Abstract
Esophageal kreft er en av de vanligste kreftformene, og 5-års overlevelse er mindre enn 10% på grunn av mangel på effektive terapeutiske midler. Denne studien var å evaluere antitumor aktivitet av Ec-LDP-Hr-AE, en nylig utviklet bispesifikt enediyne strømløs fusjonsprotein rettet mot både epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) og epidermal vekstfaktor-reseptor 2 (HER2), på esophageal kreft. Fusjonsproteinet Ec-LDP-Hr-AE består av to Oligopeptide ligander og en enediyne antibiotika lidamycin (LDM) for reseptorbinding og celledreping, henholdsvis. Den aktuelle studien viste at Ec-LDP-Hr hadde høy affinitet til å binde til esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) celler, og enediyne revitalisert fusjonsprotein Ec-LDP-Hr-AE viste potent cytotoksisitet til ESCC celler med differensial uttrykk av EGFR og HER2. Ec-LDP-Hr-AE kan forårsake betydelig G2-M arrest i EC9706 og KYSE150 celler, og det også indusert apoptose i ESCC celler i en dose-avhengig måte. Western blot analyser viste at Ec-LDP-Hr-AE forfremmet caspase-3 og caspase-7 aktiviteter samt PARP cleavage. Videre Ec-LDP-Hr-AE hemmet celleproliferasjon via avtagende fosforylering av EGFR og HER2, og videre utøves inhibering av aktiveringen av deres nedstrøms signaliseringsmolekyler.
In vivo
, på en tolerert dose, Ec-LDP-Hr-AE hemmet tumorvekst med 88% når det ble administrert til nakne mus med menneskelig ESCC celle KYSE150 xenografter. Resultatene indikerte at Ec-LDP-Hr-AE utstilt potent anti-Caner effekt på ESCC, noe som tyder på det kan være en lovende kandidat for målrettet behandling av spiserørskreft
Citation. Guo XF, Zhu XF, Yang WC Zhang SH, Zhen YS (2014) En EGFR /HER2-bispesifikt og Enediyne-Energized Fusion Protein Viser Høy Effekt mot spiserørskreft. PLoS ONE 9 (3): e92986. doi: 10,1371 /journal.pone.0092986
Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA
mottatt: 29 november 2013; Godkjent: 27 februar 2014; Publisert: 24 mars 2014
Copyright: © 2014 Guo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes delvis av Natural Science Research Project i opplærings~~POS=TRUNC i Henan-provinsen i Kina (No. 12B350004 til XFG), Natural Science Foundation of China (No. 81202447 til XFG, https://www.nsfc.gov National. cn /Portal0 /default152.htm), og et stipend fra USCACA (No. USCACA-TIGM-001 til WCY). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
esophageal kreft er en av de mest vanlige kreftformer, så vel som den sjette vanligste årsak til kreft-relaterte dødsfall i verden. De nordlige regionene i Henan-provinsen i Kina har den høyeste forekomsten av spiserørskreft, spesielt esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) [1], [2]. Selv om mange behandlingsalternativer er nå tilgjengelig, inkludert kirurgi, kombinert modalitet strategier som før eller etter operasjonen kjemoterapi med eller uten strålebehandling, og definitive chemoradiation, prognosen for spiserørskreft er dårlig med en 5-års overlevelse mindre enn 10% [3] – [5]. På grunn av ulempene med kjemoterapi agenter, som for eksempel alvorlige toksiske bivirkninger, den høye forekomsten av resistens, og små effekter på overlevelse, det er et presserende behov for utvikling av nye effektive terapeutiske midler, rettet mot molekylære forandringer spesifikke i spiserøret . karsinom, særlig de i human epidermal vekstfaktor reseptor (HER) familie [6]
HER familien av tyrosin kinase reseptorer inneholder fire medlemmer: HER1 /EGFR, HER2 /neu, HER3 og HER4. Ligand binding til reseptorer resulterer i en reseptor-dimerisering, initierer så en serie av intracellulære hendelser som til slutt fremmer cellevekst, proliferasjon, differensiering og migrering [7]. Overekspresjon av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) og human epidermal vekstfaktor-reseptor-2 (HER2) har blitt observert i mange humane kreftformer, slik som lunge, hode og nakke, bryst, eggstokk, og de har vist seg å spille viktige roller i begge dannelse og progresjon av mange vanlig forekommende kreft [8]. I spiserørskreft, oppstår EGFR overekspresjon i 30% -90% [9], [10], og økt forekomst av HER2 varierer fra 19% -43% [11]. Videre er overekspresjon av både EGFR og HER2 ble observert i 18% -25% av pasientene med spiserørskreft [12], [13]. Derfor ville en agent rettet mot både EGFR og HER2 vise mer effektive terapeutiske effekter på esophageal kreftpasienter.
