Abstract
Tumorceller er i seg selv heterogen og ofte oppviser nedsatt adhesjon, noe som resulterer i avgivelse av tumorceller inn i sirkulasjonen for å danne sirkulerende tumorceller (CTCs). En fraksjon av disse er levende CTCs med potensialet av metastatisk kolonisering, mens andre er på forskjellige stadier av apoptose og kan dermed være mindre relevant for forståelsen av sykdommen. Isolering og karakterisering av levende CTCs kan forsterke informasjon gitt av standard oppregning å hjelpe leger til mer nøyaktig etablere diagnose, velge terapi, overvåke respons, og gi prognose. Vi har tidligere rapportert om en gruppe på nær-infrarød (NIR) heptamethine carbocyanine fargestoffer som er spesielt og transporteres aktivt inn i levende kreftceller. I denne studien ble denne levedyktig tumorcelle-bestemt atferd benyttes for å påvise levende CTCs i prostatakreftpasienter. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra 40 pasienter med lokalisert prostatakreft sammen med 5 pasienter med metastatisk sykdom ble farget med IR-783, prototypen heptamethine cyanine fargestoff. Fargede celler ble utsatt for flowcytometrisk analyse for å identifisere levende (NIR
+) CTCs fra bassenget av totale CTCs, som ble identifisert ved EpCAM farging. Hos pasienter med lokalisert tumor, levende CTC teller korresponderte med totalt CTC tall. Høyere levende CTC tellinger ble sett hos pasienter med større svulster og de med mer aggressive patologiske funksjoner, inkludert positive marginer og /eller lymfeknute invasjonen. Enda høyere CTC tall (levende og totalt) ble påvist hos pasienter med metastatisk sykdom. Live-CTC teller avvist når pasientene fikk effektive behandlinger, og omvendt grevene tendens til å stige på tidspunktet for sykdomsprogresjon. Vår studie viser muligheten for å bruke denne flekker teknikk for å identifisere levende CTCs, og skaper en mulighet for ytterligere molekylær avhør av en mer biologisk relevant CTC befolkningen
Citation. Shao C, Liao CP, Hu P, Chu CY Zhang L, Bui MHT, et al. (2014) Påvisning av Levende Sirkulasjonstumorceller av en klasse av nær-infrarødt Heptamethine Carbocyanine Fargestoffer i pasienter med lokal og metastatisk prostatakreft. PLoS ONE 9 (2): e88967. doi: 10,1371 /journal.pone.0088967
Redaktør: Joseph Najbauer, Universitetet i Pécs Medical School, Ungarn
mottatt: 19 september 2013; Godkjent: 14 januar 2014; Publisert: 14. februar 2014
Copyright: © 2014 Shao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra Prostate Cancer Foundation, National Institutes of Health /National Cancer Institute (2PO1CA098912 og 1RO1CA122602) og Board of Governors Cancer Research Chair (LWKC), og ved Program for International Science and Technology Cooperation of China (No . 2011DFA33110). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Solide svulster er i en konstant tilstand av utviklingen med progressiv heterogenitet [1], [2]. Prosessen med metastatisk progresjonen blir ledsaget av flere fenotypiske vekslinger som resulterer i redusert klebrighet og økt cellulær motilitet blant andre endringer [3]. Noen bevegelige kreftcellene har evnen til å spre seg til fjerne områder via blodkar og lymfekar kanaler og invadere vev som fører til dannelsen av en metastatisk lesjon [4]. Sirkulerende tumorceller (CTCs) utgjør således en viktig forbindelse mellom primærsvulster og deres fjernmetastaser, som avgrenser irreversibel progresjon av sykdommen. Isolering og karakterisering av disse levende og aktive kreftceller kan forbedre sykdom prognose, som har blitt vist i prostatakreft (PCA) [5].
