Abstract
Bakgrunn
hudkreft er den mest vanlige cancer over hele verden. Epitel-mesenchymale overgang (EMT) og oppkjøpet av kreft stamceller (cscs) -lignende egenskaper fremstå som viktige skritt i metastasering av menneskelig hud kreft. Koffeinsyre (CAA) utøver anticarcinogenic effekter. Imidlertid er effekten av Luftfartstilsynet på den vandrende evne og på de cscs-lignende egenskaper av hud kreftceller, og de molekylære mekanismene bak den ikke fullt ut forstått.
Metoder
Ondartede HaCaT cellene behandlet av Luftfartstilsynet. Transwell Analysen ble utført for å bestemme at Luftfartstilsynet dempes den vandrende evne, Spheroid formasjon Analysen ble utført for å bekrefte at Luftfartstilsynet redusert cscs-lignende fenotype; Behandlet maligne HaCaT celler ble molekylært preget av RT-PCR, Western blot, sørvestre blot, og immunoprecipitation.
Resultater
I Luftfartstilsynet behandlet ondartet menneskelig keratinocyte (ondartet HaCaT celler), hemming av vandrende evne og cscs-lignende fenotype ble observert. CAA oppregulert fosforylering av p38, og nedregulert aktivering av nukleær faktor KB (NF-kB) /snegl signalvei. Faktisk, redusert p38 DNA-bindende aktivitet av NF-kB til promoteren til
snegle
-genet, noe som resulterte i den transkripsjonelle inaktivering av
snegle
. Blokkering av p38 svekket Luftfartstilsynet indusert hemming av trekkfugl evne og cscs-lignende fenotype i maligne HaCaT celler.
Konklusjoner
CAA demper de vandrende evne og cscs-lignende egenskaper av ondartet menneskelig keratinocyte, hvori, p38-mediert nedregulering av NF-kB /snegl signalveien er involvert
relasjon:. Yang Y, Li Y, Wang K, Wang Y, W Yin Li L (2013) p38 /NF-kB /Snail Pathway er involvert i caffeic syre-indusert hemming av kreftstamceller-lignende egenskaper og trekkende kapasitet i Ondartet Menneskelig keratinocyte. PLoS ONE 8 (3): e58915. doi: 10,1371 /journal.pone.0058915
Redaktør: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Forente Stater
mottatt: 04.10.2012; Godkjent: 08.02.2013; Publisert: 13 mars 2013
Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundations of China (81072338) og et prosjekt finansiert av Priority Academic Program Utvikling av Jiangsu høgskolerådet (2010). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hudkreft er den mest vanlige cancer over hele verden [1], [2]. For de siste to tiårene, er dødeligheten av hudkreft stabil, delvis på grunn av metastatisk sykdom [3]. Behandlingstilbud for metastatisk hudkreft fortsette å utvikle seg på flere grenser. Dacarbazine, for tiden den eneste amerikanske Food and Drug Administration (FDA) godkjente kjemoterapi for behandling av metastatisk sykdom, har hittil resultert i liten eller ingen effekt på overlevelse, selv når vurdert i kombinasjon med therapeutics med ulike virkningsmekanismer [4]. Nye kjemoterapeutiske midler for behandling av pasienter med disseminert ondartet hudkreft er sterkt behov.
Naturlig forekommende hydroxycinnamic syre derivater rapporteres å ha kreft, anti-inflammatorisk og antioksidantegenskaper [5], [6]. Deres naturlige opprinnelse og allestedsnærværende forekomsten har bedt sterk interesse for bruk av dem som cytostatika. Koffeinsyre (3, 4-dihydroxycinnamic syre, CAA) er den største kost hydroxycinnamic syre. Nyere studier tyder på at Luftfartstilsynet utøver kreft effekter [7]; CAA utøver beskyttende virkning mot UVB-indusert hud-skader ved å undertrykke aktivering av interleukin-10 og mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK) i hud mus [8]; Videre hemmer CAA aktiviteten av Fyn kinase (en viktig mediator som kreves for UVB-indusert hudkreft), som kan være involvert i undertrykkelse av huden karsinogenese [9]. Men effekten av Luftfartstilsynet på metastatisk evnen til hudkreft, og de molekylære mekanismene bak i, er ikke fullt ut forstått.