Ec-LDP-Hr-AE, et bispesifikt fusjonsprotein som består av to oligopeptides (EC, 22 aminosyrer av EGF og Hr, VH CDR3 region av anti-HER2 C6.5 antistoff) spesifikk for EGFR og HER2, og en enediyne antibiotika lidamycin (LDM), ble konstruert og rapportert i vår tidligere studie [14]. Den viste potent cytotoksisitet til en rekke karsinomceller
in vitro
, og var svært effektive i å hemme veksten av humane ovarie caner SK-OV-3-xenografter
in vivo
. Imidlertid er antitumor effekt av Ec-LDP-Hr-AE på spiserørskreft ikke godt studert. I denne studien har vi ikke bare måles bindingsaffiniteten av Ec-LDP-Hr fusjonsprotein til esophageal Caner celler, men også evaluert styrken av energi fusjon proteiner
in vitro Hotell og
in vivo
. Virkningene av Ec-LDP-Hr-AE på cellesyklus distribusjon og apoptose ble også analysert. For å belyse mekanismene som er involvert i cytotoksisitet og apoptose-induksjon av Ec-LDP-Hr-AE, uttrykk for apoptose relaterte molekyler og nøkkelmolekyler i HENNES signalveier ble analysert i tillegg.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Kvinne BALB /c naken mus (6-8 uker) som brukes i forsøkene ble kjøpt fra Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, og vert i henhold til spesifikke patogen -fri forhold. Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av dyreforsøk Ethics Committee av Institute of Medicinal bioteknologi, Chinese Academy of Medical Sciences.
Cellelinjer og kultur
Menneskelig esophageal carcinoma cellelinjer EC1, ECa109, EC9706 og KYSE150 og musfibroblastcellelinje NIH-3T3 ble erholdt fra Cell Center of Peking Union Medical College, Kina, og dyrket under en fuktig atmosfære med 5% CO
2 ved 37 ° C i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum ( FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), 2 mmol /L glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 mikrogram /ml streptomycin.
Reagenser og antistoffer
(3- (4, 5-dimetyl-tiazol-2-yl) -2, 5-dipheny-ltetrazolium-bromid (MTT), fluoresceinisotiocyanat (FITC) og isoprophyl-β-D-thiogalactopranoside (IPTG) ble kjøpt fra Sigma Chemical Aldrench Inc. (St. Louis, MO, USA). Alle antistoffene inkludert fosforylert-HER2, -EGFR, -AKT, -extracellular regulert protein kinase (ERK), -p38 mitogen-aktivert protein kinase (MAPK), c-Jun N-terminal kinase ( JNK) monoklonale antistoffer og anti-EGFR, -HER2, -AKT, -ERK, -p38MAPK, -JNK, -caspase 3, -caspase 7, -cleaved PARP antistoffer ble oppnådd fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anti-β-aktin antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Pepperrot (HRP) konjugert geit anti-kanin /mus antistoffer ble også kjøpt fra av Cell Signaling Technology.
Utarbeidelse av strømførende fusjonsproteiner
Utarbeidelse av bispesifikt fusjonsprotein Ec-LDP- Hr-AE og dets tilhørende monospesifikke fusjonsproteiner Ec-LDP-JE og LDP-Hr-JE ble beskrevet i vår tidligere studie [14]. Kort fortalt ble DNA-fragmenter som koder for EC-LDP-Hr, EC-LDP og LDP-Hr oppnås ved PCR og DNA-kloning teknikker, og da de ble satt inn i pET30a vektor for å generere ekspresjonsplasmider pet
Ec-LDP- Hr
, pet
Ec-LDP Hotell og pet
LDP-Hr
. Disse plasmider ble deretter transformert inn i
Escherichia coli BL21 plakater (
DE3
), og fusjonsproteinene ble uttrykt ved tilsetning av IPTG. Fusjonsproteinene ble hentet fra periplasmarommet av
E.coli
av osmotisk sjokk metode (PET systemhåndboken, 9
th edition, Novagen) og renset ved affinitetskromatografi (HisTrap HP-kolonnen, GE Healthcare) . De strømførende fusjonsproteiner Ec-LDP-Hr-AE, EC-LDP-JE og LDP-Hr-JE ble konstruert ved å integrere den aktive enediyne kromofor (AE) av lidamycin inn i EC-LDP-Hr, EC-LDP og LDP- Hr proteiner, respektivt.
