceller. Tap-av-funksjon, ble migrasjon og spredning analyser utført for å avgrense mulige roller LIN28B i tykktarmskreft. LIN28B ble oppregulert i tykktarm kreft vev i forhold til normal slimhinne, og dens overekspresjon korrelert med redusert pasient overlevelse og økt svulst gjentakelse. LIN28B undertrykkelse hemmet migrasjon av SW480 tykktarm kreft celler og tilrettelagt cytotoksisitet indusert av oksaliplatin i SW480 og HCT116 tykktarmskreftceller. I konklusjonen, bidrar LIN28B overekspresjon til tykktarms tumorgenesen, og LIN28B kan tjene som et diagnostisk verktøy og terapeutisk mål for tykktarmskreft
Citation. Pang M, Wu G, Hou X, Hou N, Liang L, Jia G , et al. (2014) LIN28B Fremmer Colon Cancer Migrasjon og regelmessighet. PLoS ONE 9 (10): e109169. doi: 10,1371 /journal.pone.0109169
Redaktør: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, Taiwan
mottatt: 6 juli 2014; Godkjent: 28 august 2014; Publisert: 31 oktober 2014
Copyright: © 2014 Pang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Department of Public Health i Sichuan-provinsen (110167). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
LIN28
ble først identifisert i
C. elegans Hotell og viste seg å være ansvarlig for tidspunktet for utvikling [1]. LIN28 induserer pluripotency når det uttrykkes i somatiske fibroblaster sammen med
OCT4
,
SOX2 Hotell og
KLF4
.
LIN28B
, som en homolog av
LIN28
, ble først klonet fra og vist å være overuttrykt i humane leverkreft celler og kliniske prøver i 2006 [2]. LIN28B er en utviklingsmessig regulert RNA-bindende protein som fremmer tumorgenesen ved å blokkere den etter transkripsjonell bearbeiding av tumorundertrykkende pri- /pre-
la-7
mikroRNA [3], [4]. Evnen til LIN28B å regulere
la-7
, en
bona fide
tumor-suppressor, er i samsvar med sin utviklings rolle i regulering av celleproliferasjon og differensiering. Interessant, flere studier viser at
LIN28B
selv er også et mål for
la-7
familiemedlemmer, inkludert MIR-125b [5]. Foruten
la-7
, LIN28B kan også binde mRNA av tarmstamcellemarkører, slik som
LGR5 Hotell og
PROM1 product: [6]. I sammendraget, fremmer LIN28B transformasjon primært ved å undertrykke
la-7
. Konkurranse mellom LIN28B og
la-7
kan være kritisk for normal cellebiologi og kan akselerere svulst utvikling når denne balansen blir forstyrret.
LIN28B
er hypermethylated i somatiske vev [ ,,,0],7], og dens avvikende reaktivering kan fremme tumorgenesen [8]. LIN28B ofte overuttrykt i mange krefttyper, spesielt avanserte typer såsom progressiv leverkreft [2], [9], ovarialcancer [10], tumor og bakterie celle svulster Wilms [9]. I tillegg til å være målrettet av forutgående microRNAs er LIN28B aktiveres ved flere onkogene veier. C- /N-Myc indusere LIN28B ekspresjon i flere humane og musetumormodeller, noe som resulterer i
la-7
undertrykkelse og celleproliferasjon [11], [12].
MYCN
forsterkning resulterer også i LIN28B overekspresjon [10], og det har blitt rapportert at c-myc er relatert til sporadisk tykktarmskreft og familiær polyposis coli [13], noe som tyder på en rolle for LIN28B i tykktarmskreft.
til tross for store prestasjoner i kirurgi, cellegift og utvikling av nye molekylære målrettede narkotika, for eksempel bevacizumab (Avastin), forekomsten av tykktarmskreft fortsetter å øke [14]. Hvert år, svulster i tykktarmen er ansvarlig for 655 000 dødsfall globalt. Fordi
La-7
fungerer som en potensiell vekst suppressor i menneskelige tykktarmskreftceller [15] undersøkte vi LIN28B uttrykk i tykktarm kreft vev for å bestemme balansen mellom LIN28B og
la-7
uttrykk . Vi undersøkte LIN28B uttrykk i menneskelige tykktarmskreftsvulster via vevet microarray og fant at LIN28B var signifikant oppregulert i svulstvevet i forhold til normal colonic slimhinnene. For ytterligere å analysere overlevelse av pasienter med tykktarmskreft, valgte vi en ekstra kohort av postoperative pasienter med detaljerte patologi poster og oppfølgingsdata fra 2004 til 2009. Som forventet, LIN28B overekspresjon korrelert med redusert pasient overlevelse og økt sannsynlighet for tumorresidiv . Videre fant vi at stanse LIN28B hemmet migrasjon av SW480 celler og sensitivisert SW480 og HCT116 tykktarmskreftceller til oksaliplatin-indusert cytotoksisitet.
