Abstract
Angiogenese spiller en avgjørende rolle i tumorvekst og progresjon. Lav uttrykk for mineralocorticoid reseptor (MR) i flere ondartede svulster korrelerer med tilbakefall av sykdommen og total overlevelse. Tidligere studier har vist at MR-ekspresjon er redusert i kolorektal cancer (CRC). Her hypoteser vi at redusert MR uttrykk kan bidra til angiogenese og dårlig pasient overlevelse i kolorektal kreftformer. I en kohort av CRC pasienter, analyserte vi svulst MR uttrykk, dens korrelasjon med tumor mikrovaskulær tetthet og dens innvirkning på overlevelse. Deretter avlest vi rolle MR i angiogenese i en in vitro modell, basert på tykktarmskreft cellelinje HCT116, ingenierized å re-uttrykke et fysiologisk kontrollert MR. I CRC, redusert MR-ekspresjon var assosiert med øket mikrovaskulær tetthet og dårlig pasientoverlevelse. I pchMR transfektert HCT116, aldosteron eller naturlig serum steroider i stor grad hemmet mRNA uttrykk nivåer av både VEGFA og dens reseptor 2 /KDR. I CRC, kan MR aktivering betydelig redusere angiogenese ved direkte hemme feilregulert VEGFA og hypoksi-indusert VEGFA mRNA uttrykk. I tillegg demper MR aktivering av ekspresjon av VEGF-reseptor-2 /KDR, eventuelt dempe aktivering av en VEGFA /KDR avhengige signalveien viktig for overlevelsen av tumorceller i henhold til hypoksiske betingelser
relasjon:. Tiberio L, Nascimbeni R, Villanacci V, Casella C, Fra A, Vezzoli V, et al. (2013) reduksjon av mineralkortikoid Receptor Drives Angiogene Pathways i tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (3): e59410. doi: 10,1371 /journal.pone.0059410
Redaktør: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italia
mottatt: 22 november 2012; Godkjent: 13 februar 2013; Publisert: 28 mars 2013
Copyright: © 2013 Tiberio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den nåværende studien ble støttet av Adele og Francesco Lonati Foundation, Brescia, Italia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mineralocorticoid reseptor (MR) er en kjernefysisk reseptor som er klassisk knyttet til kontroll av ion transport i epitelceller, særlig i nyrene og tykktarmen. [1], [2] Denne spesifikke aktivitet spiller en avgjørende rolle i å regulere elektrolyttbalanse og blodtrykk. Imidlertid er det nå kjent at MR er også uttrykt i hjertemuskelceller, endoteliale celler og nevroner, noe som antyder at det spiller en fysiologisk rolle i et stort utvalg av ikke-epiteliale celler. [3], [4] I klassisk mineralkortikoid målet vev, ligger MR meste i cytoplasma i en inaktiv tilstand; ved binding av fysiologiske ligander slik som aldosteron, gjennomgår MR konformasjonsendringer, dissosierer fra molekylære anstand og translocates inn i cellekjernen hvor det regulerer ekspresjonen av målgener ved spesifikke DNA-responselementer. [5] Det er også bevis for eksistensen av ikke-genomiske mekanismer, hvorved aktiverte MR samvirker med signalveien elementer utenfor cellekjernen for å regulere genekspresjon. [6] I alle tilfeller vil nærværet av forskjellige MR isoformer, eksistensen av forskjellige ligand-induserte post-translasjonelle modifikasjoner av reseptoren og rekrutteringen av forskjellige reseptor-assosiert corepressors eller coactivators står for celletypespesifikke effekter av MR innenfor forskjellige mineralkortikoid målet vev. [7], [8].