epitel-mesenchymale overgang (EMT) er en utviklingsprosess der epitelceller omdannes til mesenchymale celler under embryogenese, vev-omforming, og sårheling [10]. Under en slik prosess, epitelceller erverve mesenchymale celleegenskaper, og viser den reduserte intercellulær adhesjon og økt invasjon [11]. Aktiveringen av EMT programmet har vært innblandet som et viktig skritt i metastasering av mange humane tumorer, inkludert huden [10], [12].
Et konsept nylig foreslått å forklare hva som kjennetegner neoplastiske vev er eksistensen av selvfornyende, stilk-lignende celler i svulster, som har blitt kalt «kreft stamceller (cscs) «[13]. Cscs har blitt identifisert i mange humane kreftformer, inkludert hud, bryst, lever, lunge, og så videre [1], [12], [14], [15]. I løpet av en tumor, cscs, som utgjør en liten del av neoplastiske celler, er definert ved deres evne til å produsere nye tumorer. Av denne grunn, har de også blitt kalt «tumorceller å initiere» [13]. Et forhold mellom EMT og cscs har blitt observert, at i løpet av EMT prosessen, epitelceller skaffe stamcellelignende egenskaper og som cscs utstillings en mesenchymale-lignende utseende [16]. Denne koblingen mellom EMT prosessen og induksjon av cscs kan forklare hvorfor EMT programmet induserer startfasen og progresjon.
Her fant vi at Luftfartstilsynet dempes de vandrende evne og cscs-lignende eiendommer i ondartet menneskelig keratinocyte (ondartet HaCaT-celler). CAA forbedret fosforylering av p38, som blokkerte aktiveringen av nukleær faktor kB (NF-kB) /snail signalveien. Hemming av p38 avskaffet CAA-indusert hemming av trekkfugl evne og cscs-lignende fenotype i maligne HaCaT celler.
Resultater
CAA demper den vandrende kapasitet av ondartede HaCaT celler
for å fastslå effekten av CAA på trekk potensialet av ondartede HaCaT celler ble transwell analyse utført. Som vist i figur 1, ondartede HaCaT celler vises høy trekkevne; i motsetning til dette CAA dempes den vandrende kapasitet av ondartet HaCaT-celler i et ikke-avhengig måte. Siden 100,0 mikrometer av CAA redusert vandrende evnen til ondartede HaCaT celler effektivt, og siden det hadde ingen påviselig cytotoksisitet (figur S1), valgte vi denne konsentrasjonen for videre etterforskning.
Ondartede HaCaT celler ble behandlet med 0,0, 50,0 eller 100,0 uM CAA i 48 timer, henholdsvis. (A) Transwell assay analyser av den trekkende kapasitet av maligne HaCaT-celler, bar = 125 um; (B) Kvantifisering av Transwell cellemigrering assay. Migrerte celler ble farget med krystallfiolett. Resultatene ble uttrykt som migrerte celle tall per synsfelt (gjennomsnitt ± SD, n = 5). **
p
0,01 sammenlignet med 0,0 mikrometer fra Luftfartstilsynet behandlet ondartet HaCaT celler gruppe.