Pasienter og metoder
Tumor tissue analyse
prøver av humane tykktarm karsinomer og normale kolon ble oppnådd fra en human colon carcinoma vev array (CO2161; US Biomaks), som inneholdt 204 adenokarsinomer, 4 signet ringcellekreft og 8 normale tykktarmsslimhinne prøver. Detaljert klinisk informasjon, inkludert differensiering status og TNM gradering, ble også gitt for hver prøve. En ekstra kohort av 149 kolon karsinom prøvene ble samlet inn fra prøvene som hadde blitt kirurgisk resected i 2004 fra samtykkende pasienter ved Nanfang Hospital (Southern Medical University, Guangzhou, Kina), ifølge en Institutional Review Board godkjent protokollen. Hver av disse sakene ble fulgt, i detalj, til og med juni 2009. Vi bekreftet TNM klasse for prøver fra begge kohorter. I alt ble 357 tykktarmskreftsvulster og 8 normale kolon prøver brukes til IHC analyse. Den detaljerte informasjonen for alle svulster og pasienter er gitt i tabell 1. studieprotokoll ble godkjent av etisk gjennomgang styret i Nanfang Hospital. Vi har fått skriftlig informert samtykke fra alle deltagerne. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen og relevante retningslinjer i Kina
To patologer scoret LIN28B fargeintensitet i henhold til følgende skala:. En score på 0/1 ble brukt til å betegne svak /lav LIN28B intensitet (0-25% positiv rate); en score på 2 representert mellom intensitet (25-50% positive rate); og en score på 3 ble brukt for høy intensitet farging ( 50% positiv rate). Svulster av grad 1, 2 og 3 er tilsvarende svulster klassifisert som godt differensiert, moderat differensiert eller dårlig differensiert, henholdsvis ved hjelp av mikroskopi.
log rank tester (Mantel-Cox og Breslow) ble utført for å sammenligne overlevelse og tilbakefall fordelinger av de forskjellige intensitetsgrupper (0-2 vs 3). Korrelasjonen mellom fargeintensitet og overlevelse eller tilbakefall ble bestemt ved hjelp av en chi-kvadrat analyse, og et 95% konfidensintervall ble beregnet til å bestemme statistisk signifikans.
Cell kultur
SW480, Caco2 og HCT116 tykktarmskreftcellelinjer ble kjøpt fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) og ble dyrket i Dulbeccos modifikasjon av Eagles medium (DMEM; Gibco, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; HyClone, Sør Logan, UT, USA). Alle cellelinjer ble holdt i en 5% CO
2, fuktig atmosfære.
oligoribonukleotider
A LIN28B spesifikk siRNA og en negativ kontroll liten RNA (NC) ble konstruert ved Genepharma ( Shanghai, Kina). LIN28B- og GAPDH-spesifikke primere ble syntetisert av Takara (Takara Biotechnology, Dalian, Kina).
Cell transfeksjon
RNA oligonukleotider ble transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen), i henhold til produsentens instruksjoner . Mellom 50 og 100 nM av RNA-oligonukleotider ble anvendt for hver transfeksjon.
Semi-kvantitativ revers-transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) og kvantitativ revers-transkripsjon polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol reagens (Invitrogen) og ble deretter behandlet med DNase I (Tiangen Biotech, Beijing, Kina). CDNA for QRT-PCR ble syntetisert med PrimeScript RT reagenssett og gDNA Eraser (Takara). PCR-amplifikasjon fremgangsmåte for GAPDH var som følger: 94 ° C i 3 minutter; 30 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s; og en terminal forlengelse ved 72 ° C i 5 minutter. Amplifikasjon av LIN28B ble utført som følger: 95 ° C i 2 minutter; 30 sykluser av 95 ° C i 30 s, 58 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s; og en avsluttende trinn ved 72 ° C i 5 minutter. QRT-PCR-analyser ble utført ved hjelp av SYBR PrimeScript RT-PCR kit (Takara) for GAPDH og LIN28B.
immunoblotter
cytosolprotein fraksjoner ble utarbeidet etter RIPA buffer (Beyotime Biotechnology, Haimen, Kina). Antistoffene benyttet for immunoblot var spesifikke for LIN28B (01:10, ab71415; Abcam, Cambridge, MA, USA) og GAPDH (G9295; Sigma-Aldrich, USA). Western blot og IHC ble utført i henhold til standardprosedyrer.