bindingsaffinitet assay
A flow-cytometri-baserte immunofluorescens-analysen ble anvendt for å måle bindingsaffiniteten av fusjonsproteinet Ec-LDP-Hr til esophageal kreftceller [15] . EC-LDP-Hr-protein ble FITC-merket i 16 timer i en karbonat-bufferoppløsning (100 mmol /l NaHCO
3, 10 mmol /l Na
2CO
3, pH 9,0) ved 4 ° C . Merket protein ble separert fra ubundet FITC ved hjelp av Sephadex G-25 kolonne (GE Healthcare). Deretter ble FITC-merket EC-LDP-Hr-protein ble inkubert med 10
6 EC9706 celler, KYSE150 celler eller NIH 3T3-celler i et 100 ul volum av buffer (PBS + 2% FBS) i 2 timer ved romtemperatur. Etter tre gangers vask med 500 mL av bufferen ble cellene analysert med strømningscytometer (BD Company). Dataene ble analysert med Prism 5-programvaren (GraphPad Software).
MTT analyse
Celler ble løsnet ved trypsinering og sådd ut i 96-brønners flatbunnede plater, dyrket i 24 timer før eksponering for ulike konsentrasjoner av LDM, EC-LDP-Hr-AE, EC-LDP-AE eller LDP-Hr-AE i 48 timer. MTT-løsning (5 mg /ml, 20 ul) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i ytterligere 4 timer ved 37 ° C. Supernatanten ble fjernet, og 150 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn. Absorbansen ved 570 nm ble målt ved anvendelse av et Multiskan spektrum instrument (Thermo Labsystems, Rochford, IL, USA). Absorbans verdier ble uttrykt som en prosentandel av den for ubehandlede celler, og konsentrasjonene av testede midler som resulterer i 50% veksthemning (IC
50) ble beregnet.
cellesyklusfordeling analyse
virkningene av bispesifikke fusjonsprotein Ec-LDP-Hr-AE på cellesyklusen ble evaluert ved anvendelse av propidiumjodid (PI) farging. Etter behandling med 0,1 nmol /L, 0,5 nmol /L og 1 nmol /L Ec-LDP-Hr-AE i 48 timer, EC9706 og KYSE150 celler ble fordøyd med trypsin-EDTA og vasket med PBS. Cellene ble deretter resuspendert i 500 ul PBS med 50 ug /ml PI og 100 ug /ml RNase A. Etter inkubering ved 37 ° C i 30 minutter, ble cellene analysert for fluorescens med et strømningscytometer (BD Company).
Cell apoptose analysen
effektene av bispesifikt fusjonsprotein Ec-LDP-Hr-AE på indusere apoptose i ESCC celler ble målt ved hjelp av Hoechst farging og Annexin V-FITC /PI farging. For Hoechst farging ble KYSE150 celler dyrket på Dekk og inkubert i 24 timer, deretter 0,1 nmol /L, 0,5 nmol /L og 1 nmol /L Ec-LDP-Hr-AE ble tilsatt og inkubert i en annen 48 timer. Celler i Dekk ble fiksert med metanol, vasket med PBS, og farget med 1 mg /ml Hoechst 33342 i 15 min. Bildene ble observert under et fluorescens mikroskop (Nikon TE 2000 u). For Annexin V-FITC /PI farging ble de apoptotiske celler målt ved hjelp av en Annexin V-FITC /PI farging kit (Biosea teknologi). Etter 0,1 nmol /L, 0,5 nmol /L og 1 nmol /L av Ec-LDP-Hr-AE behandling i 48 timer, ble cellene høstet, vasket to ganger med PBS og sentrifugert ved 1000 rpm i 5 min. Cellepelletene ble resuspendert i 500 ul bindingsbuffer inneholdende 10 ul Annexin V-FITC og 5 ul PI, inkubert ved romtemperatur i 15 min, og deretter analysert for fluorescens med et strømningscytometer (BD Company).
