Abstract
Mennesketykktarmskreft (HCT-8) celler viser en stabil overgang fra lav til høy metastatisk tilstand når dyrket på riktig myke underlag (21 kPa). Utgangspunktet epitel (E) i naturen, HCT-8 celler blir avrundet (R) etter syv dager med kultur på mykt underlag. R-celler viser en del av metastatiske kjennetegnene [1]. Her bruker vi gradient stivhet underlag, en bio-MEMS kraftsensor og Coulter Counter-analyser for å studere mechanosensitivity og vedheft av E og R celler. Vi finner at HCT-8 celler miste mechanosensitivity som de gjennomgår E-to-R overgang. HCT-8 R-celler «stivhet, spredt område, proliferasjon og migrasjon blir ufølsomt for substratet stivhet i motsetning til deres epitelial motstykke. De er mykere, proliferativ og vandrende på alle underlag. R-celler viser neglisjerbar celle-celle adhesjon homotypisk, så vel som ikke-spesifikk celle-substrat adhesjon. Følgelig de viser den samme spredt område på alle substrater i motsetning til E-celler. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at R celler skaffe autonomi og forankring uavhengighet, og er dermed potensielt mer invasive enn E celler. Så langt vi kjenner til, er dette den første rapporten av kvantitative data om endringer i kreftcelle adhesjon og stivhet under uttrykk for en
in vitro
metastase-lignende fenotype
Citation. Tang X, Wen Q, Kuhlenschmidt TB, Kuhlenschmidt MS, Janmey PA, Saif TA (2012) Demping av Cell Mechanosensitivity i tykktarm kreft celler under
in vitro
metastasering. PLoS ONE 7 (11): e50443. doi: 10,1371 /journal.pone.0050443
Redaktør: Fan Yuan, Duke University, USA
mottatt: 7 august 2012; Godkjent: 22 oktober 2012; Publisert: 30.11.2012
Copyright: © 2012 Tang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet er finansiert av National Science Foundation (NSF) gir No. ECCS 07-25831, 10-02165 og NIH RO1 083272-03. XT ble finansiert av NSF Grant 0965918 IGERT: Trening av neste generasjon av forskere i celle- og molekylmekanikk og bionanoteknologi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
de fleste kreftdødsfall er forårsaket av metastaser, og ikke av den primære modertumor [2], [3], [4], [5], [6]. I løpet av metastasering, ondartede kreftceller å unnslippe fra tumoren ved å koble fra hverandre eller fra andre celler og den ekstracellulære matriks (ECM) [2], [3], [6], [7]. De rømte celler aktivt uttrykke proteinases og endre sine vedheft ligander å fornedre og endre deres omkringliggende ECM [3], [4], [5], [8], [9]. Samtidig de opp-regulerer deres motilitet og motstand mot apoptose for vellykket vaskulær spredning og invasjon i fjerntliggende friske organer [6], [7], [10]. Samtidig blir disse cellene redusere deres stivhet [11], [12], [13], [14], dvs. øke deres holder til å flyte gjennom små kapillærer [4], [15], [16]. En kvantitativ studie av de mekaniske egenskapene til kreftceller i løpet av de tidlige fasene av metastaser; men mangler [17], [18], [19], [20], hovedsakelig på grunn av utfordringene i å oppdage utbruddet av metastaser
in vivo Hotell og heterogenitet i biokjemiske og cellulære egenskapene til enkelte svulst celler [3], [17], [21], [22].
Vi har nylig oppdaget [1] at menneskelige kolon carcinoma celler (HCT-8) konsekvent kan vise en
in vitro
metastase-lignende fenotype (MLP) når de dyrkes på myke hydrogel-substrater med passende mekanisk stivhet (polyakrylamidgeler med Elastisitetsmodul modul~~POS=HEADCOMP: 21~47 kPa [1], [23]). HCT-8 celler er epitelial (E) i naturen. Når dyrket på myke underlag, de først danner distinkte epitelceller klynger eller øyer. Etter 7 dager, cellene distansere fra øyene, og anta en avrundet form (R celler). Disse R-celler er svært proliferativ, vandrende og de betydelig ned-regulere E-cadherin uttrykket – typiske kjennetegnene til metastase [1], [24]. Videre E til R overgang er repeterbar og irreversibel [1], [24]. På harde underlag (3 GPa isopor underlag), betyr dette E til R overgangen ikke forekomme.