Migration analyse
SW480-celler (1 x 10
4 celler i 100 ul serumfritt medium), som var blitt transfektert med NC eller si-LIN28B, ble plassert i øverste kammer av Transwell kultur retter (8 mikrometer, BD Biosciences, San Jose, California). Det nedre kammer ble fylt med 600 ul av kondisjonert medium. Etter 24 timer ble cellene som hadde migrert til den nedre kammer fjernes fra den øvre overflaten av Transwell membran med en bomullspinne. Migrerte celler på den nedre membranoverflate ble fiksert, farget med 0,1% krystallfiolett og avbildes.
Celleviabilitet analyse
SW480 eller HCT116-celler, som var blitt transfektert med enten NC eller samti- LIN28B, ble sådd ut i triplikat i 96-brønners plater ved en konsentrasjon på 1 x 10
4 celler per brønn. Etter at cellene hadde levd opp til platene, ble de inkubert med ulike konsentrasjoner av oksaliplatin (f.eks 100, 10, 1, 0,1, 0,01 og 0,001 mg /ml, Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd, Jiangsu, Kina) for 4 timer og ble deretter overført for å fullføre medium i ytterligere 20 timer. På det angitte tidspunkt ble 10 ul av CCK-8-løsning (Dojindo, Kumamoto, Japan) tilsatt til hver brønn, og cellene ble inkubert i 3 timer ved 37 ° C. Absorbans (A) ble registrert ved 450 nm ved anvendelse av en plateleser. Eksperimentet ble utført i triplikat, og cellen hemming-forholdet ble bestemt ved anvendelse av følgende ligning: (1 – forsøksgruppe A /kontrollgruppe A) x 100%. IC
50 (50% hemmende konsentrasjon) verdi ble beregnet ved hjelp av spesiell programvare (logit-metoden).
Statistisk analyse
En logg rank test ble utført for å sammenligne overlevelse og tilbakefall distribusjoner for de ulike intensitets grupper (0-2 vs 3). Korrelasjonen mellom fargeintensitet og overlevelse eller tilbakefall ble bestemt i henhold til en chi-kvadrat analyse, hvor p-verdier mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. En 95% konfidensintervall ble beregnet for bekreftelse av statistisk signifikans.
Resultater
LIN28B ble oppregulert i kolon karsinom
For å undersøke mulige roller for LIN28B i tykktarmskreft, vi første sammen LIN28B protein uttrykk mellom 208 tumorprøver og 8 ikke-matchet normal slimhinne prøver fra en vev microarray bruker IHC. Den fargeintensitet av LIN28B ble scoret av to patologer som var blindet for den kliniske opplysninger. I samsvar med tidligere rapporter [6], [16], LIN28B ble betydelig overuttrykt i tumorvev i forhold til normalt vev (fig 1, p. 0,001).
IHC viste at LIN28B ble markert oppregulert i tumorvev sammen med den normale slimhinner, noe som viste meget lite LIN28B uttrykk. Representative grafer presenteres.
LIN28B overekspresjon korrelert med redusert pasientoverlevelse og en høy risiko for tilbakefall
Data fra pasienter som gjennomgikk kirurgi (TNM I-III, parafin-embedded kirurgisk reseksjon vev) ble videre analysert via log rank tester for å undersøke påvirkning av LIN28B overekspresjon på pasientens overlevelse og gjentakelse. Denne analysen viste en sammenheng mellom lav-intensitet LIN28B flekker fra prøver av TNM klasse I og II svulster og økt pasientoverlevelse (Mantel-Cox p 0,01; Breslow, p 0,01) og en lavere sannsynlighet for tumorresidiv (Mantel-Cox p 0,01; Breslow p .. 0,01) (figur 2)
(A) Høyere LIN28B fargeintensitet fra stadium I, II og III tykktarm kreft korrelerte med redusert pasientens overlevelse. (B) Høy LIN28B uttrykk var knyttet til en høyere sannsynlighet for svulst tilbakefall (p 0,01; log rank test).
Til sammen våre resultater viser at LIN28B uttrykk er nært knyttet til pasientene, overlevelse og tilbakefall av kreft i tykktarmen.
