Abstract
miRNA nivåer endres i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDA), den vanligste og dødelig bukspyttkjertelen malignitet, og intakt miRNA behandling er avgjørende for avstamning spesifikasjon under bukspyttkjertelen utvikling. Imidlertid er rollen til miRNA behandling i PDA ikke blitt utforsket. Her studerer vi betydningen av miRNA biogenesis i PDA utvikling ved å slette miRNA behandling enzymet Dicer i en PDA musemodell drevet av onkogene Kras. Vi finner at tap av dicer akselererer Kras drevet acinar dedifferentiation og acinar å Ductal metaplasi (ADM), en prosess som har vist seg å gå foran og fremme spesifikasjon av PDA forløpere. Imidlertid viser ubegrenset ADM også høye nivåer av apoptose. Dicer tap ikke akselerere utviklingen av Kras drevet PDA forløpere eller PDA, men overraskende, vi observere at musen PDA kan utvikle seg uten dicer, selv på bekostning av proliferativ kapasitet. Våre data tyder på at intakte miRNA behandling er involvert i både begrensende pro-tumorigene endringer i bukspyttkjertelen differensiering samt opprettholde levedyktighet under PDA initiering
Citation. Morris JP IV, Greer R, Russ HA, von Figura G, Kim GE, Busch A, et al. (2014) dicer Regulerer Differensiering og levedyktighet under Mouse Bukspyttkjertelkreft Innvielse. PLoS ONE 9 (5): e95486. doi: 10,1371 /journal.pone.0095486
Redaktør: Murray Korc, Indiana University School of Medicine, USA
mottatt: 03.01.2014; Godkjent: 26 mars 2014; Publisert: 01.05.2014
Copyright: © 2014 Morris et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Work in Matthias Hebrok konsern ble støttet av en bevilgning fra AACR Bukspyttkjertelkreft kreft~~POS=HEADCOMP Action Network. www.pancan.org. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDA) ser ut til å utvikle seg gjennom en serie av ductal forstadier, inkludert den vanligste typen, bukspyttkjertel intraepitelial neoplasi (Panin). Begge PanINs og PDA-utstillingen Kras mutasjoner, som kan være en innledende hendelsen. Musemodeller støtter denne oppfatningen som målrettet og vedvarende uttrykk for mutante Kras i musen bukspyttkjertelen epitel både rekapitulerer den Panin til PDA sekvens observert hos mennesker, og er nødvendig for sykdom vedlikehold [1], [2], [3]. Bevis fra musemodeller viser at mutant Kras kan bidra til PDA initiering ved reprogrammering akinærceller inn i en kanal som avstamning stand til å bli PanINs via en prosess kalt acinar til ductal metaplasi (ADM) [4], [5], [6]. Denne evnen til å endre bukspyttkjertelen plastisitet kan være et viktig skritt i PDA initiering, som akinærceller har vist seg å være dramatisk mer følsomme for Kras avhengig Panin utvikling i forhold til kanalsystem celler [7]. Siden forsøk på direkte hemming av onkogene Kras har vært generelt mislykket [8], definere kritiske formidlere av pro-tumorigent differensiering og levedyktighet nedstrøms mutant Kras kan representere alternative terapeutiske tilnærminger.
microRNAs (mirnas) er en klasse av små, ikke-kodende RNA som regulerer genuttrykk post-transcriptionally. Aberrant miRNA nivåer er assosiert med tumorutvikling, og føre til upassende ekspresjon av onkogener og tumor-suppressorer [9]. Kreft assosiert miRNA nivåer resultat av misexpression av spesifikke mirnas samt deregulering av miRNA biogenese veien [10]. mirnas er generelt nedregulert i humane cancere [11], og inhiberte miRNA behandling fremmer tumorigenesis [12]. Imidlertid kan tap av miRNA behandling være uforenlig med utvikling av noen svulster [13], [14], [15], noe som tyder på at kritiske terskler av miRNA behandling kan være involvert i å opprettholde levedyktighet under transformasjon. Mens mirnas er feilekspriraert i PanINs og PDA, og er kjent for å regulere trasé som bidrar til PDA initiering og progresjon [16], [17], [18], [19], rollen som miRNA behandling spiller i PDA utvikling har ikke vært undersøkt.