Mange litteraturdata indikerer at aldosteron, gjennom MR-avhengige mekanismer, kan også formidle negative effekter på patogenese og utviklingen av ischemiske sykdommer hvor angiogenese spiller viktige rolle i redning av hypoperfused vev. [9], [10], [11] Faktisk, behandling med MR-antagonister fremmer en hurtigere og bedre revaskularisering redusere omfanget av vevsskader i iskemisk lem, hvilket antyder at aldosteron, via MR aktivering, utøver en negativ rolle i angiogenese. Denne tolkningen er videre støttet av funn som i denne eksperimentelle innstillingen, MR hemming korrelerer også med økt uttrykk av pro-angiogene faktorer. [12] Videre svekker aldosteron vaskulær regenerering av benmarg avledet endoteliale progenitorceller, en prosess forskjellig fra angiogenese, som er relevante for å gi sikkerhet kilde av blodstrøm i respons til kritisk innsnevring av en hovedpulsåre [13].
avgrensningen av molekylære mekanismer for adaptiv angiogenese i ischemiske vev har åpenbart en avgjørende rolle i den hypoksi-induserbar faktor-1 (HIF-1) i den transkripsjonelle regulering av gener som koder for angiogene vekstfaktorer som medierer den ettervekst av det vaskulære nettverk. [14] I hypoksiske celler, aktivering av den heterodimere transkripsjonsfaktoren HIF-1 er hovedsakelig forårsaket av mangel på de posttranslational modifikasjoner av alfa-underenhet (HIF-1α) etter oksygenavhengig hydroksylase, som fører til rask nedbrytning i henhold til normoksisk betingelser . Som en konsekvens av dette, under lave oksygenkonsentrasjoner, er HIF-1α stabilisert, heterodimerizes med βsubunit HIF-1β) og bindes til hypoksi-responselementer (HRE) i målgener [14].
Siden en viktig funksjon av faste tumorer er hypoksi, det er godt akseptert at tumor utløser en angiogen respons i hovedsak som et resultat av en HIF-1α drevet økning i angiogene faktor ekspresjon, selv om feilregulering, på grunn av iboende genetiske mutasjoner, må også tas i betraktning. [15] Blant forskjellige angiogene vekstfaktorer, som utskilles av begge tumor og stromale celler og direkte regulert av HIF-1α, spiller VEGFA en sentral rolle i å fremme neovascolarization i kreft. [16] Mer spesifikt VEGFA har vært involvert i tykk- og endetarmskreft (CRC) progresjon, blir oppregulert i pasienter med lokaliserte samt metastatisk CRC. [17], [18] VEGFA og andre medlemmer av VEGF familien binder seg til tre relaterte membranreseptorer (VEGFRs), nemlig VEGFR1 /flt1, VEGFR2 /KDR og VEGFR3 /flt4, med VEGF reseptor 2 /KDR spiller en sentral rolle som formidler celle overlevelse, mitogenese og differensiering av endoteliale celler. VEGF reseptor 2 /KDR er også uttrykt på humane kreftceller, noe som tyder på det kan utøve bestemte roller. [19], [20] Ja, Calvani og medarbeidere gitt bevis for at en VEGF /KDR /HIF-1α autokrint sløyfe formidler overlevelse etter hypoksiske kulturforhold HCT116, en tykktarmskreft cellelinje [21].
En tidligere studie rapporterte at en nedgang på MR uttrykk er en tidlig hendelse i CRC progresjon og foreslo at MR potensielt fungerer som en tumor-suppressor. [22] Denne oppfatningen er konsistent med nylige rapporter som viste at, i lungesvulster, MR ekspresjonsnivåer er sammenlignbare med de som finnes i normalt lungevev positivt korrelerer med pasienter total overlevelse tid. [23] I tillegg studien i CRC viste at MR underexpression er assosiert med VEGF-reseptor 2 /KDR overekspresjon og foreslo at underexpression av MR kan spille en rolle i den pro-angiogene bryter av tumoren. [22] Men hittil har det ikke vært noen mekanistisk forklaring på denne sammenhengen.