Den utstøtingen av CTCs er en dynamisk prosess som skjer med både primære og metastatisk svulster. Det faktum at spres tumorceller kan påvises i blodet av PCA pasienter etter prostatektomi [6] tyder på at CTCs kan utskilles fra enten resttumor i prostata sengen eller fra metastatiske avleiringer. Molekylær undersøkelse av disse cellene kan gi sanntidsinformasjon om status for ondartet progresjon. Som innsamling av CTCs krever vanligvis lavt volum standard blodprøvetaking, har noen foreslått at CTCs kan utnyttes som en ideell surrogat vev eller væske biopsi for å måle sykdomsstatus [7]. En slik kilde av vev ville gi en enkel, minimal-invasiv vev kilde som kan nås serielt å gi høy tidsmessig definisjon av utviklingen av underliggende sykdom.
prediktiv verdi av CTCs avhengig av tekniske fremskritt for å muliggjøre pålitelig deteksjon og isolasjon. CTCs utgjør bare en liten brøkdel av perifere mononukleære blodceller (PMBCs). Mange nye teknologier er i dag blir testet for CTC deteksjon og isolasjon [8]. Den mest vanlig anvendte strategi er avhengig av epitel-avstamning-spesifikke markører så som EpCAM [9] eller på størrelsesforskjeller i forhold til PBMC [10]. Den eneste FDA-godkjente CTC-analysen benytter en immunomagnetisk separasjonsteknikk basert på ekspresjonen av epitheial overflatemarkører [11], [12]. Den forholdsvis lave følsomhet til analysen, kombinert med behovet for forhåndsfiksering gjør isolatene uegnet for molekylær analyse utover immunfluorescens. Avhengigheten markør uttrykk tillater ikke for omfattende påvisning av heterogene CTC bassenget. Det er også kjent at ikke alle CTC vil resultere i en ny metastatisk lesjon. Bassenget av CTCs er sammensatt av levende og aktivt metastasizing celler og andre personer som er passivt kaster inn i sirkulasjonen [5], [13] – [15], i kombinasjon med apoptotisk tumorcellerester [16] – [18]. Alternative CTC deteksjon strategier er nødvendig, for å isolere metastasizing fraksjon, som er mest sannsynlig å bli funnet i live CTC bassenget.
Å utvikle en kostnadseffektiv metode for å identifisere levende CTCs vurderte vi muligheten for å bruke en gruppe syntetiske nær infrarød (NIR) heptamethine carbocyanine fargestoffer. Vi har tidligere vist at disse organiske fargestoffer er spesielt fraktet til kreftceller og kan skille maligne fra ikke-ondartede celler i xenograft modeller eller spontane svulster
in vivo, etter og i kirurgiske vevsprøver
in vivo
eller
ex vivo product: [19], [20]. Disse fargestoffer er tatt opp og akkumulert av cancerceller via en aktiv transport-system uavhengig av de konvensjonelt anvendte epiteloverflaten markør (EpCAM). Videre opptak av fargestoff krever aktiv (ATP-drevet) transport og således kan sees på som et funksjonelt assay for tumorcellelevedyktighet. Resultatene fra denne studien tyder på at IR-783, prototypen av denne gruppen av utvalgte NIR fargestoffer, kan bli innarbeidet i flere deteksjons protokoller for å identifisere levende CTCs. Disse levende CTCs kunne bli isolert fra kreftpasienter før og under terapeutisk intervensjon gitt de relativt ikke-invasive hjelp av anskaffelser. Videre molekylær avhør kunne da følge med på enkeltcellenivå [21].
Materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugert monoklonalt antistoff (mAb) til humane EpCAM (klon 9C4) og fykoerytrin (PE) -konjugert mus mAb til CD45, sammen med renset isotype-matchet lgG1 og IgG2b, ble anskaffet fra BioLegend (San Diego, CA). Kilden og bruk av andre antistoffer er tidligere blitt rapportert, inkludert de mot human RANKL, HIF-1α, NRP-1, og VEGF, samt de til fosforylert c-MET og p65-subenheten av NFkB [22]. Kildene og rensing av heptamethine carbocyanine fargestoffer har vært rapportert tidligere [19], [20]. Ficoll-Paque PREMIUM 1,084 ble kjøpt fra GE Healthcare (Piscataway, New Jersey), og Histopaque-1077 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Cell Culture
Menneskelig PC -3-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Cellene ble dyrket i RPMI-1640 medium supplementert med 5% føtalt bovint serum (FBS, Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA), penicillin (100 enheter /ml) og streptomycin (100 ug /ml). Cellene ble løsnet med 0,05% trypsin /EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA), vasket i Ca
2 + – og Mg
2 + -fri fosfatbufret saltvann (PBS, Invitrogen), og resuspendert i fullstendig kulturmedium . Celler ble regnet med en TC10 Automated celleteller (Bio-Rad, Hercules, CA), med trypanblått eksklusjon for å bekrefte celle levedyktighet.