Ved å slette miRNA-behandling enzymet Dicer i en Kras drevet musemodell for PDA, finner vi at miRNA behandling regulerer både differensiering og levedyktighet under Kras drevet bukspyttkjertelen transformasjon. Dicer sletting fremmer Kras drevet tap av acinar identitet og ADM men også resulterer i økte nivåer av apoptose og redusert uttrykk av gener involvert i å opprettholde levedyktighet under Panin utvikling og PDA. Overraskende nok finner vi at musen PDA kan utvikle seg i fravær av dicer, selv med redusert spredning. Til sammen tyder dette arbeidet en avgjørende rolle for miRNA behandling i Kras drevet PDA innvielse.
Resultater
dicer Loss Akselererer Kras Driven Ductal Metaplasi
dicer sletting i tidlige bukspyttkjertelen stamfedre resultatene i bukspyttkjertelen agenesis og post-natal død [20]. Derfor har vi testet om en distinkt Pdx1 drevet Cre belastning,
Pdx1-Cre
Late
, tillates bukspyttkjertelen utvikling i innstillingen for tap av dicer funksjon.
Pdx1-Cre
Late
resulterer i forsinket utviklingsaktivitet i forhold til Pdx1-Cre sjåfør ansatt av Lynn
et al
, noe som resulterer i rekombinasjon i et mer begrenset sett av voksne celler, spesielt de fleste acini, noen endokrine celler, og sjelden i kanal celler [21]. Tyder timekrav for dicer i bukspyttkjertelen utvikling,
Pdx1-Cre
Late; Dicer
FLOX /FLOX product: (
dicer
Homo
) mus blomstret og vises grovt normal bukspyttkjertelen utvikling ved p0 selv i sammenheng med betydelig redusert dicer uttrykk i forhold til kontroll
Pdx1- Cre
Late; Dicer
FLOX /+
mus (
dicer
Het
) (figur S1 A, B, E).
Ved 3 ukers alder, acini, kanaler, og holmer var gjenkjennelig i
dicer
Homo
mus (Figur 1a), selv om det var noen eksokrine områder med redusert eosin farging. Immunfluorescens viste normalfordeling av acinar markør amylase, duct markør CK19, og β-cellemarkør insulin (figur 1B). Exocrine morfologi var forstyrret skjønt, som vi ofte finner uorganisert acini med små, fragmenterte celler ikke påvist i kontroller (figur 1B, Figur S2), tilsvarende uorganiserte akinærceller observert i somatiske dicer hypomorphs [22]. Bukspyttkjertelen masse i
dicer
Homo
musene ble også redusert (figur 1D) i innstillingen av redusert dicer uttrykk (figur 1C). Til tross for endringer i morfologi, hadde vi ikke observere celler samtidig uttrykker amylase og forhøyede nivåer av CK19 som observert i akinærceller gjennomgår Kras drevet ADM (figur S3), noe som tyder på at de uorganiserte akinærceller ikke var aktivt under ADM.
(A). Hematoxylin og eosin (H E) farging av tre uker gammel bukspyttkjertel fra
dicer
Het Kjøpe og
dicer
Homo
mus. (A) acini, (D) kanalsystem, og (I) holmer. Scale bar 100 mikrometer. (B) immunfluorescens for amylase (rød), CK19 (grønn) og insulin (blå) i tre uker gammel
dicer
Het Hotell og
dicer
Homo
mus. Scale bar 100 mikrometer. (C). Redusert dicer uttrykk på 3 uker i RNA ekstrahert fra bukspyttkjertelen vev av indikert genotyper. Mean ± SD, n = 3. (D). Pancreas masse: kroppsvekt ratio på 3 uker i de angitte genotypene. P-verdier er beregnet ut fra to-tailed, uparede t-tester sammenligner
dicer
Het Kjøpe og indikerte genotyper. (Mean ± SD,
dicer
Het
n = 17,
dicer
Homo
n = 14,
Kras; dicer
Het n = 9, Kras ; dicer
Homo
n = 14). (E). H E farging av tre uker gammel
Kras; Dicer
Het Hotell og
Kras; Dicer
Homo
mus. Innfellinger: E-venstre, Rare fokus for metaplasi og Panin; rett, ductal metaplasi i
Kras; Dicer
Homo
mus. Scale bar 100 mikrometer. (F) Immunhistokjemi for Amylase, Sox9, CK19 i 3 uker gammel