I denne studien, må vi først undersøkte MR uttrykk, angiogenese og pasient overlevelse i en kohort av pasienter med CRC og vist at redusert MR uttrykk er korrelert til øket microvessel tetthet (MVD) og til redusert overlevelse av pasienten. Vi så brukt et in vitro-system basert på tykktarmskreftcellelinje HCT116, genetisk manipulert til å uttrykke høye nivåer av funksjonelt aktiv MR, for å teste hypotesen om at MR aktivering av agonister kan ha negativ regulere tumor angiogenese. Vi demonstrerte at aldosteron behandling av MR-transfekterte HCT116-celler reduserer ekspresjon av mRNA VEGFA, både i normoksisk og hypoksiske dyrkningsbetingelser. Videre viste vi at i de samme cellene, demper aldosteron uttrykk for VEGF reseptor 2 /KDR mRNA.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Tretti pasienter fortløpende gjennomgår kirurgi for primær sporadisk kolorektal kreft ble inkludert i immunhistokjemi og overlevelse analyser. Alle pasientene ble informert og ga sitt skriftlige samtykke til studiet og den anonyme bruk av sine data før de blir registrert. Den menneskelige Studien ble godkjent av etikkomiteen av Spedali Civili Brescia og studieprotokollen var i samsvar med Helsinkideklarasjonen av gode kliniske retningslinjer.
MR og CD34 Immunohistochemistry (IHC) og Survival Analysis
primære endepunktene var svulst uttrykk for MR og CD34, både evaluert av immunhistokjemi. CD34 endothelial markør ble anvendt for å vurdere tumormicrovessel tetthet (MVD). [24] Følgende variabler ble undersøkt for å vurdere sammenhengen med de nevnte endepunkter: alder og kjønn på pasientene, colonic området, scene, grad av differensiering, mucinous subtype, og lymphovascular invasjon av svulst, hensikt og innstilling av primærbehandling, samlet 5-års overlevelse. Prøver av tumor og normal tykktarmsslimhinne ble oppnådd fra formaldehydfiksert kirurgiske prøver. Parafinsnitt ble farget med hematoksylin-eosin, PAS og PAS diastase. For immunhistokjemisk evaluering følgende antistoffer ble benyttet: MR (Ab2774, fortynning 1:250 Abcam, Cambridge, UK), etter pH 6 citratbuffer behandling i 40 minutter og CD34 (CD34Ab1, fortynning 1:30 Thermo Scientific, Astmoor Runcon, UK) etter tre citratbuffer pH 6 sykluser. Antall positive celler ble regnet for hver pasient i 10 høy effekt felt (HPF, x40) av en patolog (VV), og resultatene ble kategorisert i tre nivåer av uttrykk i henhold til andelen av positive celler; MR uttrykk: lav eller MR 1+: 33%, middels eller MR 2+: mellom 33% og 67%, høy eller MR 3+: 67%, CD 34 uttrykk: lav CD34 1 + 33% , middels eller CD34 2+: mellom 33% og 67%, høy eller CD34 3 +:. 67%
Cells
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinje HCT116 var en slags gave Dr G Melillo (National Cancer Institute, Frederick, MD, USA) [21]. Villtype HCT116-celler ble holdt i RPMI med forskjellig konsentrasjon av FCS, mens transfekterte HCT116-celler ble dyrket i McCoys medium med forskjellige konsentrasjoner av trekull-strippet FCS eller FCS som beskrevet nedenfor.
Plasmider
PchMR, som uttrykker HMR [25] og pFC31-Luc som uttrykker ildflue luciferase under kontroll av tandem glukokortikoid responselement inneholder mus brystsvulstvirus promoter [26] var en slags gave fra Dr ME Rafestin-Oblin (INSERM U, Paris , Frankrike); PRL-TK som uttrykker
Renilla
luciferase under kontroll av herpes simplex virus tymidinkinase promoter ble kjøpt fra Promega; pcDNA3 ble kjøpt fra Invitrogen.
Transient Transfeksjon
HCT116 ble transfektert hjelp Fugene HD Transfeksjon Reagens (Roche) i henhold til produsentens anvisninger. Transfeksjon effektivitet for pchMR ble vurdert til 24 timer etter transfeksjon av immunhistokjemi og funnet å være 53,5 ± 8%. For en omfattende beskrivelse av denne analysen, se tekst S1.