I denne studien, vi først presentere en detaljert undersøkelse av mechanosensitivity både før og etter metastaselignende HCT-8 celler ved anvendelse av en gradient stivhet substrat. Studien viser tapet av mechanosensitivity av HCT-8-R-celler i motsetning til både E celler og normale fibroblaster. Stivheten av R-celler, målt ved hjelp av AFM, blir uavhengig av substrat stivhet. I motsetning til dette er stivheten av E-celler korrelert med substratet stivhet. Coulter Counter og Bio-MEMS-analyser viser at R celler har lav homotypisk celle-celle adhesjon og ubetydelig uspesifikk adhesjon i forhold til E-celler.
Resultater
1. Svak vedheft mellom HCT-8 R celler og underlaget
For å undersøke hvor HCT-8 R cellene reagerer på ulike fysiologisk relevant underlag av varierende stivhet, ble HCT-8 R cellene høstet fra myke PA gels, utvidet slik det er beskrevet i materialer og metoder og deretter dyrket på ferske stivhets-gradient PA gel substrater med stivhet varierende kontinuerlig 1-20 kPa (fig. 1a, venstre til høyre). Stivheten-gradient substrat belegges med et ensartet fibronektin konsentrasjon for å tillate cellebinding til underlaget [25], [26], [27]. Til sammenligning, både HCT-8 E-celler og normale Monkey Kidney fibroblast (MKF) celler, uten noen forutgående eksponering for PA-geler, ble platet ut på de samme stivhet gradient substrater og overflatefunksjonalisering (fig. 1b og 1c). De normale MKF Cellene ble valgt som kontroll, fordi de er kjent for å være mechanosensitive til substratet stivhet [28]. Vi har funnet, i motsetning til HCT-8 E-celler og normale celler MKF, HCT-8 R-celler som konstitutivt viste meget begrensede substrat kontaktområdene uavhengig av substrat stivhet. R-cellenes kontakt med substratet er omtrent 40-60% av deres tilsynelatende projiserte areal. Målt ved hjelp av 3D konfokal mikroskopisk avbildning, er R-celle-kontakt med underlaget kun 49,5 ± 20,9 um
2 (n = 34), som er 3,8 ± 0,3 ganger mindre enn E-celler (n = 47), noe som tyder på at R celler har svakere adhesjon til substratet enn E-celler. Den svake adhesjon av R-celler med substrat er også i overensstemmelse med den observasjon at R-celler viser en mindre projisert areal, enn E celler på samme stivhet substratet (Fig. 1d). Den projiserte areal av isolerte celler uten noen nabocelle kontakt, er av 1.9 0,6 ganger mindre for R-celler (n = 68) enn E-celler (n = 61).
(a-c) fasekontrastbilder av høstes HCT-8 R celler, HCT-8 E-celler og normale MKF celler på de gradient-stivhet PA gel underlag. De respektive 3 square paneler (omsluttet av gule strek boksene) viser representative forstørret syn på 1-5 kPa, 8-12 kPa, og 15-20 kPa stivhet domener. De hvite piler i forstørrede visninger indikerer enkeltrom, ikke-kontakt celler, mens de gule piler indikerer kontakt celler i koloniene. Skala barer i forstørret visning paneler er 100 mikrometer. (D) De enkelte celler «projisert areal på 3 celletyper på tvers av stivhet serien er vist. Her de ikke har noen kontakt med sine nabocellene på forskjellige stivhets underlag. (E) Spredningen område av enkeltceller i kontakt med nabocellene på forskjellige stivhets substrater. (F) Den tilsynelatende celle koloni område på 3 celletyper på forskjellige substrater stivhet. (G) Celleformen faktor på 3 celletyper, som ikke er i kontakt med sine naboceller på forskjellige stivhets substrater. (H) Celleformen faktor på enkeltceller, som er i kontakt med nabocellene på forskjellige stivhets underlag.