Kras; Dicer
Het Hotell og
Kras; Dicer
Homo
mus. Scale bar 100 mikrometer
For å teste effekten av dicer tap på Kras drevet bukspyttkjertelen transformasjon, vi genererte
Pdx1-Cre
Late.; LSL-Kras
G12D; Dicer
FLOX /FLOX product: (
Kras; dicer
Homo
) mus. I likhet med andre modeller rettet mot mutant Kras til embryonale bukspyttkjertelen,
Pdx1-Cre
Late; LSL-Kras
G12D
mus gradvis utvikle ADM samt PanINs, med PDA som oppstår hos noen dyr etter lang ventetid [23]. I likhet med slike modeller [1], ved 3 ukers alder, bukspyttkjertel masse i
Pdx1-Cre
Late; LSL-Kras
G12D; Dicer
FLOX /+ product: (
Kras; dicer
Het
) mus ble litt, men betydelig, økt sammenlignet med
dicer
Het
mus (figur 1D ). Eksokrin rommet i
Kras; Dicer
Het
mus dukket grovt normal, hovedsakelig bestående av amylase positive akinærceller, med sjeldne områder av amylase negativ ADM og lav karakter PanINs uttrykker moderat til høye nivåer av CK19 og Sox9 (figur 1F), ductal /bukspyttkjertelen embryonale progenitor markører karakteristisk for Kras drevet ADM og Panin formasjon [6]. I kontrast,
Kras; Dicer
Homo
pankreata vises redusert dicer uttrykk (figur 1C), var atrofisk (figur 1D), og besatt utbredt utskifting av eksokrin rommet med metaplastiske kanalstrukturer som ligner sjelden ADM i
Kras; Dicer
Het
mus (figur 1E). Ductal metaplasi i
Kras; Dicer
Homo
mus viste redusert uttrykk av amylase, lav til moderat uttrykk for CK19, og sterke uttrykk for Sox9 (figur 1F). Sox9 akkumulering ble også observert i strukturer beholde noen acinar morfologi (figur 1F). Ductal metaplasi ble ikke observert ved p0 i
Kras; Dicer
Homo
mus (Figur S1D), noe som tyder på at dicer mangel i sammenheng med mutant Kras ikke blokkerer embryonale acinar utvikling, og ADM oppstår mellom fødsel og 3 ukers alder. Derfor dicer tap i forbindelse med mutant Kras dramatisk akselererer ADM, en prosess som har vist seg å både forut for og markeds Kras drevet Panins formasjon [4], [6], [24].
dicer Loss kompromisser acinar identitet og Fremmer Kras Driven acinar å Ductal Omprogrammering
for å undersøke hvorfor
Kras; Dicer
Homo
mus gjennomgår akselerert Kras drevet ADM, spurte vi om dicer mangel akinærceller feilaktig vise egenskaper knyttet til ADM som markører for acinar stress og tap av acinar identitet. Å fokusere på celler som hadde gjennomgått Cre rekombinasjon vi inkludert en Cre induserbar YFP allel uttrykt betinget fra Rosa26 locus (
R26-EYFP
). YFP flekker avslørte at både eksokrin rommet i
Pdx1-Cre
Late; Dicer
FLOX /FLOX; R26-EYFP product: (
dicer
Homo; YFP
) mus og ADM i
Pdx1-Cre
Late; LSL-Kras
G12D; Dicer
FLOX /FLOX; R26-EYFP product: (
Kras; dicer
Homo; YFP
) mus avledet fra celler der Cre var aktiv, og ikke fra utvidelse av en un-saman befolkningen (figur 2B, D).
(A-D) Clusterin (blå) og YFP (grønn) flekker i tre uker gammel
dicer
Het; YFP product: (A),
dicer
Homo; YFP product: (B),
Kras; Dicer
Het; YFP product: (C), og
Kras; Dicer
Homo; YFP
mus (D). Scale bar 100 mikrometer (E) RT-PCR analyse av dicer, miRNA-141 og 216b (til venstre), acinar beriket gener Amylase og Mist1 (i midten), og kanal beriket gener CK19 og Sox9 (til høyre) av YFP +, CD49f +, CD133- celler fra
dicer
Het; YFP product: (n = 4),
dicer
Homo; YFP product: (n = 4),
Kras; Dicer
Het; YFP product: (n = 3), og
Kras; Dicer
Homo; YFP product: (n = 3) mus. Mean ± SD. P-verdiene er beregnet fra to-tailed, uparede t-tester sammenligner
dicer
Het Hotell og
dicer
Hom °
CK19 og Sox9 uttrykk verdier.