Etablering av Hypoksi
Normoxia ble opprettholdt av celler i vekst ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2 i luft. Hypoksi ble etablert ved å opprettholde kulturflasker ved 37 ° C under en konstant strøm av en hypoksisk gassblanding bestående av 95% N
2 og 5% CO
2 i 90 minutter som beskrevet. [27] Da kolber ble forseglet og inkubert ved 37 ° C for ønsket tid for hypoksi.
Kultur og behandling Betingelser pchMR-MR transfekterte HCT116-celler dyrket under Normoxia og hypoksi
Fem timer etter transfeksjon med pchMR ble HCT116 cellene inkubert i Mc Coy medium inneholdende 10% hormon-fri Charcoal-Stripped Fetal Bovine Serum (Invitrogen) i luften i 12 timer (normoxia eksperimenter) eller 24 timer (hypoksi eksperimenter eller CoCl
2 behandling ). Cellene ble deretter behandlet med 3 nM aldosteron (Sigma-Aldrich) og /eller spironolakton (1 uM, gitt 1 time før aldosteron) (Sigma-Aldrich) og videre inkubert i 36 timer i luft (normoxia), eller utsettes i 20 timer enten for å redusere oksygen (hypoksi) eller 100 pM CoCl
2-behandling (CoCl
2). Alternativt kan fem timer etter transfeksjon med pchMR eller pcDNA3, ble celler inkubert i 10% FCS-supplert medium i 48 timer i luft (normoxia) eller inkubert i 24 timer i luft, etterfulgt av eksponering til lav oksygen i 20 timer (hypoksi).
Kvantitativ RT-PCR
RNA ble ekstrahert og retrotranscribed som beskrevet. [28] transkripsjonsnivåer ble analysert ved real-time PCR i en iCycler apparat (Bio-Rad, Milan, I) med iQ SYBR Grønn Supermix (Bio-Rad) under forhold som er anbefalt av leverandøren. PCR-primere, se tabell S1, ble hentet fra Eurofins MWG Operon. Messenger-RNA-ekspresjonsnivåer ble normalisert til p-aktin av Q-genet program. [29] Hver prøve ble analysert i tre eksemplarer og PCR produktene ble også separert på 2,5% agarosegel for kontroll.
Western Blot analyse
For en omfattende beskrivelse, se tekst S1. Følgende antistoffer ble brukt for deteksjon: anti-human MR (fortynning 1:300, vennlig donert av Dr Gomez-Sanchez, GV Sonny Montgomery VA Medical Center, Jackson, MS, USA) [30], anti-human HIF-1α ( torsk. 610658, fortynning 1:800, BD Transduction Laboratories), anti-human GAPDH (sc-32233, fortynning 1:5.000, Santa Cruz).
Gene Reporter analysen
For en omfattende beskrivelse, se tekst S1 i online supplement. PchMR- eller pcDNA3- transfekterte celler ble ko-transfektert med plasmid inneholdende rapportørgener. For påvisning av MR-drevet luciferase uttrykk, pFC31-luc og PRL-TK tjente som reporter eller coreporter genvektor, respektivt. Resultatene er gitt som normalisert i forhold luciferase aktivitet.
immunfluorescens
For en omfattende beskrivelse, se tekst S1 i online supplement. Fikserte celler ble inkubert med anti-MR-antistoff (fortynning 1:100) og med Alexa Fluor 448 geit-anti-mus IgG, (Invitrogen). Cellekjerner ble kontra med DAPI. Celler ble fotografert av LSM konfokal mikroskop (Zeiss).
Statistical Analysis
Oppsummerende statistikk for kontinuerlige variabler med ikke-normalfordeling (som vurderes av Kolmogorov-Smirnov tester) blir presentert som medianverdier, mens variabler normalfordelte oppsummeres som betyr ± SEM. Gruppe forskjeller ble analysert med Wilcoxon-Mann-Whitney t-test eller ANOVA etterfulgt av Bonferroni t-test etter behov. Sammenhengen mellom ekspresjonen av MR og CD34 ble evaluert ved å anvende Cohen Kappa og Kramer Phi-tester. Kaplan-Meier metoden og logrank test ble brukt for å undersøke effekten av ulike variabler på total overlevelse. Ingen multivariat analyse ble utført gitt begrenset utvalgsstørrelsen og den lave andelen hendelser per variabel. Den statistiske analysen er utført ved hjelp av åpen kildekode statistikkpakken R. Alle statistiske tester ble tosidige og utføres ved p på 0,05.