LIN28B tap-av-funksjon sensibilisert SW480 og HCT116 cellene til oksaliplatin-mediert cytotoksisitet
la-7
tumor suppressor mikroRNA familiemedlemmer er kjent for å regulere kjemosensitivitet [17], mens LIN28B fremmer kreft hovedsakelig ved å hemme
la-7
biogenesis. Derfor søkte vi å finne ut om LIN28B kan påvirke kjemosensitivitet til oksaliplatin. Vi undersøkte LIN28B uttrykk i tre kolon kreft cellelinjer ved hjelp av RT-PCR og Western blotting (fig. 3A). HCT116 og SW480-celler ble valgt for anvendelse i disse eksperimentene på grunn av deres lave og høye Lin28 uttrykk, respektivt. Oksaliplatin induserte konsentrasjonsavhengig cytotoksisitet i disse cellene (fig. 3B). IC
50 verdi for oksaliplatin var 6,23 ± 0,75 pg /ml for HCT116-celler, og dette ble økt med 30% til 10,7 ± 2,26 pg /ml hos SW480 celler. Dette funnet antydet at forskjeller i LIN28B uttrykk kan tjene til å modulere kjemosensitivitet i tykktarm kreft celler. For å bekrefte denne hypotesen, bygget vi LIN28B spesifikke siRNA og kontrollere små RNA. Effektiviteten av sil-LIN28B ble bestemt i begge cellelinjer (Fig. 4A-D), og deretter ble utført en CCK-8-analyse for å utforske interaksjonen mellom Si-LIN28B og oksaliplatin i HCT116 og SW480-celler. Resultatene indikerte en synergistisk virkning mellom Si-LIN28B og oxaliplatin (fig. 3C-D), noe som antyder at målrettingen av LIN28B kan være i stand til å sensibiliserende tykktarmskreftceller til å oksaliplatin terapi.
(A) RT- PCR og Western blot analyser evaluert LIN28B uttrykk nivåer i Caco2, SW480 og HCT116-celler. (B) SW480 og HCT116-celler ble sådd ut i 96-brønners plater og inkubert med de angitte konsentrasjoner av oksaliplatin. Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp av en CCK-8 analysesett etter 72 timer med eksponering for stoffet eller fortynningsmiddel kontroll. IC
50 verdiene ble beregnet etter kurvetilpasning ved hjelp av XLfit programvare. (C-D) HCT116 og SW480 celler ble transfektert med NC eller si-LIN28B 24 timer før oksaliplatin (IC
50 verdi) behandling. Inhiberingsgraden, normalisert til NC, ble beregnet ved bruk av CCK-8 absorbans ved de indikerte tidspunkter. Dataene er vist som gjennomsnitt ganger endring ± SE (n = 3; t-test).
(A-B) RT-PCR og Western blot-analyser bekreftet effektiviteten av sh-LIN28B knockdown i HCT116 og SW480 celler. (C-D) A QRT-PCR-analyse bekreftet også nedregulering av LIN28B mRNA i disse cellene. Dataene er representert som gjennomsnitt ± SE. (N = 3; Student
t
-test)
nedregulering av LIN28B trykt migrasjon av SW480 celler
som LIN28B overekspresjon var korrelert med tumor tilbakefall og pasientens overlevelse, ved siden søkte vi å undersøke om LIN28B uttrykk påvirker migrasjon av tykktarmskreftceller. Vi banket ned LIN28B ekspresjon ved hjelp av siRNA, og den Transwell analyse indikerte at undertrykkelse av LIN28B inhiberte signifikant migrering av SW480-celler (Fig. 5).
Cellene ble transfektert med 50 nM NC eller Si-LIN28B og var tillates å migrere gjennom en Transwell kammer. Representative grafer presenteres.
Diskusjoner
Flere stemness relaterte gener, som er referert til som oncofoetal gener, er tenkt å fremme tumorgenesen ved re-uttrykk i somatiske celler. Tilstedeværelsen av CD133
+ kreft stamceller eller kreftfrem initiere celler kan forklare metastase, gjentakelse og cellegift-motstand for tykktarmskreft [18], [19].
La-7
er involvert i regulering av selvfornyelse og tumourigenicity av brystkreft-initiere celler [20] og er også undertrykt i tykktarm kreft celler [15]. LIN28B overekspresjon er kjent for å bidra til kreftutvikling ved å blokkere biogenesis av
la-7
, som blir bedt oss om å vurdere om balansen mellom tumor-fremme LIN28B og tumor-undertrykkende
la-7
var endret på tykktarmskreft [21]. Vi fant at LIN28B uttrykk ble oppregulert i tykktarm tumorvev, og dette uttrykket korrelert med redusert pasientoverlevelse, og en høyere sannsynlighet for gjentakelse. I tillegg ved å stanse all LIN28B sensitivisert tykktarmskreftceller til cytotoksisitet indusert av oksaliplatin og hemmet deres migrasjon
in vitro
.