Western blot-analyse
Cellene ble lysert i 30 minutter i radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) buffer inneholdt flere protease-inhibitorer (for eksempel 1 ug /ml aprotinin, 10 ug /ml leupeptin, 1 mmol /l fenylmetylsulfonylfluorid, 2 mmol /L NAVO
4, og 50 mmol /l NaF). Protein ble ekstrahert fra celler ble kvantifisert ved bruk av bicinchoninic syre kit (Pierce Biochemicals), og 30 pg av hvert total protein, ble påført på 10% SDS-PAGE og deretter elektroblottet på polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore). Membranene ble inkubert med 1% BSA i 2 timer ved romtemperatur før inkubering over natten ved 4 ° C med primære antistoffer (fortynnet 1:1000 med TBST-buffer, Cell Signaling Technology). Deretter ble membranene inkubert med sekundær HRP-konjugert antistoff (1:5000 fortynning; Cell Signaling Technology) i 1 time etter vasking tre ganger med TBST-buffer. De spesifikke båndene ble visualisert med Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrat kit (Millipore) og fanget av ChemiImager 5500 bildesystem (Alpha Innotech Corp.).
In vivo
effekt analyse
in vivo
effekt av strømførende fusjonsproteiner ble evaluert i en KYSE150 xenografter naken mus modell. 1 × 10
7 KYSE150 celler suspendert i 200 mL PBS ble inokulert s.c. i høyre armhulen av nakne mus. Etter 3 uker ble tumorer tatt ut fra nakne mus og dissekert aseptisk i sterilt saltvann. Stykker av tumorvev (2 mm
3 i størrelse) ble deretter transplantert inn i høyre armhule til nakne mus ved en trokar, og såret ble forseglet ved collodion. Tumor-bærende mus ble tilfeldig delt inn i 3 grupper (n = 7) når tumorstørrelsen var over 100 mm
3 (ca. 10 dager senere). Lidamycin (0,05 mg /kg) og bispesifikke fusjonsprotein Ec-LDP-Hr-AE (0,3 mg /kg) ble injisert i.v. i halevenen, og gitt i et 200 ul volum av PBS ved dag 11 og dag 21, henholdsvis. Kontrollgruppe av mus mottok 200 ul PBS behandling samtidig som fusjonsproteiner. Tumorstørrelse ble målt hver 3 dag og tumorvolumet ble bestemt av lengden × bredde
2/2. Hemming prisene ble beregnet ved en -. Tumor volum (behandlet) /tumor volum (kontroll) x 100%
Statistisk analyse
Resultatene av kvantitative data i denne studien ble presentert som gjennomsnitt ± SD. Forskjeller mellom grupper ble statistisk analysert ved hjelp av uparet tosidige t-test, og P-verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Utarbeidelse av strømførende fusjonsproteiner
Ifølge vår forrige tilnærming, ble de gener som koder for fusjonsproteiner Ec-LDP-HR, EC-LDP, og LDP-HR bygget og de kodede proteinene ble uttrykt i periplasmarommet av
E.coli
. Fusjonsproteiner ble renset ved hjelp av Ni
2+ affinitetskromatografi og renheten av fusjonsproteiner var over 90% som bestemt ved SDS-PAGE og høyytelses-væske-kromatografi (HPLC). Den aktive enediyne kromofor (AE) for LDM og tre fusjonsproteiner ble rekonstruert
in vitro
å generere strømførende fusjonsproteiner Ec-LDP-Hr-AE, EC-LDP-JE og LDP-Hr-JE. Resultatene fra revers-fase HPLC viste at tre strømførende fusjonsproteiner ble vellykket montert.
Binding affinitet Ec-LDP-Hr protein til esophageal kreftceller
EC9706 celler, KYSE150 cellene og NIH 3T3 cellene ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av FITC-merket EC-LDP-Hr, og fluorescensstyrkene ble målt ved flow-cytometer. De gjennomsnittlige fluorescensstyrkene (MFI) av EC9706 celler og KYSE150 celler både betydelig høyere (P 0,05), som indikerte Ec-LDP-Hr hadde sterke bindingsaktivitet til esophageal kreft celler (fig 1A, 1C). Imidlertid gjorde de MFI av NIH 3T3 celler ikke viser betydelig økning, noe som medførte Ec-LDP-Hr var ikke i stand til å binde seg til EGFR og HER2 negative NIH 3T3 celler (figur 1E). Ifølge mikrofinansinstitusjoner og EF-LDP-HR konsentrasjoner, bindingsaffiniteten (K
d) verdier ble beregnet med Prism 5-programvaren. K
d verdier for Ec-LDP-Hr bundet til EC9706 og KYSE150 celler var 5,283 mikromol /l og 3,562 mikromol /L, henholdsvis (Fig. 1B, 1D).