Resultater
kolorektal karsinom pasienter uttrykk for mineralocorticoid Receptor er omvendt korrelert til microvessel Tetthet og dårlig prognose
grunnlags~~POS=TRUNC kliniske karakteristika og informasjon om de 5-års oppfølging av pasienten kohort inkludert i studien er oppsummert i tabell S2.
microvessel tetthet, som evaluert av ekspresjon av endotelial markør CD34, og MR-ekspresjon ble vurdert ved IHC. En representativ mønster av CD34 og MR-ekspresjon i en CRC-prøve sammenlignet med en normal kolon mukosa er vist i fig. 1B og 1A, respektivt. Resultater fra tilsvarende analyser i vevsprøver fra vår pasient kohort, basert på fastsettelse av andelen av både CD34 og MR-positive celler i de ulike medlemmene av denne gruppen, viser at CD34 uttrykk var lav i 12 fag, mellomfag i 2 fag, og høy i 16 fag, mens MR-ekspresjon var lav på 17 pasienter, og høy i 13 fag (Fig. 1). Det var en signifikant invers korrelasjon mellom svulst uttrykk for CD34 og tumor uttrykk for MR (Kramer Phi koeffisient: 0,95, Cohens kappa: -0,844, p 0,001). Uttrykk for både CD34 og MR var forbundet (direkte med p 0,001, og omvendt proporsjonalt med p 0,001, henholdsvis) med tumorstadium inndelt i trinn I og II, i motsetning til stadium III og IV. Blant de andre klinisk-patologisk variabler, ble ingen statistisk assosiert til CD34 eller MR uttrykk.
Spredte fartøy positive for CD34 i lamina propria. (X20) og (A høyre panel) diffust kjerne positivitet for MR i krypter av colonic slimhinnene. (X40). (B) H E: Adenokarsinom av colon, moderat differensiert som vist med hematoksylin-eosin-farging. CD34: Focal positivitet for CD34 i fartøyer som er tilstede i tumoren. MR: Diffuse kjernekraft og cytoplasmatic positivitet for MR i tumorceller. Forstørrelse: (a), x10; (B), x20; (C), x40.
Av log rank test for total overlevelse ble funnet å være relatert til ekspresjon av CD34 (p = 0,006), til ekspresjon av MR (p = 0,021) ( fig. 2), og for hensikten med behandlingen (p = 0,002). Ingen av de andre klinisk-patologiske variabler ble funnet å være assosiert til total overlevelse, men virkningen av tumorstadium på overlevelse var på grensen av omfanget av signifikans (p = 0,054).
VEGFA og VEGFR2 /KDR Expression hemmes av mineralocorticoid Receptor aktivering i en Colon Cancer Avledet cellelinje
for å analysere rollen MR på angiogenese i barnekonvensjonen og i lys av den viktige rollen angiogene faktorer direkte produsert av tumorceller i tumorigenesis, satte vi opp en in vitro modell ved trans HCT116, der endogen en tykktarmskreft cellelinje MR proteinnivået var knapt synlig (fig. 3A, øvre del), med en effektiv MR genuttrykksystem (pchMR plasmid) [25].
(A, øvre panel)
MR uttrykk.
helcellelysater fra villtype og pchMR-transfekterte HCT116-celler ble analysert ved western blot hjelp av anti-MR-antistoffer. Menneskelige nyreceller (HEK293) tjente som positiv kontroll. Humant GAPDH ble anvendt som protein lasting kontroll. Representative Fluoro fra to uavhengige eksperimenter som gir tilsvarende resultater er vist (A, nedre panel)
MR post-translasjonelle modifikasjoner.