for å finne ut om dicer tap førte til acinar stress forbundet med ADM, undersøkte vi uttrykk for Clusterin, en markør for stresset, de differensiert acini [6], [25]. Clusterin var hovedsakelig fraværende i YFP + akinærceller av kontroll
dicer
Het; YFP Hotell og
Kras; Dicer
Het; YFP
mus, men var til stede i sjeldne YFP + ADM i
Kras; Dicer
Het; YFP
dyr (figur 2A, C). Tyder på at dicer manglende celler er under stress observert i ADM, Clusterin var ikke bare jevnt observert i YFP + ADM i
Kras; Dicer
Homo; YFP
mus, men også mye uttrykt i YFP + akinærceller i
dicer
Homo; YFP
dyr (figur 2B, D).
For å teste om acinar stresset korresponderte med redusert acinar identitet, endret vi en sorterings protokoll tidligere utviklet for isolering av bukspyttkjertelen stamfedre [26] for å spesifikt skille differensiert acinar og ductal celler. Vi fant ut at i den voksne bukspyttkjertelen, voksen acini og kanaler uttrykke epitel markør CD49f, mens differensierte kanaler også uttrykke CD133 (figur S4B, C). RT-PCR for
Amylase Hotell og
Mist1
, og
CK19 Hotell og
Sox9
, beriket i acinar og kanalsystem celler, henholdsvis avslørt at sortering baserte på CD49f og CD133 tillatt for effektiv separasjon av disse populasjonene (figur S4A, 4D). Expression of Notch effektorer Hes1, Hey1, og hey2, begrenset til centroacinar og terminalkanalsystem celler i den voksne bukspyttkjertelen [27], så ut til å skille med CD49f + CD133 + duct befolkningen (figur S4E).
YFP +, CD49f + CD133- celler ble sortert fra alle 4 genotyper. Ved 3 ukers alder dicer nivåer og uttrykk av 2 rikelig uttrykt mirnas ble betydelig redusert i celler sortert fra
dicer
Homo; YFP Hotell og
Kras; Dicer
Homo; YFP
mus sammenlignet med kontroller med og uten Kras (figur 2E venstre). For å bestemme effekten av dicer tap på eksokrin differensiering, analyserte vi uttrykk for acinar markører Amylase og Mist1 og kanal markører CK19 og Sox9, i YFP +, CD49f + CD133- celler. Sortert celler fra
dicer
Homo; YFP
mus vises betydelig redusert uttrykk for
Amylase Hotell og beskjedent redusert
Mist1
sammenlignet med celler fra
dicer
Het; YFP
mus (Figur 2E midten). Selv om uttrykket av markører for acinar differensiering ble redusert, gjorde vi ikke observere en jevn økning i duktale markører
CK19
eller
Sox9
i disse cellene (Figur 2E høyre), tilsvarende mangel på utbredt CK19 misexpression bemerket i figur 1D. I CD49f + CD133- celler fra
Kras; Dicer
Homo; YFP
mus imidlertid
Amylase Hotell og
Mist1
uttrykk ble ytterligere redusert, og
CK19 Hotell og
Sox9
uttrykk ble økt, sammenlignet med celler . fra alle andre genotyper, i samsvar med histologiske økning i ADM
Interessant, vi også observert en beskjeden, men ikke statistisk signifikant, trend mot reduksjon i Mist1 uttrykk i celler sortert fra
Kras; Dicer
Het; YFP
mus sammenlignet med
dicer
Het; YFP
kontroller, noe som tilsier at mutante Kras alene kan begynne å gå på akkord acinar identitet før induksjon av ductal gener eller morfologi. Samlet tyder dette på data som dicer tap kompromisser acinar identitet og induserer en stresset tilstand som akselererer Kras drevet ductal omprogrammering og ADM.