EC9706 celler (A) , KYSE150-celler (C) eller NIH 3T3-celler (E) ble inkubert med FITC-merket EC-LDP-Hr-protein ved indikerte konsentrasjoner, og de midlere fluorescensstyrkene (MFI) ble analysert ved flow-cytometer. Økte konsentrasjoner av FITC-merkede EC-LDP-Hr proteiner ble inkubert med EC9706-celler (B) eller KYSE150 celler (D). Etter FACS ble MFI plottet mot proteinkonsentrasjoner.
Cytotoksisitet av strømførende fusjonsproteiner
in vitro
Den cytotoksisitet av bispesifikt energi fusjonsprotein Ec-LDP- Hr-AE ble utført på fire humane esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) cellelinjer som uttrykker forskjellige nivåer av EGFR og HER2 og EGFR /HER2 negative NIH 3T3-celler ved hjelp av MTT-analyser (fig. 2A). LDM og monospesifikke energi fusjonsproteiner Ec-LDP-AE og LDP-Hr-AE ble også testet for sammenligning. Som vist på fig. 2B, det bispesifikke energi fusjonsproteinet Ec-LDP-Hr-AE drepte både ESCC celler og NIH 3T3 celler med svært høy potens. IC
50 verdiene av EC-LDP-Hr-AE for 4 ESCC celler var under 10
-10 mol /L nivå (Fig. 2C). Men det bispesifikke Ec-LDP-Hr-AE protein var ikke alltid mer potent enn de monospesifikke kolleger og LDM. Resultater fra statistisk analyse viste at forskjellene i IC
50 verdier av LDM, EC-LDP-Hr-AE, EC-LDP-AE og LDP-Hr-AE for EC-en, ECa109 og EC9706 cellene ikke var statistisk signifikant . Men forskjellene i IC
50 Verdiene for KYSE150 celler var signifikante (P 0,05). Videre IC
50 Verdien av Ec-LDP-Hr-AE for NIH 3T3 celler ikke viser signifikante forskjeller sammenlignet med de fire ESCC cellene.
(A) Uttrykk for EGFR og HER2 på annen esophageal kreft celler og NIH 3T3-celler analysert ved hjelp av Western blot. (B) Et celledrepende virkning av EC-LDP-Hr-AE på spiserørskreft cellelinjer KYSE150, EC9706, ECa109 og EC-1og musfibroblastcellelinje NIH 3T3 ble testet ved MTT-analyser. Celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av EC-LDP-Hr-AE i 48 timer, og resultatene ble erholdt fra tre uavhengige eksperimenter. (C) IC
50 verdier av lidamycin (LDM), EC-LDP-Hr-AE, EC-LDP-AE, og LDP-Hr-AE mot 4 typer esophageal kreftceller og NIH 3T3 celler ble målt ved MTT-analyse. Kolonner, mener fra tredoble eksperimenter, barer, SD.
Effekter av bispesifikt fusjonsprotein Ec-LDP-Hr-AE på cellesyklus distribusjon
EC9706 og KYSE150 celler ble eksponert for 0,1 , 0,5 og 1 nmol /L av Ec-LDP-Hr-AE i 48 timer, og cellesyklusfordelingen ble evaluert ved PI farging og strømningscytometri-analyse. Kontrollceller (EC9706 og KYSE150) fordelt på G2-M fasen var henholdsvis 10,51% ± 0,98% og 6,26% ± 1,96%, mens celler behandlet med 0,1 nmol /L av Ec-LDP-Hr-AE distribueres i G2-M fasen ble 86,00% ± 0,98% og 89,36% ± 0,71% henholdsvis. Disse data indikerte at en betydelig G2-M rest var forårsaket av Ec-LDP-Hr-AE behandling (Fig. 3). Selv om det var en stor shift (ca 12,84% ~31.53% økning) i G2-M fasen etter eksponering for 0,5 nmol /L og en nmol /L av Ec-LDP-Hr-AE, cellene distribueres i G2-M fasen var mindre enn den som ble behandlet med 0,1 nmol /L av Ec-LDP-Hr-AE, noe som indikerte at G2-M-faseceller nådd toppen med 0,1 nmol /L av Ec-LDP-Hr-AE behandling (fig. 3).
EC9706 celler eller KYSE150-celler ble utsatt for Ec-LDP-Hr-AE i 48 timer ved de angitte konsentrasjoner og cellecyklus-fordeling ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri etter PI farging. Kolonner, mener fra tredoble eksperimenter, barer, SD.