PchMR-transfekterte HCT116-celler behandlet i 24 timer med 3 nM aldosteron og /eller 1 uM spironolakton i Mc Coy medium med 10% trekull-strippet FCS. Helcellelysater ble analysert ved Western blot ved anvendelse av anti-MR-antistoffer. MR post-translasjonelle modifikasjoner som induseres av aldosteron behandling er indikert ved den oppadgående skift i mobiliteten av MR. En representant fluorogram fra tre uavhengige eksperimenter med superimposable resultatene er vist (B)
MR avhengig luciferase aktivitet.
PcDNA3-transfektert (grå søyler) eller pchMR-transfektert (hvite søyler) HCT116-celler ble transfektert med pMMTV-Luc uttrykke ildflue luciferase fra en MR avhengig promoter. Cellekultur, aldosteron eller spironolakton behandling og normoxia eller hypoksi forhold er beskrevet i Materialer og metoder. Verdier for ildflue luciferase-aktivitet av aldosteron-stimulert pchMR-transfekterte celler i 10% strippet FCS eller 0,1% FCS, både i normoksisk eller hypoksiske betingelser, ble sammenlignet med de av ustimulerte pchMR-transfekterte kontrollceller, som angir 1. Verdier for ildflue luciferase aktiviteten av pchMR-transfekterte celler i 10% FCS ble sammenlignet med den i pcDNA3-transfekterte kontrollceller, som angir 1. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 4-6). ** P 0,005 og *** p 0,001, vs kontrollceller,
# p 0,001 vs FCS- eller aldosteron-behandlede celler, ANOVA etterfulgt av Bonferroni t-test eller Student t-test når det passer. (C)
MR subcellulære lokalisering
. PchMR-transfekterte HCT116-celler behandlet med aldosteron (3 nM) og /eller spironolakton (1 uM) i 30 minutter og farget med et anti-MR-antistoff (grønn) og DAPI (blå). Bilder ble tatt med et konfokal laser scanning mikroskop.
Vi viste at minst 50% av HCT116 cellene i kultur kan bli rutinemessig transfektert (se
Materiell og Metoder
) og uttrykke MR protein ved betydelige nivåer, som vist ved å sammenligne dem til HEK293-celler, tatt som en positiv kontroll (fig. 3A, øvre del). [31] I tillegg bruker ulike tilnærminger, viste vi at i pchMR-transfekterte HCT116 cellene MR er funksjonelt aktiveres av agonister. Faktisk, etter tilførsel av aldosteron, MR gikk spesielle post-translasjonelle modifikasjoner (fig. 3A, nedre panel), transkripsjonen av et MR-reporter plasmid inneholdende luciferasegenet ble sterkt forbedret (Fig. 3B), og MR ble translokert inn i cellen kjernen med de forventede kinetikk (fig. 3C). Spesielt aldosteron gitt til cellene dyrket i medium som følger med enten 0,1% eller 10% trekull strippet føtalt kalveserum betydelig forbedret nivåene av luciferaseaktiviteten (16 folder i aldosteron-behandlede pchMR-transfekterte celler vs -untreated kontroller). Det bør bemerkes at luciferaseaktivitet ble også aktivert ved å dyrke celler i 10% føtalt kalveserum som naturlig inneholder MR-agonister, noe som medfører en mer fysiologisk tilstand (5 folder i pchMR-transfekterte versus pcDNA3-transfekterte celler) (Fig. 3B). [32] Induksjon av luciferaseaktivitet ved aldosteron behandling, i likhet med det som finnes i transfekterte celler under normoxia, ble også funnet i celler eksponert for å senke oksygenkonsentrasjonen (fig. 3B), tillater oss å teste effekten av MR aktiveringen også i celler dyrket henhold hypoksiske forhold. Vi har også vist at den konkurrerende antagonist spironolakton forårsaket forsvinning av det meste av aldosteron induserte post-translasjonelle modifikasjoner så lenge som induserer i seg selv noen andre spesifikke seg (fig. 3A nedre panel) og i stor grad, men ufullstendig, avskaffet økning i luciferase-aktivitet indusert av aldosteron (fig. 3B). Påfallende, den kjernefysiske translokasjon av MR indusert av aldosteron kunne ikke bli blokkert, men heller ble indusert av spironolakton alene (Fig. 3C).