Kliniske blodprøver
Pasientblodprøver ble brukt med skriftlig informert samtykke gjennom Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review board-godkjent bio-bank protokoller (IRB # Pro00025217 og # Pro00030418). Kliniske blodprøver ble innsamlet pre-operativt fra 40 PCA pasienter som gjennomgår radikal prostatektomi ved Cedars-Sinai Medical Center. Multiple blodprøver ble erholdt fra gjentatte besøk av 5 pasienter med androgen uavhengig sykdom. Andre blodprøver fra 34 friske mannlige donorer i alderen mellom 32 og 70 år ble oppnådd. Ca. 7,5 ml venøst blod ble oppsamlet i et EDTA-inneholdende lavendel øverste røret (BD, Franklin Lakes, NJ), og sentrifugert ved 1500 rpm i 20 minutter ved romtemperatur på en Heraeus CLINIFUGE sentrifuge (Thermo Scientific, Logan, UT). Etter plasmafraksjonen ble høstet for diagnostiske formål, ble pakket blodcellefraksjon fraktet på is til forskningslaboratorium innen 3 timer etter innsamling.
Isolering av PBMC
PBMC ble isolert med standard tetthet gradient sentrifugering. Den pakkede blodprøve ble fortynnet med et like stort volum av en balansert saltoppløsning inneholdende 0,01% glukose (vekt /volum), 5 mM CaCl
2, 9.8 mM MgCl
2, 540 mM KCl, 126 mM NaCl, og 14,5 mM Tris, pH 7,6. En 2 ml porsjon av den fortynnede prøve ble lagt på en 3 ml Ficoll-Paque pute og underkastet sentrifugering ved 400 x g ved romtemperatur i 40 minutter. Celler i de kjernecellefraksjon ble samlet opp og vasket to ganger i PBS og resuspendert i RPMI-1640 medium inneholdende 5% FBS for videre analyser.
Tumor Cell Spiking og Farging
Alikvoter av PBMC ble gjort slik at hver inneholdt et tilsvarende antall celler fra en donor ml blod, omtrent 2 x 10
6 celler /alikvot. Å pigge med kreftceller, kjent antall levende PC-3-celler i RPMI 1640 medium inneholdende 5% FBS ble tilsatt til PBMC alikvoten. I kontrollstudier tilsatt døde kreftceller, ble PC-3-celler i enkeltcellesuspensjon ble drept i 75% etanol og gjenfunnet i det samme medium. Piggete Prøvene ble deretter farget med 20 uM NIR-fargestoffer ved 37 ° C i 30 minutter. Etter vasking to ganger i PBS for å fjerne frie fargestoffer ble cellene fiksert i formalin i 10 minutter ved romtemperatur, vasket to ganger i PBS og resuspendert i 400 ul cellefarging Buffer (BioLegend). For ytterligere å flekken for overflatemarkører, ble prøvene inkubert først med isotype IgG på is i 10 minutter, og deretter omsatt samtidig med FITC-konjugert mAb til EpCAM og PE-konjugert mAb til CD45 i 20 minutter. Arbeids Forholdet mellom mAbs var 0,1 ug /10
6 celler. Etter vasking to ganger med cellefarging bufferen ble cellene farget med 4 «, 6»-diamidino-2-fenylindol (DAPI, Invitrogen), før den utsettes for deteksjon.
Påvisning av CTC med Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)
To FACS instrumenter (BD Biosciences, MA) ble brukt i studien. For å isolere CTCs, ble en FACSAria III brukes til å sortere positivt merkede celler på en APES belagt cytologi lysbilde (Bio-World, Dublin, OH). For å oppsummere CTCs, ble en LSRII Flowcytometer brukt. Produsent anbefalte test prosedyrer ble fulgt. Parallelt til påvisning av hver human blodprøve, 1 x 10
4 PC-3-celler ble anvendt for å pigge en 1 ml aliquot av prøven. Den flowcytometrisk profilen av pigg prøven ble brukt til å lede positivitet gating. FACS data ble videre analysert med FlowJo programvare.