CAA induserer mesenchymale-epitel overgang (MET) i maligne HaCaT celler
For de ondartede HaCaT celler, endring fra epitelial til spindellignende mesenchymale morfologi er en manifestasjon [17]. Siden EMT gjør det mulig for cellen å bevege seg og invadere [18], vi deretter bestemt virkningene av CAA på EMT prosessen i maligne HaCaT-celler. Som vist i figur 2A, maligne HaCaT-celler viste en fibroblast-lignende mesenchymale utseende; imidlertid, etter at disse cellene ble utsatt for CAA i 48 timer, viste de en epitel-lignende morfologi. Inhibering av celleklebeevne er forbundet med EMT initiering [18]. Her, adhesjon analyser viste at CAA forbedret klebe evnen av maligne HaCaT-celler (figur 2B). Da effekten av CAA på uttrykk for EMT /lim markører: E-cadherin, N-cadherin og vimentin, ble bestemt. Etter maligne HaCaT-celler ble behandlet ved CAA i 48 timer, ble E-cadherin nivå økes, i motsetning, ble N-cadherin og vimentin nivåer redusert (figur 2C). Derfor, både morfologiske og molekylære forandringer viser at, med eksponering for CAA, maligne HaCaT-celler gjennomgår en MET.
Ondartede HaCaT-celler ble behandlet med 0,0 eller 100,0 uM CAA i 48 timer, henholdsvis. (A) Morfologiske bilder av ondartede HaCaT celler (barer: heltrukken linje = 500 mikrometer og stiplede linjer = 125 nm); (B) Kvantifisering av vedheft analyse som beskrevet i avsnittet
Materialer og metoder
. Vi brukte klebe prosenter av ubehandlede maligne HaCaT-celler for å bestemme 100% nivå; (C) Western blot analyser av E-cadherin, N-cadherin, og vimentin nivåer. Blottene ble normalisert ved anvendelse av GAPDH for å korrigere for forskjeller i lasting av proteinene. **
p
0,01 sammenlignet med 0,0 mikrometer fra Luftfartstilsynet behandlet ondartet HaCaT celler gruppe.
CAA reduserer cscs-lignende egenskaper av maligne HaCaT celler
Induksjon av EMT har vært forbundet med oppkjøpet av stamcelleliknende egenskaper, blant annet uttrykk for slike stamceller-overflatemarkører, ikke-klebende vekst og endringer i uttrykket av celle-overflate glykoproteiner [16]. CD34 og K5 er celleoverflatemarkører hud stamceller [19], [20]. I vår nåværende studie, maligne HaCaT celler viste forhøyet uttrykk for
CD34 Hotell og
K5
mRNA; imidlertid, etter behandling av ondartede HaCaT-celler med CAA i 48 timer, ble en redusert ekspresjon av slike mRNA observert (figur 3A). Dannelsen av sfæroider demonstrerer kapasiteten av celler for selvfornyelse og for initiering av tumorer, som er karakteristikker av kreft stamceller (cscs) [21]. Deretter bestemmes effekten av CAA på dannelsen av kuler i maligne HaCaT-celler. I tilfestede retter, ondartede HaCaT celler dannet frittflytende, levedyktige sfærer; imidlertid, etter behandling av maligne HaCaT-celler med CAA i 48 timer, slik fenomen var forsvunnet (figur 3B og 3C). Disse data viser at CAA reduserer cscs-lignende egenskaper hos maligne HaCaT-celler.
Ondartede HaCaT-celler ble behandlet med 0,0 eller 100,0 uM CAA i 48 timer, henholdsvis. (A) RT-PCR analyser av
K5 Hotell og
CD34
mRNA nivåer. Bånd ble normalisert ved anvendelse av GAPDH for å korrigere for forskjeller i belastning av cDNA; (B) Gratis flytende, levedyktige kuler dannet av ondartede HaCaT celler (bar = 125 nm); (C) Sphere kvantifisering (gjennomsnitt ± SD, n = 3). **
p
0,01 sammenlignet med 0,0 mikrometer fra Luftfartstilsynet behandlet ondartet HaCaT celler gruppe.