HCT-8 R-celler viser også en bemerkelsesverdig ufølsomhet for å endre den mekaniske stivhet av sin kultur substrat. De beholder en avrundet fenotype og begrenset område adhesjon til substrater, uavhengig av substratene «stivhet (figur 1a, angitt med hvite piler;. Fig. 1d, 1e og 1 g). Når substratet stivhet varieres over et 20-gangers område, spredning område av enkelt R-celler økte bare ca 27%, (fra 156,2 ± 42,1 um
2 på 1 kPa region (n = 62) til 197,9 ± 83,6 um
2 (n = 56) på en 20 kPa region) (fig. 1d). Across the stivhet testet, er økningen i R cellenes spredning område ikke så dramatisk som for E og MKF celler. På 5 kPa, 10 kPa og 15 kPa regioner, deres spredt områdene er 158,2 ± 40,3 mikrometer
2 (n = 56), 182,3 ± 32,2 mikrometer
2 (n = 63), og 190,9 ± 82,5 mikrometer
2 (n = 57), henholdsvis (fig. 1d). Også, R celle formfaktoren endres bare 7% i forhold til 0,9 ± 0,2 med en 1 kPa region til 0,8 ± 0,2 med en 20 kPa region (fig 1 g;. Formfaktoren, S = 4 * πA /P
2, hvor A er arealet av cellen og P er omkretsen. S = 1 for perfekt sirkulær form og 0 for uregelmessig form), som indikerer konstitutive avrundet form uavhengig av underlaget stivhet. På 5 kPa, 10 kPa og 15 kPa regioner, formfaktorer for enkelt R cellene er 0,8 ± 0,1, 0,8 ± 0,2 og 0,9 ± 0,2, henholdsvis (fig 1 g.). Etter langvarig kultur (60 dager), har R-celler ikke viser noen tilbakeføring mot en epitelial morfologi på alle substrater, uavhengig av stivhet, selv meget stiv polystyren (3 GPa) [1]. I tillegg daglig opptak via videomikroskopi indikerer at R celler viser ingen tegn til svekkelse av proliferativ aktivitet selv etter flere måneder i kultur. I motsetning til dette, begge HCT-8 E-celler og MKF celler dyrket på samme type av stivhet gradient substrater viser tydelig følsomhet for den mekaniske stivhet av deres kultur substrat. Den enkelte isolerte E celler spredt område øker 2,5 ganger over 20 ganger underlaget stivhet endring, fra 239,6 ± 191,9 nm
2 på en kPa regionen til 578,1 ± 429,8 nm
2 på 20 kPa regionen (Fig. 1b , angitt med hvite piler). Som underlag blir stiv, de HCT-8 E cellene vise en større spredning, med sine spredte områder 270,8 201,7 nm
2 (n = 51), 276,0 ± 104,8 nm
2 (n = 62), og 442,7 ± 367,7 um
2 (n = 55) på 5 kPa, 10 kPa og 15 kPa områder, henholdsvis (fig. 1b). Deres formfaktoren ble redusert fra 0,9 ± 0,2 på en kPa regionen til 0,6 ± 0,2 på 20 kPa regionen (Fig. 1 g). Across annen stivhet testet, enkelt E cellene form faktorer er 0,8 ± 0,2 (på 5 kPa region), 0,8 ± 0,1 (på 10 kPa region), og 0,7 ± 0,3 (på 15 kPa region), henholdsvis. Den mechanosensitivity av MKF er enda mer uttalt i forhold til HCT-8 kreftceller (Fig. 1c). Spredningen område av enkelte isolerte MKF celler (fig 1c,. Indikert med hvite piler) øker fem ganger over gradienten underlaget, fra 286,4 ± 86,2 mikrometer
2 (n = 46) på en kPa regionen til 1421,7 ± 845,7 nm
2 (n = 31) på 20 kPa regionen (fig. 1d). Som substrat stivhet øker, deres spredning området øker dramatisk, og er 578,1 ± 373,1 nm
2 (n = 62), 749,9 ± 355,5 nm
2 (n = 63), og 1218,6 ± 773,5 nm
2 (n = 59) på 5 kPa, 10 kPa og 15 kPa regioner, respektivt. Samtidig med økende underlaget stivhet, enkelt MKF celler spre seg til en mer uregelmessig morfologi, med sin formfaktoren avtar fra 0,9 ± 0,1 på en kPa til 0,5 ± 0,2 på 20 kPa regioner, henholdsvis (Fig. 1 g). På de mellomliggende stivhets regioner, dvs. 5 kPa, 10 kPa og 15 kPa regioner, formfaktorer for enkelt MKF cellene er 0,7 ± 0,3, 0,6 ± 0,3 og 0,5 ± 0,3, henholdsvis. Den svake adhesjon mellom HCT-8-R-celler og substratet, samt uavhengigheten til R cellemorfologi fra substratet stivhet, antyder sterkt at R cellene mister forankrings-avhengighet og kommunikasjon med deres mekaniske mikromiljøet. Dette forankrings-uavhengighet kan potensielt fremme R cellene å overleve i suspensjon, noe som er et viktig kjennetegn på
in vivo
metastase av kreftceller [2], [3], [4], [16], [22] .