Fluorescens Imaging
Farget celler isolert med FACS sorter på lysbilder ble utsatt for både fluorescens bildebehandling og nær infrarød avbildning med vår tidligere rapportert prosedyre [19] , [20], [22], med et Nikon Eclipse Ti fluorescensmikroskop eksitert med en xenon-bue lyskilde. Nær infrarøde bilder ble ervervet gjennom et indo filter (780-840 nm).
Multiple Quantum Dot Merking (mQDL)
fargede celler samles med FACS sorter på objektglass ble utsatt for ytterligere farging med mQDL protokollen som tidligere rapportert [22]. I korte trekk, ble prøvene først behandlet med strippebuffer for å fjerne mAb anvendt for CTC isolasjon, og deretter underkastet etterfølgende farging med antistoffer som reagerer på en gruppe av PCa-relaterte biomarkører, inkludert RANKL, HIF-1α, NRP-1, VEGF , pc-MET, og p-p65, som tidligere rapportert [22], med den samme farging protokoll. Til slutt ble prøvene kontra med DAPI før de blir utsatt for spektral avbildning og signal kvantifisering på CRI spektral avbildning system med Nuance programvare (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).
Statistical Analysis
midler standardavvik og median ble brukt til å oppsummere kontinuerlige variabler. Frekvenser og prosenter ble beregnet for kategoriske variabler. Spearman korrelasjon ble beregnet mellom kontinuerlige variabler i dataene på grunn av skjeve fordelinger. Sammenligninger av levende CTC mellom kategorier av interesse ble gjort ved hjelp av Wilcoxon Rank Sum tester. En lineær blandet modellen ble brukt for å vurdere forholdet mellom antall celler piggete og hentet frem, hvor de gjentatte målinger på de donorer ble modellert med en heterogen forbindelse symmetrisk kovarians struktur. Alle analyser ble gjort ved hjelp av SAS versjon 9.3.
Resultater
Vi har tidligere demonstrert aktivt opptak og oppbevaring av NIR fargestoffer av dyrkede humane PCa LNCaP, c4-2, PC-3, DU-145 , ARCaP
E og ARCaP
M celler [19], [20]. Så få som ti PC-3-celler tilsatt i 1 ml humant donorblod kan påvises ved hjelp av IR-783. Døde PC-3 celler piggete på samme måte ikke klarte å stille ut noen IR-783 opptaket. På grunn opptak av IR-783 krever bruk av en ATP-krever organisk anion transporter, fargestoff opptak i seg selv er en funksjonell analyse som peker mot tumor cellelevedyktighet. For å vurdere anvendeligheten av denne tilnærmingen til å påvise levende CTCs i pasientblodprøver, innlemmet vi NIR fargestoff flekker i FACS analyse. Den brukte EpCAM
+ CD45
-profile [9], [12] ble vedtatt å konsolidere CTC natur oppdaget NIR
+ celler.
1. Identifisering og Isolering av Levende (NIR
+) Celler fra humant blod
Pasientblodprøver ble utsatt for sentrifugering deretter sekvensiell farging: først med NIR fargestoff for å farge levende CTCs, deretter med fluorescens-merket antistoffer mot EpCAM og CD45 for bekreftelse. Til slutt ble prøven farget med DAPI for visualisering av cellekjerner.