dicer Loss ikke Accelerate Panin eller PDA Development
Tap av acinar identitet og ADM akselererer Panins utvikling [6], [24], [28], [29] og akselerert ADM og Panins utvikling, fremkalt ved akutt og kronisk pankreatitt for eksempel kan resultere i redusert PDA latens [30], [31] , [32]. Derfor forventet vi å observere raskere Panin og PDA utvikling i
Kras; Dicer
Homo
mus sammenlignet med kontrollgruppen
Kras; Dicer
Het
mus. Til tross for den dramatiske forskjellen i ADM observert ved 3 uker i
Kras; Dicer
Homo
sammenlignet med
Kras; Dicer
Het
mus, kvantifisering av Panin lesjoner i en liten kohort av mus ved 9 uker viste ingen statistisk signifikant forskjell i hyppigheten av Alcian Blå positive duktale lesjoner, noe som tyder på at dicer tap ikke akselerere Panin utvikling (figur 3A , B, C). Langsiktig sykdomsprogresjon også konvergerte uavhengig av betinget dicer status. Vi fant ingen statistisk signifikant forskjell i overlevelse av en liten kohort av alderen
Kras; Dicer
Homo Hotell og
Kras; Dicer
Het
mus (Median overlevelse 336 versus 441,5 dager, χ
2 = 0,2271, p = 0,6637, beregnes ved hjelp av Logrank test) (figur 3F). 6/7 av
Kras; Dicer
Het
mus utviklet lokalt eller allment invasiv PDA som ble generelt moderat differensiert, men inkludert en udifferensiert kreft. 4 av 6
Kras; Dicer
Homo
musene moderat differensiert, lokalt eller allment invasiv, PDA med tilsvarende frekvens av metastasering og cellulær morfologi (Figur 3D, E, tabell S1).
(A-B) Representant Alcian blå flekker på 9 uker i
Kras; Dicer
Het product: (A) og
Kras; Dicer
Homo
mus (B). f: fett. Scale bar 100 mikrometer. C, Kvantifisering av Alcian blått positive lesjoner av 9 uker gammel
Kras; Dicer
Het Hotell og
Kras; Dicer
Homo
mus. Linjene indikerer midler. P-verdi beregnet ut fra en to-tailed, uparet t-test. (D, E) Representant histologi av PDA fra
Kras; Dicer
Het product: (D) og
Kras; Dicer
Homo
mus (E). Scale bar 100 mikrometer. (F) Survival kurve av
Kras; Dicer
Het product: (n = 7) og
Kras; Dicer
Homo product: (n = 6) mus.
dicer slettede cellene har vist seg å bli utkonkurrert av unrecombined celler i andre endoderm avledet organer, i leveren for eksempel [33] , og eliminering av rekombinert celler kan bidra til mangel på forventede forskjellen i sykdomsutviklingen i
Kras; Dicer
Homo
versus
Kras; Dicer
Het
mus. I motsetning til den 3 ukers tidspunktet når normale akinærceller var mye mindre hyppig i
Kras; Dicer
Homo
versus
Kras; Dicer
Het
mus, store områder med normal acinar vev ble funnet i Kras; Dicer
H
o
m
o
mus på dette tidspunkt (figur 3A, B). Vi har også bemerket tilstedeværelsen av fett erstatte bukspyttkjertel vev i noen
Kras; Dicer
Homo
dyr (figur 3b). Undersøkelse av vev YFP distribusjon i bukspyttkjertelen av
Kras; Dicer
Het; YFP
versus
Kras; Dicer
Homo; YFP
dyr viste en merkbar nedgang i YFP distribusjon på 9 uker (figur S5), noe som tyder repopulation med celler som ikke hadde gjennomgått rekombinasjon. Derfor, til tross for innledningsvis å fremme ADM som normalt akselererer Panins og PDA utvikling, progresjon PDA-er ikke vesentlig forbedret i fravær av dicer og kan være forbundet med seleksjon mot dicer mangel.
dicer Loss kompromisser Levedyktighet under Kras Driven ADM
dicer tap fører til økt apoptose i en rekke endodermal organer (for eksempel leveren og tarmen [33], [34] for å møte dersom mangelen på spådde akselerasjon av Panin utvikling i
Kras; dicer
Homo
mus kan innebære økt celledød, vi revidert TUNEL + /YFP + celler ved 3 ukers alder i motsetning til de sjeldne doble positive celler i
dicer
Het;. YFP Hotell og
Kras; dicer
Het; YFP
mus,
dicer
Homo;. YFP
mus viste en høyere relativ hastighet på TUNEL + /YFP + celler (figur 4B, E) Videre fant vi en ytterligere økning i doble positive celler i
Kras; dicer
Homo; YFP
mus sammenlignet med
dicer
Het; YFP Hotell og
Kras, dicer
Het; YFP
mus (figur 4D, E). Interessant, dicer tap syntes å synergize med muterte Kras å fremme celledød, som
Kras; Dicer
Homo; YFP
mus viste signifikant mer apoptose enn
dicer
Homo; YFP
celler (Figur 4E). Derfor, mens intakt dicer behandling begrenser Kras drevet acinar til Ductal omprogrammering, noen dicer avhengige signaler kan være nødvendig for å opprettholde levedyktigheten under Kras drevet metaplasi.