2. HCT-8 R cellene vise svak celle-celle adhesjon
På stivhet-gradient underlag, både HCT-8 E celler og MKF cellene vise celle koloni formasjon, spesielt på stivere regioner (angitt med gule piler i Fig. 1b og 1c). Kolonien størrelse er positivt korrelert med substratet stivhet. På underlaget stivhet 1 kPa, 5 kPa, 10 kPa, 15 kPa og 20 kPa gels cellekoloni størrelser av HCT-8 E cellene er 2962,2 ± 1000,5 mikrometer
2, 3662,1 ± 1105,3 mikrometer
2, 4249,5 ± 919,5 mikrometer
2, 9736,5 ± 4032,7 mikrometer
2 og 11748,7 ± 2144,9 mikrometer
2, henholdsvis (fig. 1f). For HCT-8-R-celler på samme stivhets substrater, kolonistørrelsene er vesentlig mindre enn sine motstykker E selv når R-cellene er i kontakt med nabocellene i 3 dager (Fig. 1a). På substrat stiffnesses av 1 kPa, 5 kPa, 10 kPa, 15 kPa og 20 kPa, de R celle koloni størrelser er, 1087,4 ± 338,3 nm
2, 1449,8 ± 343,4 nm
2, 3062,2 ± 1326,9 mikrometer
2, 3849,6 ± 919,1 nm
2 og 3912,1 ± 1183,8 mikrometer
2, henholdsvis (fig. 1f). Vi har også observert at inne R cellekolonier, er celle-celle-kontaktareal ikke så omfattende som i E cellekolonier. R-celler synes å være bare berøre hverandre ved punktkontakter (Fig. 1a). Disse resultatene tyder på R celle-celle adhesjon er ikke nok for dem å danne sammenhengende kolonier eller celle øyer som gjør E og MKF celler.
Videre er det interessant å merke seg at så HCT-8 E celler eller MKF celler gjennomgå homotypisk celle-celle-adhesjon, deres individuelle celleområder og celleformen faktor bli bemerkelsesverdig mindre substrat stivhet avhengig (fig. 1b og 1c, angitt med gule piler). Individuelle celleområder og formfaktorer av single HCT-8 E celler inne celle øyene på 1 kPa gels er 785,6 ± 299,4 nm
2 og 0,7 ± 0,1, henholdsvis, som er lik de på 20 kPa gels, 892,8 ± 322,1 nm
2 og 0,6 ± 0,1 (fig. 1e og 1 time). Samme egenskaper er observert på middels stivhet, celleområdet og formfaktor av individuelle HCT-8 E inne øyene er 526,7 ± 187,0 nm
2 og 0,8 ± 0,1 på 5 kPa gels, 633,9 ± 421,4 nm
2 og 0,6 ± 0,2 på 10 kPa gels, og 723,1 ± 515,2 nm
2 og 0,6 ± 0,2 på 15 kPa geler. For enkelte MKF celler inne øyer, deres celleområdet og formfaktor er 928,5 ± 374,0 nm
2 og 0,5 ± 0,3 på 1 kPa gels, 892,8 ± 415,7 nm
2 og 0,5 ± 0,3 på 5 kPa gels, 1098,1 ± 564,6 nm
2 og 0,5 ± 0,2 på 10 kPa gels, 1008,8 ± 223,7 nm
2 og 0,3 ± 0,2 på 15 kPa gels, og 1160,6 ± 429,7 nm
2 og 0,4 ± 0,1 på 20 kPa gels ( fig. 1e og 1 time). Når disse cellene etablere celle-celle kontakter, E og MKF cellene vise celle spredning på myke 1 kPa gels, noe som tyder på celle-celle signaler velde celle-substrat signaler (venstre-regionen i Fig. 1b og 1c, vist ved gul piler). Flertallet av HCT-8-R-celler; imidlertid forblir avrundet, med samme tilsynelatende cellearealet og formen faktor som de av isolerte R-celler, selv når den er i kontakt med nabocellene (Fig. 1a, angitt med gule piler). Denne R-celle fenotype medfører generelt mindre R celle koloni område sammenlignet med E celleøyene som består av tilsvarende cellenumrene (Fig. 1f). De enkelte cellegrupper og formfaktorer for enkelt R celler inne R cellekolonier på 1 kPa gels er 151,8 ± 33,4 mikrometer
2 og 1,0 ± 0,1, henholdsvis, og er lik de på 20 kPa gels (169,6 ± 30,5 mikrometer
2 og 0,9 ± 0,2), respektivt, så vel som de av enkelt R-celler viser ingen celle-celle-kontakter (fig. 1e og en h). På 5 kPa, 10 kPa og 15 kPa gels, celleområdet og formfaktor av individuelle HCT-8 R celler inne øyene er 156,2 ± 52,3 mikrometer
2 og 0,8 ± 0,1, 142,8 ± 47,2 mikrometer
2 og 0,9 ± 0,0 og 160,7 ± 33,4 mikrometer
2 og 0,8 ± 0,2, henholdsvis. Denne unike fenotype vedvarer selv etter R celler dyrkes på svært stive polystyren underlag (3 GPA) for langvarig kultur ganger (måneder); igjen tyder svak celle-celle adhesjon mellom R-celler. Tatt sammen tyder disse resultater på at under eller etter E-til-R overgang, R-celler erverve celle autonomi som kjennetegnes ved betydelig redusert celle-celle og celle-substrat klebe kontakter.