CAA hemmer aktiveringen av NF-kB /sneglen signalveien ved p38
snegle, en sink finger Transkripsjonsfaktor , fungerer som en regulator for å undertrykke ekspresjon av adhesjonsmolekyler og for å hjelpe til rømning av tumorceller fra celledød under EMT [22]. NF-kB, en nøkkel megler involvert i ondartet transformasjon av HaCaT celler [17], up-regulerer sneglen uttrykk og induserer EMT [23], [24]. Vi antok at NF-kB /snegl signalveien kan være involvert i CAA-indusert hemming av cscs-lignende egenskaper og trekkende kapasitet i maligne HaCaT celler. Her, som vist i figur 4A, redusert CAA ekspresjonen av fosfo-rela (som viser aktiveringen av NF-kB) og snegl, som foreslo at CAA blokkert aktivering av NF-kB /snegl signalveien.
(A) Ondartede HaCaT-celler ble behandlet med 0,0 eller 100,0 uM CAA i 24 timer, henholdsvis. Western blot analyser av sneglen, p-p38 og p-rela nivåer. Blottene ble normalisert ved anvendelse av GAPDH for å korrigere for forskjeller i lasting av proteinene; (B) Når maligne HaCaT-celler ble forbehandlet ved 10,0 pM av SB203580 (et p38-inhibitor) i 6 timer, ble de utsatt for 0,0 eller 100,0 uM CAA i 24 timer, henholdsvis. (B, topp) celler lysater ble underkastet immunoutfelling med NF-kB /Rela-antistoff, og immunopresipitatene ble utsatt for Southwestern blot for å bestemme bindingen av NF-kB til DNA-sekvensene
snegle
promoter (5 « –
TAA Anmeldelser –
ggg-agt-TGG-CGG
-3 «); (B, nederst) immunopresipitatene ble underkastet Western blot for å bestemme forhold nivå, som ble brukt til å korrigere for forskjeller i belastning av immunoutfellinger; (C) maligne HaCaT-celler ble behandlet som beskrevet i (B), RT-PCR (øverst) og Western blot (nederst) analyser av snegle-mRNA og proteinnivåer. Blotter /band ble normalisert ved bruk av GAPDH å korrigere for forskjeller i lasting av proteiner /cDNA.
For å kunne fastslå den opp-stream regulator av NF-kB /snegl i Luftfartstilsynet behandlet ondartede HaCaT celler undersøkte vi aktivering av p38 (en inhibitor av NF-kB og EMT [25]). Som vist i figur 4A, CAA forbedret fosforylering av p38 (som indikerer aktivering av p38). Basert på disse dataene, vi en hypotese om at i maligne HaCaT celler, CAA blokkert NF-kB /sneglen signalveien ved p38.
Vi brukte immunoprecipitation og sørvestre blot analyse for å bekrefte vår hypotese. SB203580 er en spesifikk hemmer av p38, og vi brukte 10,0 mikrometer av SB203580 å blokkere CAA-indusert aktivering av p38 (figur S2). Etter maligne HaCaT-celler ble forbehandlet med 10,0 uM av SB203580 i 6 timer, ble de utsatt for 0,0 eller 100,0 uM CAA i 24 timer, henholdsvis. Rela ble immunopresipitert med sitt spesifikke antistoff, og immunopresipitatene ble deretter utsatt for Southwestern blot ved å bruke biotin-merket probe «
gggagttggc
« (figur S3) for å bestemme bindingen av NF-kB til DNA-sekvensene
snegle
promotor. Som vist i figur 4B, redusert CAA bindingen av NF-kB til
snegle
promotor i maligne HaCaT-celler; imidlertid, inhibering av p38 avskaffet denne effekten. Videre blokkering av p38 svekket Luftfartstilsynet mediert redusert uttrykk av sneglen mRNA og proteinnivå (Figur 4C). Disse resultater antyder at, i maligne HaCaT-celler eksponert for CAA, p38 redusere den DNA-bindende aktivitet av NF-kB til
snegle
promotor, noe som resulterer i den transkripsjonelle nedregulering av sneglen.