Effekter av bispesifikt fusjonsprotein Ec-LDP-Hr-AE på apoptose
Resultatene fra Hoechst 33342 farging og Annexin V- FITC /PI flekker analyser viste at apoptotiske celler (EC9706 og KYSE150) økte markert i en dose-avhengig måte etter behandling med Ec-LDP-Hr-AE. Hoechst 33342 farging ble anvendt for å detektere endringer i atom morfologi. Kjerner av ubehandlede celler var normale i utseende og oppviste diffust farging av kromatin. Etter eksponering for forskjellige konsentrasjoner av EC-LDP-Hr-AE i 48 timer, KYSE150 celler presentert typiske morfologiske endringer av apoptose slik som kromatin kondensering eller en krympet kjerne (fig. 4A). Som vist på fig. 4B, forholdene mellom apoptotiske EC9706 celler etter behandling med 0,1, 0,5 og 1 nmol /L av Ec-LDP-Hr-AE var 15,06% ± 0,29%, 38,10% ± 0,64% og 50,00% ± 0,39% henholdsvis, noe som viste signifikant øker sammenlignet med kontrollceller (p 0,01). De apoptotiske celler også økt mye for KYSE150 celler etter eksponering for 0,1, 0,5 og 1 nmol /L av Ec-LDP-Hr-AE, med apoptose forholdstall på 16,29% ± 0,35%, 21,54% ± 0,51% og 32,99% ± 0,38%, henholdsvis (P 0,01 versus kontroll, figur 4C.). I tillegg, Ec-LDP-Hr-AE indusert apoptose i EGFR /HER2 negative NIH 3T3-celler, og forholdene mellom apoptotiske celler etter behandling med 0,1, 0,5 og 1 nmol /L av Ec-LDP-Hr-AE var 16,47% ± 0,44%, 15,28% ± 0,45% og 19,90% ± 0,12%, henholdsvis. Den apoptotiske NIH 3T3-celler var betydelig mindre enn for EC9706 celler og KYSE150 celler ved eksponerings doser på 0,5 nmol /L og 1 nmol /L av Ec-LDP-Hr-AE (P . 0,05, figur 4D).
(A) KYSE150 celler ble behandlet ved Ec-LDP-Hr-AE ved angitte konsentrasjoner i 48 timer, og deretter farget med Hoechst 33342. bildene ble observert under et fluorescens mikroskop ved 200 x. EC9706-celler (B), KYSE150-celler (C) eller NIH 3T3-celler (D) ble utsatt for de angitte konsentrasjoner av EC-LDP-Hr-AE i 48 timer. Celler ble høstet og farget med en blanding av FITC-Annexin V og PI. Nedre venstre kvadrant (FITC
– /PI
-) angitte levedyktige celler, og nedre høyre kvadrant (FITC
+ /PI
-) indikerte tidlig apoptotiske celler. De øvre høyre kvadrant (FITC
+ /PI
+) indikerte slutten apoptotiske celler, og de øvre venstre kvadrantene (FITC
– /PI
+) indikerte de døde cellene
Effekter av bispesifikt fusjonsprotein Ec-LDP-Hr-AE på EGFR /HER2 signalveier aktivering
for å karakterisere de molekylære mekanismene som er involvert i cytotoksisitet og apoptose-induksjon av Ec-LDP-HR- AE, undersøkte vi dens virkninger på uttrykk for apoptose relaterte molekyler og flere viktige molekyler i EGFR /HER2 signalveier. Som vist på fig. 5, Ec-LDP-Hr-AE fremmet kaspase-3 og kaspase-7-aktivitet, så vel som PARP-spaltning, noe som indikerer at EC-LDP-Hr-AE-indusert apoptose kan være forbundet med mitokondrielle veier. Videre behandling med Ec-LDP-Hr-AE ledet til betydelig redusert fosforylering av EGFR og HER2, mens uttrykket av inaktivert EGFR og HER2 ikke ble endret. Fosforyleringen av nedstrøms signalmolekyler av EGFR /HER2 reaksjonsvei, som for eksempel AKT, ERK, JNK og p38MAPK ble ytterligere inhiberes ved behandling av Ec-LDP-Hr-AE (fig. 5). De densitometry data viste at fosforylert HER2 og p38MAPK sunket betraktelig med alle angitte konsentrasjoner av Ec-LDP-Hr-AE-behandling (data ikke vist, P 0,05). Fosforylert EGFR, AKT og JNK sunket betraktelig med 0,5 nmol /L og en nmol /L av Ec-LDP-Hr-AE behandling (P 0,05) og fosforylert ERK sunket betraktelig med en nmol /L av Ec-LDP-Hr-AE behandling (data ikke vist, P 0,05). Nivåene av total AKT, ble ERK, p38MAPK og JNK ikke påvirket av behandling av Ec-LDP-Hr-AE, og densitometry data støttet denne konklusjonen (data ikke vist).
uttrykk for apoptose relaterte molekyler (f.eks Caspase 3, caspase 7 og PARP) og nøkkelmolekyler i EGFR /HER2 signalveier (f.eks fosforylert-EGFR, -HER2, -ERK, -p38MAPK, -JNK, -AKT) ble bestemt ved Western blot analyse. β-actin ble servert som en lasting kontroll.