3. R cellene har redusert homotypisk celle-celle-klebende aktivitet
I tillegg til å estimere den celle-celle adhesjon kvalitativt basert på deres kontakt morfologi, vi videre brukte Coulter Counter assay for å kvantitativt undersøke den funksjonelle tap av HCT-8 celle-celle- adhesjon etter E-til-R overgang. Den coulter-teller måler hastigheten og graden av celleadhesjon ved å kvantifisere den reduksjon i antallet av enkeltceller i suspensjon som celleansamlinger danner som en funksjon av tiden [1], [29], [30]. Kinetikken av spesiell homotypisk celle-celle-adhesjon for cancerøse epiteliale HCT-8 E og R-celler ble målt og sammenlignet. Normale (ikke-kreft) Ma104 epitele celler ble anvendt som en kontroll. Vi fant at tilknytningen HCT-8-R-celler (høstet fra 21 kPa PA substrater) viste en markert lavere hastighet og grad av celle-celle-adhesjon i forhold til den opprinnelige HCT-8 E-celler dyrket på harde polystyren underlag (fig. 2). Tidligere studier har vist at etter 120 minutters inkubering, 84,8 ± 4,0% av de HCT-8-R-celler forble som enkeltceller, i motsetning til 37,6 ± 6,1% av opprinnelig HCT-8 E-celler og 5,2 ± 0,7% av de normale Ma104 cellene [1]. Dette bemerkelsesverdige resultat indikerer sterkt at celle-celle lim aktivitet av HCT-8 R celler er nesten helt borte etter at de angre fra E celle øyer. Dette resultatet er i tråd med våre funn av redusert E-cadherin uttrykk på R-celler [1], [24]. Reduksjonen i celleoverflate-klebeevnen ble også sett når ikke-spesifikke adhesjonskreftene mellom HCT-8 flater og SiO
2-belagte Bio-MEMS-prober ble målt.
(a) Sammenligning av celle-celle adhesjon forekomst av originale HCT-8 E celler (aldri utsatt til 21 kPa PA gels), disassociated HCT-8 R celler høstet fra 21 kPa PA gels, og normale ikke-kreft epitelceller Ma104 celler. HCT8 R-celler har den laveste celle-celle adhesjon. Hvert datapunkt består av 3 duplikater, og hvert duplikat består av 5 × 10
5 celler av respektive celletyper.