p38 er involvert i CAA-indusert MET av ondartede HaCaT celler
Vi deretter bestemmes funksjonene til p38 i CAA-mediert MET i maligne HaCaT celler. Etter maligne HaCaT-celler ble forbehandlet med 10,0 uM av SB203580 i 6 timer, ble de utsatt for 0,0 eller 100,0 uM CAA i 48 timer, henholdsvis. Som vist i figur 5. I Luftfartstilsynet behandlet ondartede HaCaT celler, ble E-cadherin nivå økt, men N-cadherin og vimentin nivåer ble redusert (figur 5A); mobilnettet limet evne ble forbedret (figur 5B); og celler kjøpt en epitelial-lignende morfologi (figur 5C). Imidlertid inhibering av p38 avskaffet fenomenet ovenfor indusert ved CAA (figur 5A, 5B og 5C). Disse resultatene tyder på at p38 er involvert i LT-indusert MET av maligne HaCaT-celler.
Etter maligne HaCaT-celler ble forbehandlet ved SB203580 (et p38-inhibitor) i 6 timer, ble de utsatt for 0,0 eller 100,0 uM av CAA i 48 timer, henholdsvis. (A) Western blot analyser av E-cadherin, N-cadherin, og vimentin nivåer. Blottene ble normalisert ved anvendelse av GAPDH for å korrigere for forskjeller i lasting av proteinene; (B) Kvantifisering av vedheft analyse som beskrevet i avsnittet
Materialer og metoder
. Vi brukte klebe prosenter av ubehandlede maligne HaCaT-celler for å bestemme 100% nivå; (C) Morfologiske bilder av ondartede HaCaT celler (barer: heltrukken linje = 500 mikrometer og stiplede linjer = 125 nm). **
p
0,01 sammenlignet med (CAA + SB203580) -behandlet ondartet HaCaT celler gruppe.
P38 er involvert i CAA-indusert hemming av cscs-lignende egenskaper i ondartede HaCaT celler
Videre vi bestemmes effektene av p38 på CAA-indusert hemming av cscs-lignende egenskaper i ondartede HaCaT celler. Celler ble behandlet som beskrevet ovenfor. Som vist i figur 6, CAA svekket ekspresjon av
CD34
og
K5
mRNA (figur 6A), og redusert dannelse av sfæroider (figur 6B og 6C). Imidlertid inhibering av p38 avskaffet fenomenet ovenfor indusert ved CAA (figur 6A, 6B og 6C). Disse resultatene indikerer at p38 er involvert i LT-indusert hemming av cscs-lignende egenskaper i maligne HaCaT-celler.
Etter maligne HaCaT-celler ble forbehandlet ved SB203580 i 6 timer, ble de utsatt for 0,0 eller 100,0 uM av CAA i 48 timer, henholdsvis. (A) RT-PCR analyser av
K5 Hotell og
CD34
mRNA nivåer. Bånd ble normalisert ved anvendelse av GAPDH for å korrigere for forskjeller i belastning av cDNA; (B) Gratis flytende, levedyktige kuler dannet av ondartede HaCaT celler (bar = 125 nm); (C) Sphere kvantifisering (gjennomsnitt ± SD, n = 3). **
p
0,01 sammenlignet med (CAA + SB203580) -behandlet ondartet HaCaT celler gruppe.
CAA demper den vandrende kapasitet av ondartede HaCaT celler ved p38
Til slutt, bestemte vi om CAA redusert den vandrende kapasitet av ondartede HaCaT celler via p38. Maligne HaCaT-celler ble utsatt for CAA (0,0 eller 100,0 uM) i nærvær eller fravær av SB203580 som beskrevet i figur 6, og den vandrende potensialet av maligne HaCaT-celler ble bestemt ved transwell assay. Som vist i figur 7, CAA dempes den vandrende kapasitet av ondartet HaCaT-celler; imidlertid, inhibering av p38 avskaffet dette fenomen. Disse data tyder på at p38 er involvert i CAA-indusert hemming av trekkende kapasitet i maligne HaCaT celler.