Lin28
er uttrykt i ulike stamcellepopulasjoner, selv om sitt uttrykk i terminalt differensiert somatiske vev er knappe. Nylig, når det uttrykkes i kombinasjon med
OCT4
,
Nanog Hotell og
SOX2, Lin28
ble vist å fungere som en erstatning for
c-myc anbefale til omprogrammere menneskelige somatiske fibroblaster til pluripotency [22]. Som en homolog av Lin28,
LIN28B
har først og fremst blitt klonet fra levercellekarsinom, og dens overekspresjon har vist seg å fremme kreftcelle spredning [2]. Aktiveringen av LIN28B resultater i redusert undertrykkelse av
la-7
mål, for eksempel
HMGA2
,
Dicer1 product: [10],
KRAS product: [23 ] og
c-myc
, og aktivering av tilsvarende onkogene signalveier. Interessant,
LIN28B Hotell og dens oppstrøms regulator
c-myc product: [12] er også mål for
la-7
; følgelig en
c-myc-LIN28B-la-7
aksen, eller feedback loop, som kan tjene til å undertrykke tumorvekst, kan eksistere. Således kan tap av kontroll over denne aksen akselerere tumorveksten
Som nevnt tidligere,
LIN28B
reguleres ved flere faktorer onkogene.; medlemmer av
MYC
familie, inkludert
C-Myc
,
N-myc Hotell og
MYCN
kan aktivere LIN28B, noe som tyder på at
LIN28B
er et viktig mål for
MYC Hotell og kan forklare hvorfor
LIN28B
kan erstatte
c-myc
for omprogrammering av somatiske celler i pluripotency.
c-myc
transkripsjonsfaktor kan aktiveres av
Wnt /APC
sti, som er deregulert i tykktarm kreft [24].
APC
genet endringer, hvis ikke arvelig, representerer de tidligste molekylære forandringer under utvikling av tykktarmskreft, mens strukturelle endringer av
myc, ras, p53
,
MCC
og
DCC
gener anses å representere slutten hendelser [25]. Oppsummert våre funn viser at det foreligger en foreløpig
Wnt /APC Anmeldelser –
Myc Anmeldelser –
LIN28B Anmeldelser –
la-7
veien i kolon kreft . Vi hypoteser som
Wnt /APC Anmeldelser –
Myc
pathway aktivering er den innledende hendelsen og at
LIN28B-la-7-c-Myc /LIN28B
feedback loop akselererer kolon kreftutvikling. Men videre studier er nødvendig for å bekrefte hvilken rolle denne feedback loop i kreftutvikling.
metastaser og tilbakefall er de viktigste årsakene til nedgangen i total overlevelse hos pasienter med maligne svulster. Det er således av stor interesse å være i stand til å forutsi tumormetastaser og tilbakefall på et tidlig stadium. Videre spår tumorresidiv for stadium II /III pasienter kan veilede adjuvant kjemoterapi. Forbedrede metoder for å identifisere scenen II pasienter med høy risiko for tilbakefall [26], som er basert på de unike egenskapene til hver enkelt svulst, kan resultere i tusenvis av sparte liv hvert år. I tillegg er teknikker for å identifisere stadium III pasienter som er i en lav risiko for tilbakefall av sykdommen etter kirurgi kan spare disse individene fra kostnadene, tid og toksisitet forbundet med kjemoterapi [27]. I vår studie, LIN28B fargeintensitet ( 50%) korrelert med redusert pasientens overlevelse. Viktigere, kan LIN28B uttrykk forutsi tilbakefall av TNM klasse II /III svulster etter kirurgisk reseksjon.
Selv om dette manuskriptet var under forberedelse, en studie fra King et al. rapportert at LIN28B fremmer tykktarmskreft progresjon og metastase både
in vivo product: [16] og
in vitro
gjennom
la-7
-avhengig og-Uavhengig mekanismer [6]. Våre data er i samsvar med disse funnene, og vi foreslår også at påvise uttrykk for LIN28B kan bidra til å fastsette riktig ordningen med adjuvant kjemoterapi hos pasienter med TNM klasse II og III tykktarmskreft.
I konklusjonen, våre data foreslå en viktig rolle for
LIN28B
i kolon kreftutvikling. LIN28B uttrykk ble vist å forutsi pasientens overlevelse, noe som innebærer at
LIN28B
kan være et nyttig mål for nye molekylære therapeutics.