4. Cell stivhet endringer reflektere mechanosensitivity
I tillegg til underlaget stivhetsavhengige celle morfologi endringer, HCT-8 E celler viste også variert celle stivhet avhengig dyrkingssubstratet stivhet. Ved hjelp av atomic force mikroskopi (AFM), cellen stivhet HCT-8 E celler dyrket på stivhet-gradient substrater bestemmes av innrykk ved hjelp av silisium-nitride bom med en fjærkonstant 148,14 PN /nm (med konsekvent celle innrykk hastighet 0,1 mikrometer /sek). Hertz teori (se Materialer og Metoder) ble anvendt for å ekstrahere elastisitetsmodulen av de innrykket cellene. For å lette sammenligningen mellom ulike celler på samme substrat stivhet, utpekte vi 5 lik-plass regioner over hele stivhet serien, med region 1 som spenner over en stivhet i 1-4 kPa, regioner 5 med stivhet 5-8 kPa, 9-12 kPa , 13-16 kPa 17-20 kPa henholdsvis (fig. 3a). Ved hjelp av AFM, fant vi HCT-8 E celler øke sin celle stivhet som underlag blir mer rigid. Fra region 1 til region 5, stivhet HCT-8 E celler gradvis økt fra 1,4 ± 0,9 kPa til 1,9 ± 0,8 kPa, til 2,1 ± 1,4 kPa, 2,2 ± 1,3 kPa, og til 3,8 ± 2,0 kPa, henholdsvis (n = 6 ~ 10 for hver region, fig. 3b). Særlig er det verdt å merke seg at gradienten av cellestivhetsøkning (fig. 3a) ser ut til å samsvare med gradient av gelen substrat stivhet øker. Disse resultatene er konsistente med de tidligere rapportert [25], og antyder at HCT-8 E celler er svært responsive til den skjøre variant av deres microenvironmental mekaniske signaler. Stivheten av HCT-8-R-celler; imidlertid, på alle de forskjellige stivhets substrater, vises invariante ved 0,5 ± 0,4 kPa, noe som indikerer at R-celler har en meget begrenset eller ingen interaksjon med deres mekaniske mikromiljøet. AFM Studien viste også at R cellene er mekanisk mykere enn E celler, noe som potensielt kan øke sin malleability å tillate mer effektiv invasjon av målet vev følgende
in vivo
metastaser.
Bruke Atomic Force Microscopy , stivheten av HCT-8 E-celler dyrket på gradienten substratet blir bestemt. De HCT-8 E-celler øker deres celle stivhet som substratene blir mer stiv. For å lette sammenligningen mellom ulike celler på samme substrat stivhet, er fem like linjeavstand regioner over hele stivhet utvalg utpekt: region 1 tar 1-4 kPa, region 2 dekker 5-8 kPa, region 3 dekker 9-12 kPa, region 4 dekker 13-16 kPa, og region 5 dekker 17-20 kPa. (A) I en region til region 5, øker E celle stivhet progressivt med verdiene 1,42 ± 0,85 kPa til 1,90 ± 0,77 kPa, 2,06 ± 1,39 kPa, 2,15 ± 1,28 kPa, og 3,82 ± 1,98 kPa, respektivt. I motsetning til på gel substrater med samme stivhet gradient, post-metastatiske R cellene vise nesten invariant celle stivhet. (B) Fase kontrast bilder av HCT-8 E celler på gradient PA underlag.
5. E celle øyer viser høy uspesifikk adhesjon i forhold til R-celler
Overflaten uspesifikke voksninger av HCT-8 E celler (4
th dag med kultur på PA gel) og R-celler ble målt ved hjelp av en mikro-fabrikerte bio-MEMS kraftsensor (fig. 4 og Materialer og Metoder) [1], [30], [31]. Sensoren består av en bjelke med microcantilever kalibrert kraft-forskyvnings forhold (se Materialer og Metoder). Det er en flat sonde (bredde 15 um og dybde 5 um) som er festet til bjelken, som danner klebende kontakt med cellene (Fig. 4a). Sensoren er laget av et enkelt krystallsilikon, og er belagt med et tynt lag av naturlig silisiumoksyd (SiO
2). Sonden og sensoren ikke er funksjonalisert. Sensoren er manipulert med en x-y-z-piezo stadium. Den flate probe bringes i kontakt med E-celleøyene «side konvekse flate på grensen. Hver E-celle øya består av 100 s av celler med flere celler stabling på øya periferien (Fig. 4b). Etter en 2 minutters kontakt, er kraftføleren trukket bort horisontalt fra cellen øy med en konstant hastighet på 2,1 ± 0,4 um /s (fig. 4C). Kontakttiden ble valgt som 2 minutter, siden langvarig kontakt varighet kan føre til celle avsetning av ECM på sonde og komplisere analysen. På grunn av den celle-sonde adhesjon, deformerer følerbjelken under tilbaketrekking, dvs. cellene bruke en gjenopprettende kraft mot løsgjøring. Den korte varighet kontakt mellom cellen og sonden hindrer aktivering av celle integriner, og dannelsen av en hvilken som helst fokal adhesjon på sonden (tar 30 minutter for å danne [32], [33]). Derfor kan bare ikke-spesifikke adhesive interaksjoner dannes mellom celleoverflaten og den SiO
2-belagte sonde.