In vivo
effekt av strømførende fusjonsproteiner
In vivo
antitumor effekt av energi fusjonsproteiner ble undersøkt i en KYSE150 xenotransplantater naken mus-modellen. Som vist i figur 6A, LDM undertrykkes veksten av KYSE150 xenotransplantater med 61,4% ved den maksimale tolererte dose (0,05 mg /kg), og det bispesifikke fusjonsproteinet Ec-LDP-Hr-AE i en dose på 0,3 mg /kg inhiberte vekst av KYSE150 xenotransplantater hos 88%, som viste statistisk signifikante forskjeller (p 0,05) sammenlignet med LDM-behandlede gruppe ved 0,05 mg /kg. Det er ingen dyr døde ble funnet i de behandlede grupper, og kurvene i kroppsvekt tydet på at dyrene tolereres godt til den administrerte dose av EC-LDP-Hr-AE (fig. 6B).
naken mus (n = 7) som bærer menneskespiserørskreft KYSE150 xenotransplantater ble behandlet med LDM eller Ec-LDP-Hr-AE på dag 11 og dag 21 etter tumorinokulasjon ved halevenen injeksjon. De midlere tumorvolum (A) og den midlere kroppsvekt av mus (B) i hver gruppe er vist. Ec-LDP-Hr-AE i en dose på 0,3 mg /kg hemmet veksten av KYSE150 xenotransplantater med 88%, som viste statistisk signifikante forskjeller sammenlignet med LDM-behandlede gruppe ved den maksimale tolererte dose (0,05 mg /kg) (P 0,05 ).
Diskusjoner
kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi er fortsatt bærebjelke i behandling for esophageal kreft, men nylig en rekke målrettede behandlingsformer er under utredning med mål om å bedre respons hastighet og overlevelse hos pasienter med spiserørskreft [6], [16], [17]. Som kjent har overekspresjon av EGFR og HER2 blitt observert i over 30% av esophageal karsinomer, og deres overekspresjon er korrelert med redusert overlevelse, økt risiko for tilbakefall, fjern metastase, og motstand mot radioterapi [18]. Derfor har effekten av noen monospesifikke antistoffer og tyrosinkinasehemmere som blokkerer EGFR eller HER2-funksjon, slik som cetuximab, trastuzumab, gefitinib, og erlotinib på esophageal carcinoma blitt undersøkt, men effekten er begrenset så langt [19] – [22] . Forskjellig fra monoklonale antistoffer og tyrosinkinaseinhibitorer, blir immunotoksiner ansett for å være meget effektive på kreftterapi med fordelen av spesifisiteten av antistoffer eller ligander og cytotoksisiteten av giftstoffer [23]. Imidlertid har data fra kliniske studier på immuntoksiner vist sprikende resultater. Flere immuntoksiner var veldig effektiv mot hematologisk kreftsykdom. For eksempel, i fase III studie med pasienter med kutant T-cellelymfom (CTCL), 30% av de 71 pasientene som ble behandlet med denileukin diftitox (DAB
389IL2, Ontak) hadde en objektiv respons, inkludert 10% fullført remisjoner. Og i en fase I studie med 31 pasienter med hårcelleleukemi, BL22 indusert 19 komplett respons (61%) og 5 partielle responser (19%) [24], [25]. Men for solide svulster, immunotoxins viste begrenset antitumor effekt. Årsakene til mislykket behandling av faste tumorer inkludert dårlig inntrengning i svulster og den alvorlige immunresponser [26] – [28]. Vallera og medarbeidere har utviklet nye bispesifikke molekyler ved å smelte to distinkte som målretter ligander til en enkelt toksin med det formål å forbedre spesifisiteten, og resultatene viste at bispesifikke molekyler viste enten økt antitumoraktivitet eller bredere spektrum av reaktivitet enn de monospesifikke molekyler [15 ], [29], [30] – [34]. Fusjonsproteinet Ec-LDP-Hr-AE vi bygget tidligere er et bispesifikt molekyl som målgruppe både EGFR og HER2. Ec-LDP-Hr-AE benytter to oligopeptides for reseptorbinding og påfølgende intracellulær levering av en enediyne antibiotika lidamycin for celledreping. I denne studien ble antitumor aktivitet av Ec-LDP-Hr-AE på spiserørskreft undersøkes, fordi co-overexpresssion av EGFR og HER2 ble observert i et flertall av esophageal plateepitel karsinom.