(A-D) TUNEL (blå) og YFP (grønn) farging i 3 uker gammel
dicer
Het; YFP product: (A),
dicer
Homo; YFP product: (B),
Kras; Dicer
Het; YFP product: (C), og
Kras; Dicer
Homo; YFP
mus (D). Scale bar 100 mikrometer. E. Kvantifisering av TUNEL + YFP + celler i (A-D). Mean ± SD.
dicer
Het; YFP product: (n = 3),
dicer
Homo; YFP product: (n = 4),
Kras; Dicer
Het; YFP product: (n = 3), og
Kras; Dicer
Homo; YFP
mus (n = 4). P-verdi beregnet ut fra en to-tailed, uparet t-test av tunel + YFP + celler i
dicer
Homo; YFP Hotell og
Kras; Dicer
Homo; YFP
mus. F. acinar beriket og levedyktighet forbundet gener fra uttrykk analyse (til venstre). RT-PCR analyse av Nupr1, Agr2, Itih4, og Reg3b i acinar beriket celler fra
dicer
Het; YFP product: (n = 4),
dicer
Homo; YFP product: (n = 4),
Kras; Dicer
Het; YFP product: (n = 3), og
Kras; Dicer
Homo; YFP product: (n = 3) mus (til høyre). Mean ± SD. P-verdi beregnet ut fra en to-tailed, uparet t-test for sammenligning Agr2 uttrykk i sorterte celler fra
dicer
Het; YFP Hotell og
Kras; Dicer
Het; YFP
mus.
Vi utførte uttrykk analyse til skjermen for dicer avhengige faktorer potensielt involvert i å opprettholde levedyktighet under Kras drevet ADM. For bedre å synkronisere ADM i
Kras; Dicer
Het Hotell og
Kras; Dicer
Homo
mus, benyttet vi caerulein indusert pankreatitt. Som spådd fra tidligere studier [6], caerulein behandling i kontroll, 3 uker gammel
Kras; Dicer
Het
mus førte til utviklingen av kanallignende strukturer 2 dager etter behandling (fig S6a), og omfattende utskiftning av eksokrin rommet med ADM, PanINs, og fibrose, 21 dager etter behandling (fig S6C). Speiling mangel av fremskyndet Panin utvikling mellom 3 og 9 uker i
Kras; Dicer
Homo
mus (Figur 3F), observerte vi mindre metaplasi og betydelig mer normal acinar vev 21 dager etter caerulein behandling i
Kras; Dicer
Homo
mus (Figur S6D). RNA-Seq Analyse av samlet RNA fra FACS isolert YFP +, CD49f +, CD133- akinærceller fra 3 uker gammel
Kras; Dicer
Het; YFP product: (3 mus) og
Kras; Dicer
Homo; YFP product: (5 mus) mus 2 dager etter caerulein (figur S6E) viste ~120 gener signifikant nedregulert mellom mutant og kontroll. Støtte til observasjon at tap av dicer kompromisser acinar differensiering, 42 gener assosiert med terminalt differensierte akinærceller signifikant nedregulert (Figur 4F, Tabell S2, komplett data Tabell S3). Også redusert var gener involvert i å opprettholde levedyktighet under regenerering eller tumorigenesis, inkludert Nupr1 /P8, Agr2, Itih4, og medlemmer av Reg3 protein familien (Figur 4F, Tabell S2). Nylig har både Nupr1 og Agr2 har vist seg å være overuttrykt i løpet av Panins-PDA progresjon og å spille en rolle i utvikling Panins og opprettholde levedyktigheten PDA [35], [36], [37]. Reg3 familie protein ekspresjon blir aktivert i respons til pankreatitt [38], og familiemedlem Reg3b (også kjent som Pap1) spesifikt er implisert i å opprettholde acinar levedyktighet og kan fungere på nedstrømssiden av Nupr1 [39], [40]. Selv om Itih4 ikke har vært implisert i PDA utvikling, har det vist seg å være involvert i å opprettholde levedyktigheten nedstrøms av den kritiske PDA mediator c-myc [41] i en modell av leverkreft [42]. RT-PCR analyse av disse kandidatgener i sortert acini fra tre uker gamle mus viste at deres uttrykk omvendt korrelert med apoptose (figur 4F, høyre). Nupr1, Agr2, Itih4, og Reg3b uttrykk ble redusert i sorterte celler fra
Kras; Dicer
Homo; YFP
mus sammenlignet med kontroll
dicer
Het; YFP Hotell og
Kras; Dicer
Het; YFP
dyr. Også Agr2, Itih4, og Reg3b uttrykk ble redusert i sortert celler fra
dicer
Homo; YFP
mus sammenlignet med kontroller. Interessant, Agr2 ble også betydelig økt i celler sortert fra
Kras; Dicer
Het; YFP
mus sammenlignet med celler fra
dicer
Het; YFP
mus, noe som tyder på at Kras kan bidra til Agr2 oppregulering selv før ADM oppstår. Derfor er dicer uttrykk nødvendig for vedlikehold av modne acinar differensiering staten og for uttrykk av pro-levedyktighet gener under Kras drevet ADM.