Som en kontroll for å kalibrere resultatene av deteksjonssystem, må vi først testet farging protokollen med frisk donor blod tilsatt PC-3 celler på varierende antall. I FACS analyse ble farget prøvene sortert å isolere EpCAM
+ CD45
– befolkning. Disse cellene ble så tydd til å bestemme antall NIR
+ DAPI
+ celler (figur 1A). PC-3 celler ble identifisert som kjerneholdige celler (DAPI
+) som uttrykker EpCAM men ikke CD45 (figur S1). I gjentatte tester når den endelige EpCAM
+ CD45
-NIR
+ DAPI
+ tellinger ble modellert som en funksjon av pigg celle nummer, en vesentlig økende trend ble observert med en korrelasjonskoeffisient på 0,997 ( Figur 1B og tabell S1). Den svært lineær korrelasjon foreslått at dette FACS-protokollen var brukbare for deteksjon av CTCs med et ubetydelig antall av ikke-spesifikke tellinger. Vi videre fastslått at de gjen PC-3 celler på objektglass kan lett sees ved fluorescens mikroskopi (figur 1C). Ved å bruke samme protokoll, vi har oppdaget 2,8 ± 1,7 EpCAM
+ CD45
-NIR
+ DAPI
+ hendelser i en rekke studier med blodprøver samlet inn fra 34 friske donor fag (Figur 1b). Denne oppdagelse var godt i samsvar med andre studier på EpCAM
+ celler hos friske donor blodprøver analysert ved hjelp av neste generasjons CTC plattformer [23], og sannsynligvis reflekterer bakgrunnsnivået av sirkulerende epitelceller. Viktigere, i parallelle studier der døde PC-3 celler ble brukt i spiking, den EpCAM
+ CD45
-NIR
+ DAPI
+ tellinger ble opprettholdt på bakgrunnsnivået, noe som tyder på at den piggete døde PC-3 celler ikke plukke opp fargestoff (data ikke vist). Disse kontrollstudier kollektivt demonstrere egnethet NIR fargestoff å farge og oppdage levende CTCs.
Menneskelig PCA PC-3 celler ble brukt som positive kontrollceller. A, PC-3-celler farget i rekkefølge med alle fire deteksjonsmidler ble underkastet FACS-analyse. Øvre panel: prøven ble først oppdaget for positiv EpCAM (FITC), men negativ CD45 (PE) flekk (gated fraksjon). Nedre panel: gated fraksjonen ble spurt for IR-783 (NIR) og kjernekraft (DAPI) flekken. NIR
+ EpCAM
+ DAPI
+ CD45
– tellinger ble betraktet som levende kreftceller. PC-3-påvisning ble anvendt i parallell i analyse av hvert klinisk prøve som veiledning i gate omgivelser. B, Effektivitet av deteksjons strategien ble vurdert ved å sammenligne antallet av piggete og detektert PC-3-celler ved FACS-analyse. Hvert datapunkt var gjennomsnittet av detekterte PC-3-celler piggete til 6 friske donorprøver. C, fluorescens mikroskopi ble anvendt for å visualisere PC-3-celler utvunnet på en glass-slide. Øverste raden viser bilder av en representant felt ved lav forstørrelse (40 ×; bar = 250 mikrometer), med to celler (merket med 1 og 2) er presentert ved høy forstørrelse i de to nederste radene (400 ×; bar = 25 mikrometer) .
2. Påvisning av Levende CTCs i pasienter med lokal PCa gjennomgår radikal prostatektomi
Bruke funksjonell FACS analysen følgende NIR flekker, vi testet påvisning av EpCAM
+ CD45
-DAPI
+ celler, fra nå av referert til som
totale
CTCs, i kliniske pasienter PCA med vekt på EpCAM
+ CD45
-NIR
+ DAPI
+ arrangementer (fra nå av kalt
leve
eller
NIR
+
CTCs). PBMC ble isolert fra preoperative blodprøver fra 40 pasienter som er diagnostisert med lokaliserte sykdommer. Detaljerte egenskapene til disse pasientene er oppsummert i tabell 1.
Denne serien av analyse viste at levende CTC teller variert bemerkelsesverdig blant pasientene. EpCAM
+ CD45
-NIR
+ DAPI
+ teller varierte fra 0 til 439 celler /ml (gjennomsnitt 25 celler /ml; median 10 celler /ml) for denne gruppen av perioperative pasienter (tabell 1). I denne studien ble en telling på mindre enn fem anses normalt, som vår frisk donor pool hadde 2,8 ± 1,7 EpCAM
+ CD45
-NIR
+ DAPI
+ tellinger (figur 1B). Den fargemetoden reproduserbart oppdaget at mer enn 5 live CTCs /ml i 30 av de 40 pasientene. Representative resultater fra strømningscytometrisk deteksjon er vist i figur 2A. Vi har videre demonstrert at CTCs kunne isoleres direkte på objektglass, og kan bli visualisert med fluorescens mikroskopi (figur 2B). I disse analysene, levende CTCs var skilles fra døde celler basert på opptak av NIR fargestoff (figur 2B).