Etter maligne HaCaT celler ble forbehandlet ved SB203580 i 6 timer, ble de utsatt for 0.0 eller 100,0 mikrometer av CAA for 48 h, respektivt. (A) Transwell assay analyser av den trekkende kapasitet av maligne HaCaT-celler, bar = 125 um; (B) Kvantifisering av Transwell cellemigrering assay. Migrerte celler ble farget med krystallfiolett. Resultatene ble uttrykt som migrerte celle tall per synsfelt (gjennomsnitt ± SD, n = 5). **
p
0,01 sammenlignet med (CAA + SB203580) -behandlet ondartet HaCaT celler gruppe.
Diskusjoner
CAA er en av de viktigste metabolittene produsert av hydrolysering av klorogensyre, en stor fenoliske phytochemical i ulike matvarer, inkludert kaffe [8]. Fordi en stor mengde av klorogensyre absorberes i metabolisert form, har betydelig oppmerksomhet blitt rettet mot de biologiske virkningene av metabolitter som CAA for å vurdere mulige
in vivo
effekter av klorogensyre-inneholdende dietter [9 ]. Akkumulerende bevis tyder på at CAA har potensiale til å hemme utvikling av hudkreft, for eksempel, inhiberer CAA hud tumorvekst indusert av 12-O-tetradekanoylforbol-13-acetat i musehud [26]. Men effekten av CAA på trekkevne av ondartede hudceller, og de molekylære mekanismene bak i, er fortsatt uklart. Her har vi funnet at CAA dempet trekkevne og cscs-lignende egenskaper til malign human keratinocytt, hvori, p38-mediert nedregulering av NF-kB /snegl signalveien var involvert.
EMT refererer til et program under normal embryoutvikling med et tap av epitel-egenskaper, slik som celle-adhesjon og ekspresjon av det epiteliale markør, E-cadherin, og anskaffelse av mesenkymale egenskaper, slik som økt celle motilitet og ekspresjon av mesenchymale markør, N-cadherin og vimentin [ ,,,0],10]. EMT er sett på som et viktig skritt i tumorinvasjon og metastase [27]. Her har vi funnet at, etter eksponering av maligne HaCaT-celler CAA i 48 timer, viste de en epitel-lignende morfologi, og en forbedret klebeevne. Videre ble det økt uttrykk av E-cadherin (en epitelial markør), og redusert uttrykk for N-cadherin og vimentin (mesenchymale markører). Disse resultatene viser at, med eksponering for CAA, ondartede HaCaT celler gjennomgå en MET.
Kjøp av cscs-lignende egenskaper fremstå som et avgjørende skritt i kreft progresjon [28] den. Mange gener er uttrykt i huden cscs, inkludert
CD34
,
K5
, og så videre [19], [20]. I huden,
CD34
er spesielt uttrykt i keratinocytt SC’er, og
CD34
uttrykk er nøkkelen til hud kreftutvikling [19];
K5
er en markør for udifferensierte hud SpA SV cscs [20]. I vår nåværende studie, uttrykk for
CD34 Hotell og
K5
mRNA ble betydelig redusert i Luftfartstilsynet behandlet ondartede HaCaT celler. SC’er og cscs dele en rekke egenskaper, inkludert selfrenewal, selv om det er vanligvis dysregulerte i onkogenese. Mange kultur SC eller CSC linjer danne frittflytende sfærisk klynger av levedyktige celler inneholder en overvekt av SCS eller cscs [21], [29]. I denne studien, Luftfartstilsynet behandlet ondartede HaCaT celler utstilt svekket evne til å danne kuler. Disse resultatene indikerer at ondartede HaCaT-celler tapt cscs-lignende egenskaper etter eksponering CAA.