(a) Den ikke-funksjonaliserte mikrofremstille Si kraftsensor med en flat sonde og med kjent tvangs nedbøyning forhold blir manipulert av en høy oppløsning xyz Piezo-scenen for å ta kontakt med celle øyenes side konveks overflate (på xy-planet). (B) Konfokalmikroskopi av celleøyene viser høyden av øyene er av størrelsesorden 30~50 um. Den vertikale høyde av bio-MEMS sonde er 5~10 um. (C) Etter en 2 minutters kontakt, er kraftføleren horisontalt trukket bort ved en konstant hastighet på 2,1 ± 0,4 um /s. Mens celleadhesjonen mellom proben og celleoverflaten hindrer tilbaketrekning av sensor, sensorbjelkene deformeres ved δ, noe som gir kraften F. Merk at sonden ikke er funksjonalisert. Den to-minutters kontakt mellom sonden og celler som hindrer aktivering av celle integriner, og dannelsen av en hvilken som helst celle fokal adhesjon, noe som tar . 30 minutter for å danne
Vi har funnet at, under tilbaketrekking av bio-MEMS-sensor, E-celleøyene strekker seg lokalt ved 15-20 um resulterer i en konisk form (se begge skjematisk i fig. 4c og fase-kontrast bilder i fig. 5). Oppmerksom på denne strekningen er forskjellig fra den som skyldes utelukkende membran fortøyningen, som består av strekking bare fosfolipid bilaget. Under tilbaketrekkingen sonde, blir konusen kontinuerlig strukket med økende kontaktvinkelen θ, mens cellen i kontakt med sonden synker på en trinnvis måte (fig. 5b-5d). Økningen av kraft mellom celle og sonde er reflektert i den progressive økning av avstanden mellom et fast referanse og proben (fra D
0 til D
1 og D
2). Celle kraft beregnes ut fra endringen av gap og styrke deformasjon kalibrering av sensoren fjæren. Ved en kritisk verdi av kraft, F
c, kjeglen plutselig løsner fra sonden (fig. 5d-e). For E-celler, F
c er maksimal kraft på kraftforskyvningskurver. Vi anser F
c som et mål på celle sonde adhesjon. Vi målte Fc for 12 slike cellegrupper og fått F
c = 256,3 ± 33,7 Nn (n = 12). Lignende eksperimenter med R cellene vise neglisjerbar celle-adhesjon sonde med F
c = 1,14 ± 0,13 nN (n = 25, Fig. 6). Derfor, R cellene ha ubetydelig ikke-spesifikk adhesjon sammenlignet med E-celler, og synes således å være i en «smurt» tilstand kanskje gjør dem i stand til å bli tilpasset til å passere gjennom vaskulære kapillærsjikt i løpet av
in vivo
metastasering.
(a) inter lim avløsning kraft av en celle øy på MEMS sonde. De kraften øker monotont med stretch til løsrivelse. (B-e) fasekontrastbilder av en typisk adhesjon eksperiment. Kraft beregnes ut fra deformasjonen av sensoren bjelken
D
og den kraft-deformasjon kalibreringskurve. Den kritiske avløsning kraft, F
c, er den maksimale kraft på kraftforskyvningskurver. Under strekking, holder kontaktvinkelen θ mellom proben og celle øya øker, men størrelsen av kontaktsonen mellom proben og cellen øy reduserende. Målestokk = 40 um.
(a) Adhesive kraft av R-celler på MEMS sonde som sonden beveges bort fra cellene etter 2 min kontakt (n = 25). (være). Fase-kontrast bilder av R-celler og MEMS-proben når ikke-spesifikk adhesjon mellom dem blir målt. Den maksimale styrken måles løsgjøring er 2,5 nN, mens cellen deformasjonen er knapt merkbar. Skala:. 40 mikrometer
Diskusjoner
Så vidt vi vet, er den første til å beskrive og vurdere endring i mechanosensitivity i humane tykktarmskreftceller i løpet av en metastaselignende studien overgangen produsert av utelukkende ved å endre den mekaniske mikromiljøet under
in vitro
kultur. Det er tidligere rapportert vi HCT-8 celler utføre en E-to-R overgang på 21~40 kPa stivhet underlag [1]. Denne studien benytter effektivt en kombinatorisk assay system tilnærming ved hjelp av stivhet-gradient underlag, Coulter teller analyse, atomic force microcopy (AFM) og Bio-MEMS kraftsensorer for å utforske den kvantitative mechanosensitivity endring av menneskets tykktarm karsinom HCT-8 epithelial E celler som de transitt til avrundet form R celler. Vi fant, utløst av de aktuelle underlaget stivhet signaler, at HCT-8 R cellene mister sin følsomhet for både underlaget mikromiljøet samt deres samspill med nabo R og E celler. Som et resultat, HCT-8 R-celler skaffe autonomi for overlevelse som forankringsuavhengige, mobile celler, noe som er et vesentlig trekk ved de tidlige hendelsene i cancercellemetastase [3], [4], [5], [6], [16], [20], [30], [34], [35].