Mus PDA kan utvikle seg i fravær av dicer
dicer nivåer har vist seg å være viktige regulatorer av tumordannelse, som virker som en haploinsufficient tumor suppressor i sammenheng med mutant Kras i begge lungesvulster og sarkomer, så vel som i retinoblastom [13], [14]. Imidlertid tumorer i disse modellene synes å resultere fra celler som har beholdt ekspresjon av minst ett unrecombined betinget allel. For å avgjøre om dicer manglende celler var i stand til å bidra til Kras drevet PDA vi testet dicer uttrykk og genomisk rekombinasjon fra 3 PDA cellelinjer generert fra
Kras; Dicer
Het Hotell og
Kras; Dicer
Homo
mus. Ved RT-PCR vi observerte lignende dicer uttrykk i alle tre PDA cellelinjer avledet fra
Kras; Dicer
Het
mus (figur 5A). På grunn av den høye frekvensen av apoptose observert ved 3 ukers alder, den reduserte ekspresjon av gener som støtter Panins utvikling, og mangelen av fremskyndet utvikling av sykdommen, forventet å observere retensjon av minst ett allel i PDA linjer avledet fra
Kras; Dicer
Homo
PDA. Overraskende, fant vi ut at en linje som vises dramatisk redusert dicer uttrykk, mens de to øvrige linjene uttrykt enten en tilsvarende, eller høyere, nivå som
Kras; Dicer
Het
avledet linjer. Allel spesifikk PCR viste at dicer rekombinasjon direkte korrelert med uttrykk (Figur 5B: «Undel», ingen betinget dicer allel rekombinasjon; «Hemi», rekombinasjon av ett allel, «Homo», rekombinasjon av begge alleler). RT-PCR for 3 modne mirnas rapportert å være overuttrykt i human PDA [43], [44] avslørte reduksjon i alle 3 mirnas i homozygot slettet linje til mindre enn 95% av det som uttrykkes i ikke slettet linje (figur 5C) . Derfor Kras drevet PDA i musen ser ut i stand til å unngå negativ seleksjon under sykdom initiering og utvikle seg i fravær av dicer. Som spådd fra modeller som viser at nedregulering, men ikke fullstendig tap av miRNA behandling kan forbedre tumorigenesis [12], [13], den hemizygous slettet linjen vokste raskest, mens homozygot slettet linjen tregeste (figur 5D). Alle 3 cellelinjer var også i stand til å danne svulster når implantert subkutant i immunmangelfulle mus, med kinetikk speiling cellekulturvekstrater (figur 5E). Allel-spesifikk PCR viste at svulster ikke resulterte fra celler som gjennomgikk spontan rekombinasjon (UnDel, Hemi), eller fra en forurensende subpopulasjon av dicer kompetente celler (homo), selv om vi observere nærværet av WT dicer amplikon i tumorer avledet fra Hemi og Homo linjer, en indikasjon på verten stromal rekruttering (figur 5F). Derfor, selv om dicer eliminering svekker levedyktighet i de tidligste stadiene av Kras drevet neoplasi, er tap av dicer ikke gjensidig utelukkende med bukspyttkjertelen transformasjon.