snegl, en sink finger transkripsjonen faktor, fungerer som en regulator for å undertrykke ekspresjon av adhesjonsmolekyler og for å hjelpe til rømming av tumorceller fra celledød i løpet av EMT [22], [30]. Snegl ofte uttrykkes i mange typer av tumorceller hvor E-cadherin uttrykk er redusert. Dessuten, denne inverse forholdet mellom snegl og E-cadherin ble ofte observert i invasive typer svulster [31]. Senere studier bekreftet en undertrykkende effekt av snegl på
E-cadherin
arrangøren via en spesifikk binding til de tre E-bokser
(cacctg)
i promotorområdet på -178 til 92 av
E-cadherin
genet [31]. Videre sneglen også har vært knyttet til oppkjøpet av CSC-lignende egenskaper [22]. Her i Luftfartstilsynet behandlet ondartede HaCaT celler, ble det observert en redusert uttrykk av sneglen.
For å kunne fastslå den opp-stream regulator av snegl i Luftfartstilsynet behandlet ondartede HaCaT celler, undersøkte vi aktivering av NF-kB. NF-kB er antatt å initiere og akselerere tumorgenese, og dens hemming blokkerer celletransformasjon indusert av tumorpromotorer [16], [23]; NF-kB induserer morfologiske endringer, cellemigrasjon, sneglen aktivering og undertrykkelse av E-cadherin produksjon [24], [32]. NF-kB binder til
snegle
promoter og transkripsjons oppregulerer sneglen uttrykk [23]. Her, i CAA-behandlede maligne HaCaT-celler ble det observert en redusert ekspresjon av p-rela. Videre CAA nedregulert den DNA-bindende aktivitet av NF-kB til
snegle
promotor, noe som resulterte i den transkripsjonelle inhibering av snegle. Disse resultatene indikerer at CAA induserer en inaktivering av NF-kB /snegl signalveien.
MAPK banene transdusere signaler som fører til forskjellige cellulære responser så som cellevekst, differensiering, proliferasjon, apoptose, og stressresponser til miljø stimuli [33]. Den ekstracellulære signalregulert kinase 1/2 (ERK1 /2) pathway transduces typisk vekstfaktor signaler som fører til celledifferensiering eller spredning, mens cytokiner og stress signaler aktivere c-Jun N-terminale kinaser (JNKs) og p38 MAPK trasé, noe som resulterer i stressresponser, vekst arrest eller apoptose [34]. Foruten å være en sentral formidler av inflammatoriske og stressrespons, spiller p38 en viktig rolle i ikke-inflammatoriske prosesser så som cellesyklusregulering og celledifferensiering [35]. Når den er aktivert, fosforylerer p38 et bredt utvalg av substrater i cytoplasma og i kjernen, og dermed regulerer genekspresjon, cellesyklus og cellulær polarisasjon. Studier i rollene som MAPK familier i tilblivelsen av EMT har produsert motstridende resultater, på grunn av heterogenitet av mobiltelefonmodeller og ulike eksperimentelle tilnærminger brukes [25], [36]. Forrige undersøkelse viser at p38 fremmer E-cadherin uttrykk ved å undertrykke TGF-β-aktivert kinase 1 (TAK1) -NF-kB signale [25]. Her, i CAA-behandlede maligne HaCaT-celler, avtar p38 DNA-bindende aktivitet av NF-kB til
snegle
promotor, noe som resulterer i den transkripsjonelle nedregulering av snegle. Den p38 /NF-kB /Snail veien er involvert i CAA-indusert hemming av cscs-lignende egenskaper og trekkende kapasitet i ondartet menneskelig keratinocyte (Figur 8).