Representative deteksjonsresultater vises. A, øvre raden viser CTC deteksjon fra pasient 6, hvor 10 live CTCs ble funnet. Nederste raden viser deteksjon av 148 levende CTCs fra pasient 14. For hver prøve, ble gate innstillingen regissert av parallell farging av PC-3 celler. B, CTCs oppdaget fra pasient 14 ble isolert på et objektglass og visualisert umiddelbart av fluorescens bildebehandling. Lav forstørrelse bilder av en representant feltet (40 ×; bar = 250 nm) er vist i den øverste raden. Nedenfor er høy forstørrelse bilder av 2 live CTCs (NIR
+) fra samme felt som vises i de neste to rader, i forhold til 2 død CTCs (NIR
-) i de to siste radene (400 ×; bar = 25 mikrometer).
Det levende CTC teller oppdaget fra denne kohorten korrelerte ikke signifikant med preoperativ serum PSA nivå (r = 0,12,
p
= 0,47, figur S2), patologisk N-stage (gitt bare en node-positiv pasient), Gleason score, eller margin status (Figur S3). Sammenligning CTC teller til Stephenson prediktiv monogram, var det ingen statistisk signifikant sammenheng mellom levende CTC teller og Stephenson prediktiv monogram.
Det var 10 pasienter med 5 eller færre levende CTCs /ml (tabell 1), og alle hadde T2 sykdom med negative kirurgiske marginer. Kun en av disse pasientene (pasient 26) hadde et detekterbart serum PSA konsentrasjon 2 uker etter radikal prostatektomi. Hans serum PSA ble umulig å oppdage ved 6 uker etter operasjonen. Pasienten har siden vært tilbakefall-free. Det var 3 pasienter med positive kirurgiske marginer (pasienter 2, 13 og 25, Tabell 1). Disse pasientene har også vært tilbakefall-fri for mer enn to år så langt uten ekstra anti-kreft terapier.
Det var 3 pasienter hadde påvisbare serum PSA-konsentrasjonen innen 3 måneder etter radikal prostatektomi (tab 1). Pasient 26 hadde en pT2cN0 Gleason 3 + 3 kreft med negative marginer. Interessant, hadde han bare tre levende CTCs /ml blod. Serum PSA i denne pasient ble umulig å oppdage senere uten ekstra intervensjon. Pasient 29 hadde en pT3aN0 Gleason 4 + 5 kreft med positive marginer, og ble oppdaget med 46 levende CTCs /ml. Hans serum PSA nivå ble umulig å oppdage etter 6 måneders androgen deprivasjon terapi som fortsetter til denne gangen. Pasient 39 hadde lymfeknutemetastase ved tidspunktet for kirurgi og ble funnet å ha høye preoperative CTC tellinger (439 /ml). Andre tilfeller av tilbakefall må undersøkes for å fastslå om pre-drift CTC tellinger kan brukes som en parameter for å forutsi sykdom tilbakefall.
Vi har også sammenlignet levende CTC teller til kirurgisk margin status. De 25 pasientene med negative marginer hadde et gjennomsnitt på 25 live-CTCs /ml (range 0-148), sammenlignet med 15 pasienter med positive marginer som hadde et gjennomsnitt på 54 live-CTCs /ml (variasjonsbredde 2-439). Forskjellen var ikke statistisk signifikant, trolig på grunn av stor variasjon mellom individer og den begrensede utvalgsstørrelsen.
Mens de fleste av pasientene i vår kohort hadde Gleason 6 eller 7 patologi, ble ingen sammenheng finnes mellom Gleason score og leve CTC tall. På den annen side, pasienter med høyere levende CTC teller tendert mot å ha mer avansert sykdom ved svulst staging. Det var en signifikant sammenheng mellom levende CTC teller og T scenen, med PT3 pasienter med høyere nivåer enn PT2 tilfeller (median 8 vs 19,
p
= 0,02). Spesielt, den eneste pasient med node-positive PN1 sykdom hadde den høyeste levende CTC teller (439 CTCs /ml pasient 39, tabell 1). Høye levende CTC teller, derfor virket korrelert til avanserte kreft stadier.