Binding med tilsvarende reseptorer er forutsetningen for Ec-LDP-Hr-AE til å utøve sin tumorcelle-selektive cytotoksiske effekter. Derfor ble bindingskapasitet av EC-LDP-Hr-proteinet til ESCC celler evaluert ved hjelp av et flow-cytometri-baserte immunofluorescens-analysen. Resultatene viste at Ec-LDP-Hr-proteinet var i stand til å binde til ESCC celler med høy affinitet. Men Ec-LDP-Hr ikke klarte å vise bindingsaktivitet til EGFR og HER2 negative NIH 3T3 celler. I celle levedyktighet analysen, det bispesifikke og enediyne-energi fusjonsprotein Ec-LDP-Hr-AE viste ekstremt potente draps effekter på esophageal kreft celler med IC
50 verdier ved svært lavt nivå ( 10
-10 mol /L). For de KYSE150 celler som uttrykker både EGFR og HER2, EC-LDP-Hr-AE var den mest cytotoksiske til esophageal kreftceller når man sammenligner med LDM og to monospesifikke fusjonsproteiner (EF-LDP-AE og LDP-Hr-AE). Forbedret aktivitet av bispesifikke fusjonsprotein kan forklares ved at Ec-LDP-Hr-AE bundet til både EGFR og HER2, og gjorde det mindre sannsynlighet for å dissosiere fra celleoverflaten, for derved å øke sjansene for internalisering av dens cytotoksisk del og utøver celle drepe effekter. Men det bispesifikke Ec-LDP-Hr-AE protein var ikke alltid mer potent enn de monospesifikke kolleger og LDM som resultatene av statistiske analysen viste at forskjellene i IC
50 verdier av LDM, EC-LDP-Hr-AE EC-LDP-AE og LDP-Hr-AE for EC-en, ECa109 og EC9706 celler var ikke statistisk signifikant. Videre fant vi at cytotoksisitet av strømførende fusjonsproteiner til ESCC cellene ikke var korrelert godt med EGFR og HER2 uttrykk nivåer. For eksempel IC
50 verdi av EC-LDP-Hr-AE for EC9706 celler med lav HER2-ekspresjon var 5,12 x 10
-12 mol /l, mens IC
50 verdi for KYSE150 celler med høy EGFR og HER2-nivå var 6,10 × 10
-11 mol /L. De tilsvarende resultater ble også observert mellom styrken av monospesifikke fusjonsproteiner og EGFR /HER2-nivåer. Dette fenomenet har blitt observert i andre studier om målrettede legemidler, slik som lapatinib [35], [36]. Som et resultat, er ytterligere studier som fokuserer på å avsløre de molekylære mekanismene for følsomhet for Ec-LDP-Hr-AE strengt nødvendig, og dette kan gi nyttige data for valg av pasienter som vil ha nytte av EGFR /HER2-bispesifikt agenter.
for å belyse mekanismene for bispesifikt Ec-LDP-Hr-AE utstilt cytotoksisitet på esophageal kreftceller, PI flekker, Hoechst flekker, og Annexin V-FITC /PI flekker studier ble utført for å undersøke cellesyklus og apoptose. Resultater fra cellesyklusanalyse viste at Ec-LDP-Hr-AE forårsaket signifikant G2-M arrest, hvor G2-M-faseceller nådd toppen med 0,1 nmol /L av Ec-LDP-Hr-AE behandling. Dette resultatet var muligens på grunn av apoptotiske og døde celler økte etter behandling med 0,5 nmol /L og 1 nmol /L Ec-LDP-Hr-AE. Derfor er G2-M rest var mindre betydningsfull enn den til 0,1 nmol /L Ec-LDP-Hr-AE behandling. Ec-LDP-Hr-AE også indusert apoptose i EC9706 og KYSE150 celler i en dose-avhengig måte, og apoptose indusert ved Ec-LDP-Hr-AE kan være forbundet med mitokondrielle trasé, fordi kaspase-3 og kaspase-7 aktiviteter så vel som PARP-spaltning økt betydelig, som vist ved Western blot-analyse.