I ondartede HaCaT celler eksponert for CAA, minsker p38 den DNA-bindende aktivitet av NF-kB til
snegle
promotor, noe som resulterer i den transkripsjonelle nedregulering av snegle. Slike molekylære prosessen fører hemming av cscs-lignende egenskaper og vandringskapasitet på ondartede HaCaT celler.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
ondartet forvandlet HaCaT-celler ble tidligere er utviklet av vårt laboratorium [17]. Celler ble opprettholdt i 5% CO
2 ved 37 ° C i RPMI-1640-medium (Life Technologies /Gibco, Grand Island, NY) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Life Technologies /Gibco), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Life Technologies /Gibco, Gaithersburg, MD). Den p38 inhibitor, SB203580 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Alle andre reagenser som ble brukt var av analytisk kvalitet eller den høyeste grad kjent.
Transwell assay
Transwell-analysen ble utført ved bruk av vekstfaktor-redusert matrigel belagt (8 um porestørrelse, BD, Franklin Lakes, NJ) filtre i 24-brønners plater. I korthet ble cellene trypsinert og sådd ut på det øvre kammer av transwells (3 x 10
4 celler /brønn) i bilag-free 1640 medium. De nedre kamrene i transwells var fylt med 1640 medium inneholdende 100 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF, R immunkompleksene ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens (Cell Signaling Technology). Antistoffer som ble brukt var E-cadherin, N-cadherin, vimentin, sneglen, p38, p-p38 (Thr180 /Tyr182), Rela, p-RELA (Ser536, Cell Signaling Technology); Glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH, Sigma, St. Louis, MO). Blottene ble normalisert ved anvendelse av GAPDH for å korrigere for forskjeller i lasting av proteinene.
Revers-transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
Totalt RNA (2 pg) ble transkribert til cDNA bruker AMV revers transkriptase (Promega, Madison, WI, USA). Primere for
CD34 plakater (forover, 5′-TTGGGCATCACTGGCTATTT-3 «; omvendt, 5′-GGAAGGGTTGGGCGTAAGA-3»),
K5 plakater (forover, 5′-GAGCAGGGCACCAAGAC-3 «; revers , 5»-CTCCGCATCAAAGAACATC-3 «), og
snegl plakater (forover, 5′- TTCTCCCGAATGTCCCT -3′; omvendt, 5′-TCAGCCTTTGTCCTGTAGC 3 «) ble anvendt for PCR-amplifikasjon. PCR-reaksjonen ble evaluert ved å merke PCR-produktene på 2% v /v agarosegeler. Bånd ble normalisert ved bruk av GAPDH å korrigere for forskjeller i lasting av cDNA
spheroid formasjon
I ikke-festede retter (Costar, USA), Cells (1 × 10
4) var suspendert i definert, serumfritt medium bestående av DMEM /F-12 (Gibco), 10 ng /ml human rekombinant basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF, R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1..
Effekter av CAA på levedyktigheten av ondartede HaCaT celler. Etter at cellene ble utsatt for 0,0, 50,0, 100,0 eller 200,0 uM CAA i 24 og 48 timer henholdsvis, ble deres viabilities målt ved anvendelse av en celletelling kit-8-analyse. De relative prosenter av celle levedyktighet ble bestemt ved å sammenligne veksten av celler eksponert for ingen CAA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0058915.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Effekter av SB203580 på cellelevedyktigheten og på fosforylering av p38. (A) Virkningen av SB203580 på levedyktigheten av maligne HaCaT-celler. Etter at cellene ble utsatt for 0,0, 5,0, 10,0, 20,0 eller 40,0 uM av SB203580 i 24 timer, ble deres viabilities målt ved anvendelse av en celletelling kit-8-analyse. De relative forhold av cellenes levedyktighet ble plottet med ubehandlede celler å bestemme 100% aktivitetsnivå. (B) SB203580 blokkert CAA-indusert fosforylering av p38. (
gggynrrrcc
).
doi:10.1371/journal.pone.0058915.s003
(TIF)
Acknowledgments
The