3. Vurdering av Levende CTCs i pasienter med metastatisk Sykdommer
sammenhengende blodprøver ble innhentet fra 5 PCA pasienter som har sykdommen hadde tilbakefall og spredning etter første behandling. Disse pasientene ble gjennomgår forskjellige typer systemisk behandling. I motsetning til live og total CTC teller hos pasienter med lokalisert sykdom, større ulikhet mellom totale og bor CTC tellinger ble sett (tabell 2), mens CTC teller over tilfeller viste liten sammenheng til serum PSA konsentrasjon (figur 3). Likevel, når analyseres over tid for den enkelte pasient, vi identifisert interessante trender som lever CTC teller så ut til å korrelere omvendt til den observerte kliniske fordeler i respons til behandlinger.
CTC teller oppdaget fra mCRPC pasienter ble analysert sammen med fremdriften av terapeutisk intervensjon. To representative resultatene vises. A, den progressive tilveksten av CTC teller i pasient 41 korrelert med klinisk metastatisk progresjon. B, den vedvarende lav CTC teller i pasient 42 korrelert med gunstige anticancer behandling.
Pasient 41 begynte bikalutamid behandling ved starten av prøveinnsamling for metastatisk kastrering-resistente PCa (mCRPC). Han opplevde asymptomatisk biokjemisk (
dvs., Etter serum PSA) progresjon i to måneder, hvor leve CTC teller i utgangspunktet gått ned, men opp igjen raskt. Behandlingen ble endret til abirateron acetat, som mislyktes i å fremstille en biokjemisk reaksjon. Pasienten utviklet symptomatisk ossøs metastatisk sykdom og nødvendig strålebehandling. Under sykdomsprogresjon, ble total CTC teller vedvarende, men live CTC andelen økt sammen med serum PSA nivå (tabell 2 og figur 3A).
Pasient 42 ble utsatt for CTC deteksjon før den første syklusen av docetaxel terapi, noe som resulterte i en utmerket respons bedømt av fortsatt fall i serum PSA nivå også etter at behandlingen ble avsluttet. Pasienten forble symptomfri i ytterligere 4 måneder før du trenger å foreta ytterligere 8 sykluser med docetaxel for symptomatisk progresjon. I løpet av behandlingen, pasientens CTC tellinger avtatt betydelig, fra 82 ned til 6, og levende CTCs redusert tilsvarende, 37-0%. Denne pasienten opplevde en oppsving i totalt og levende CTCs løpet av docetaxel behandling fra dag 20 til dag-139. Mot slutten av docetaxel behandling (fra dag 102 til dag-139), observerte vi levende CTCs rebounding 14-94% (tabell 2 og figur 3B).
Pasient 43 opprinnelig fikk docetaxel terapi som han vises innledende biokjemiske og kliniske reaksjoner. Den andre syklus av docetaxel behandling, men ble etterfulgt av en rask sykdomsprogresjon med progressiv klinisk forverring (
vil si.
, Forverring smerter og vekttap) og en økning i serum PSA. Vi merket en dramatisk økning i andelen av levende CTCs (fra 2% til 97%) uten vesentlige endringer av totalt CTCs (varierte 36-44). Pasienten utløpt i løpet av de neste 2 måneder med rask klinisk forverring. Det levende CTC teller steg markert sammen med forverring (tabell 2).
Pasient 44 ble behandlet med bikalutamid for mCRPC. Behandlingen førte ikke til biokjemisk fordel, men en steil fall i CTC teller 1052-54 ble notert. Til tross for dette dramatisk nedgang i total CTCs imidlertid prosentandelen av levende CTCs endret seg ikke vesentlig forblir i størrelsesorden på 63 88%. CTC teller steg 54-196 mellom dag-25 til dag-73 på den tiden da bikalutamid behandlingen ble avsluttet. Denne pasienten nødvendig palliativ strålebehandling og et kvaternært hormonell manøver (tabell 2).