A. Dicer RT-PCR i PDA-cellelinjer generert fra
Kras; Dicer
Het plakater (blå) og
Kras; Dicer
Homo plakater (rød) mus. Hver stolpe representerer data fra 3 uavhengige brønner av hver cellelinje. Mean ± SD. B. PCR påvisning av WT, unrecombined (UNREC), og slettet (DEL) dicer genomisk locus i cellelinjer fra A. Kontrollene er forsterket DNA fra mus embryonale fibroblaster (MEFs) av angitt dicer genotype følgende adenovirus Cre behandling. C. miRNA QPCR for miRNA-16, 107, 191 i cellelinjer avledet fra
Kras; Dicer
Homo
mus. Hver stolpe representerer 3 uavhengige brønner i hver cellelinje. Mean ± SD. D. Vekst av PDA-cellelinjer avledet fra
Kras; Dicer
Homo
mus. Hvert punkt representerer verdier fra 3 uavhengige brønner. Mean ± SD. P-verdi beregnet ut fra en to-halet, uparet t-test for sammenligning av antall celler i 72 timer i kulturer av Undel og homo-celler. E. Subkutan tumorvekst av PDA-cellelinjer avledet fra
Kras; Dicer
Homo
mus. Mean ± SD ved hver endepunktet. Undel (n = 7), Hemi (n = 7), Homo (n = 12). F. PCR påvisning av WT, UNREC, og DEL dicer genomisk locus i subkutane svulster på tidspunktet for offer i E. Kontrollene er dicer
fl
o
x /+ MEFs behandlet med adenovirus Cre som i B. Tumor DNA blir innledet av amplifisering av DNA fra foreldrecellelinjer.
diskusjon
dicer funksjon er viktig for utvikling av flere organer, inkludert endoderm-avledet vev, slik som lever og den gut [33], [34]. Vedlikehold av dicer uttrykk i tidlig Pdx1 positive bukspyttkjertelen stamfedre er nødvendig for utvikling av både bukspyttkjertelen eksokrine og endokrine avdelinger [20]. Her finner vi at dicer funksjon er fortsatt viktig gjennom bukspyttkjertelen utvikling og spiller en rolle i å regulere acinar identitet og levedyktighet. Vår modell benytter en driver linje som initierer dicer rekombinasjon i utviklings bukspyttkjertelen på et senere fosterstadiet enn Cre driveren brukes av Lynn og kolleger [21]. Vi observerer minimal brutto effekter på bukspyttkjertelen utvikling, noe som tyder på scenen sensitive krav til miRNA behandling på å etablere og utvide eksokrine og endokrine stamfedre. Imidlertid akinærceller som utvikler er ustabil både i forhold til sin terminal differensiering og levedyktighet. Elementer av acinar identitet er nedregulert, og stress i cellene og apoptose er både økt. Derfor synes kompetent miRNA behandling for å forbli viktig selv i den modne eksokrin rommet.
Fordi dicer sletting i denne modellen tillater bukspyttkjertelen utvikling vi var i stand til å undersøke hvilken rolle dicer funksjon i Kras mediert PDA utvikling. Musemodeller har vist at onkogene Kras kan fungere som en «master regulator» av PDA utvikling, etablere slektsnavn som kan gi opphav til PanINs og PDA og gjenværende kritisk for progresjon [1], [2], [3]. Betydelig bevis tyder på at akinærceller kan gi opphav til PanINs ved å gjennomgå ADM, en prosess hvor akinærceller tape terminal differensiering på bekostning av en de-differensiert, kanallignende tilstand [4], [5], [6], [7 ]. Kras drevet ADM skjer gradvis, men kan fremskyndes ved at det går acinar differensiering. Fornærmelser som pankreatitt, noe som fører til regenerering forbundet dedifferentiation [6], [45], aktivering av progenitor tilhørende baner (f.eks Notch [24]), og inaktivering av gener som opprettholder den acinar tilstand [28], [29], [46] all dramatisk akselerere Kras drevet ADM og Panin utvikling. Derfor kan tap av acinar identitet være et viktig hinder for Kras avhengig spesifikasjon av acinar avledet PDA forløpere. Våre data tyder på at tap av dicer funksjonen fjerner differensiering barriere for Kras drevet ADM. ADM skjer på 3 uker i
Kras;