de fysikalske egenskaper av kultur substrater er funnet å allment påvirke fenotyper og genekspresjon av et antall normale og kreftceller [1], [17], [18], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44 ], [45], [46], [47], [48], [49], [50], [51], [52], [53], [54], [55]. For å svare på underlaget stimuli, cellene holder seg til og spre på underlaget etterfulgt av sensing og behandling både mekaniske og kjemiske signaler [26], [37], [44], [46], [49], [53], [55 ], [56], [57], [58], [59], [60], [61]. Som vi tidligere har vist [1], etter 7-dagers kultur på myke underlag, HCT-8 celler gjennomgå en E til R overgang preget av R celler dissociating fra moder epitelcellelaget eller celle øyer. Disse dissosierte R cellene viser bemerkelsesverdig nedsatt adhesjon (både spesifikk og ikke-spesifikk [1], [24], [29]), i forhold til sine E celle motstykker. I motsetning til E-celler, dissosierte HCT-8-R-celler viser substrat-stivhet uavhengig celle-substrat interaksjoner. Deres spredning er ikke svekket ved svak forankring med kulturen substrat eller til andre celler (Fig. 1). Anchorage uavhengighet er et kjennetegn ved metastatiske celler [7], [21], [36]. Faktisk, vår siste
in vitro
basalmembran celle invasjon analyser tyder på at HCT-8 R celler er betydelig mer omfattende enn E celler [24].
Våre funn av en E-to-R overgang i HCT-8 kolon adenocarcimona celler antyder at passende substrat mekanisk mykhet kan fremme eller hjelpe til med oppstart av de tidlige hendelsene i kreftcelle metastase, og ironisk tap av mechanosensitivity, som kan hjelpe i vaskulær spredning til distal vev målområder. Denne studien viser at tykktarmskreftceller kan oppnå denne egenskap utelukkende av kultur på riktig myke underlaget. Vi er for tiden vurdere om R celler viser økt metastatisk atferd i dyrestudier i forhold til E celler. Hvis E til R overgang korrelerer med anskaffelse av forbedret metastatisk aktivitet, kan manipulering av den mekaniske mikromiljøet være et attraktivt
in vitro
modell for undersøkelse av den tidlige hendelsene i kreftcelle metastase så vel som for screening av anti- mulig metastatisk terapeutiske midler.
Materialer og metoder
1. Cellekultur, mikroskopi bildebehandling og PA geler forberedelser
Menneske kolon adenokarsinom HCT-8 celler (ATCC nr .: CCL-244) ble dyrket i RPMI 1640 (Gibco No .: 23400-062) supplert med 2 gram natriumbikarbonat per liter, noe som gir endelige konsentrasjoner på 10% hesteserum (Gibco No .: 26050-088), 1 x antibiotika-antimykotisk (Gibco No .: 15240-062) og 1 mM natriumpyruvat (Gibco nr .: 11360) [1]. Ma104-celler (Afrikansk grønn ape embryoniske nyre) ble oppnådd fra MA Bioproducts og dyrket i MEM (Gibco No .: 41500-018) supplert med 2 g HEPES per liter, 2,2 g natriumbikarbonat pr liter, 1 x antibiotika-antimykotisk så ovenfor, og 5% føtalt bovint serum (Gibco nr .: 16140). Den apenyre fibroblast (MKF) cellelinje (CV-1, ATCC, Manassas, VA) ble dyrket i et medium med 90% DMEM (ATCC, Manassas, VA), 10% FBS (ATCC, Manassas, VA) og 1 x antibiotika-antimycotic (Gibco No .: 15240-062). Celletettheten før plettering ble tellet med standard hemocytometer. Standard cellekulturinkubator ble anvendt for å tilveiebringe kulturen tilstand med tilstrekkelig fuktighet, 37 ° C temperatur, og 5% CO
2.