Pasient 45 hadde kastrering følsom PCa og ble underkastet intermitterende androgen undertrykkelse terapi som var blitt initiert 4 måneder før den første CTC deteksjon. Levende CTC telling var under grensen for deteksjon, i god avtale med godt undertrykt serum PSA konsentrasjon (tabell 2). I dette tilfellet, den påfølgende økning av levende CTC teller var 4 måneder tidligere enn PSA rebound, som senere ble undertrykt med androgen deprivasjon. Det er verdt å merke seg imidlertid at denne pasienten hadde en høy prosentandel av levende CTCs (83-84%) til tross for hormonell undertrykkelse terapi.
4. Isolering av Levende CTCs for ytterligere molekylær karakterisering
NIR flekker lettere identifisering og isolering av levende CTCs fra kliniske blodprøver (figur 2). Vi testet de isolerte CTCs å ytterligere undersøke PCA- relatert molekylære endringer. I en slik undersøkelse, ble CTCs i PCA pasienter isolert basert på EpCAM
+ CD45
-NIR
+ DAPI
+ farging. Protein uttrykk i CTCs ble oppdaget av mQDL og ble utført for å bekrefte uttrykk for et panel av protein biomarkører knyttet til PCa progresjon og metastase at vår gruppe er aktivt studerer [22]. Disse analyser viste at unormal ekspresjon av RANKL, HIF-1α, NRP-1, og VEGF-proteiner sett i kliniske PCA vevsprøver [22] kan lett påvises i de isolerte CTCs (figur 4A). Tilsvarende kliniske tumorer, økt fosforylering av c-Met, i tillegg til p65 subenheten av NFkB, ble påvist i den samme CTC populasjon. Forbløffende nok signal kvantifisering av de fargede CTCs avdekket bemerkelsesverdig inter heterogenitet, som individuelle proteiner ble detektert med varierte nivåer mellom CTCs (figur 4B). Videre undersøkelser, men er nødvendig for å vurdere omfanget av CTC heterogenitet i genuttrykk nivå.
Levende CTCs fra den første prøven fra pasient 44 (tabell 2) ble isolert på et objektglass og utsatt for mQDL flekker for statusen til et panel av proteiner dokumentert å forholde seg til PCa progresjon. A, Spectral bilder fra to representative CTCs vises på de to øverste panelene (8 bilder hver som representerer uttrykket nivået av RANKL, pc-Met, HIF-1α, pp65, NRP-en og VEGF, 400 ×; bar = 50 mikrometer ). B, Kvantifisering av spektrale bildeintensitetene av de seks proteiner indikert i panel A i fem fargede celler fra den samme pasient. Den relative nivået av genuttrykk ble beregnet basert på uttrykk for HIF-1α som ble tildelt som 1,0.
Diskusjoner
Vi har utviklet en protokoll for å vurdere tilstedeværelse av levende CTCs basert på det aktive opptak av prototype IR-783 heptamethine carbocyanine fargestoff [19], [20]. I kombinasjon med antistoffer mot EpCAM, IR-783-farging identifiserte levende humane PC-3-celler tilsatt i frisk donor blod med høy reproduserbarhet og korrelasjonskoeffisienten (figur 1). Vi har fastslått at aktiv transport av IR-783 inn i tumorcellene kan brukes som et funksjonelt assay for å påvise tumorcellelevedyktighet (figur 2B). Dette funnet understrekes ytterligere av mangel på IR-783 fargestoff opptak i døde tumorceller (fryse-tine og /eller etanol fast) tilsatt i frisk donor blod (data ikke vist). Vi hell oppdaget og isolert levende CTCs fra kliniske prøver av primær PCa (figur 2 og tabell 1) og mCRPC pasienter (figur 3 og tabell 2). I en proof-of-concept studie, de isolerte levende CTCs var mottagelig for multiplex påvisning av protein nivåer på celle-nivå i nylig isolerte CTCs bruker en mQDL metode (figur 4). Resultatene tyder på at kollektivt: 1) IR-783 farging kan skille levende CTCs fra en total nummerert CTC populasjonen i en gitt pasient i sann tid; 2) Korrelasjon mellom andelen av levende CTCs og utvikling av progressiv og terapeutisk-resistent sykdom kan etableres; og 3) Isolerte CTCs er egnet for biologisk analyse som mQDL analyser for protein ekspresjon på celle-nivået.