Funksjonell validering av vår celle modell tillatt oss å undersøke mulige årsakssammenheng mellom MR aktivitet og uttrykk endringer av mRNA som koder for ulike angiogene faktorer både i normoksiske og hypoksisk miljø. Vi demonstrert at, i pchMR-transfekterte HTC116 celler dyrket under betingelser normoksisk, MR aktivering av aldosteron induserer en signifikant reduksjon i VEGF-mRNA-ekspresjon, mens det ikke påvirker de mRNA-ekspresjonsnivåene av andre angiogene faktorer, nemlig bFGF, PGF2 og EGF. Den aldosteron-induserte reduksjon av VEGFA ekspresjon var spesifikt, riktignok delvis hemmet av den konkurrerende MR-antagonist spironolakton (fig. 4). I det hele tatt, disse dataene påpeke VEGFA som en pro-angiogen gen potensielt regulert av MR aktivitet.
Effekter av aldosteron på VEGFA (A), bFGF (B), PGF2 (C) og EGF (D) mRNA nivåer i pchMR-transfekterte HCT116 cellene under normoksisk dyrkningsforhold. Celler ble behandlet med 3 nM aldosteron i 10% strippet FCS i fravær eller i nærvær av 1 uM spironolakton og analyse av mRNA-nivåer ble utført av real-time PCR. For hvert panel, ble mRNA-ekspresjon verdier av behandlede pchMR-transfekterte celler sammenlignet med de av ustimulerte pchMR-transfekterte kontrollceller, som angir 1. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 3). * P 0,05 vs pchMR-transfekterte kontrollceller, ANOVA etterfulgt av Bonferroni t-test
Det er velkjent at hypoksi, en konstant karakteristisk for fast tumor mikromiljøet, induserer sterkt VEGFA ekspresjon.. På disse basene analyserte vi effekten av MR aktivering på VEGFA uttrykk nivåer under lavt oksygenkonsentrasjonen. På dette formålet, vi først demonstrert at, i pchMR-transfekterte HCT116-celler, er nivået av VEGFA mRNA øke etter deres eksponering for hypoksi på samme måte som villtypen HCT116-celler, og at CoCl
2 behandling, som etterligner hypoksi, kraftig øker VEGFA mRNA-ekspresjon i transfekterte celler (fig. 5B og 5A, henholdsvis). Vi viste at reduksjonen av VEGFA uttrykk indusert av aldosteron i pchMR-transfekterte HCT116 cellene under normoxia (fig. 4A) ble også funnet i henhold CoCl
2 behandling eller hypoksiske dyrkningsforhold (Fig. 6A). Disse resultatene er spesielt viktig, siden vi viste at både hypoksi og CoCl
2 behandling øker sterkt VEGFA mRNA-ekspresjon (Fig. 4B). Videre viser vi også at MR aktivering av agonistene naturlig til stede i hele FCS er i stand til å redusere VEGFA mRNA uttrykk begge under normoksisk og hypoksiske betingelser (Fig. 6B).
Real-time PCR-analyse av VEGFA mRNA induksjon i villtype HCT116-celler utsatt for de angitte tider av hypoksi (A) og i pchMR-transfekterte HCT116-celler utsatt for normoxia, hypoksi eller CoCl
2 behandling (B). I panel A, ble verdiene av VEGFA mRNA-ekspresjon for hver prøve sammenlignet med den for tiden 0, angitt som 1. I panel B, ble verdiene av VEGF-mRNA-ekspresjon av pchMR-transfekterte celler eksponert for hypoksi eller CoCl
2 behandling sammenlignet i tillegg til pchMR-transfekterte kontrollceller utsatt for normoxia, angitt som 1. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 3-4). * P. 0,05 ANOVA etterfulgt av Bonferroni t-test
Real-time PCR-analyse av VEGFA mRNA induksjon i (A) pchMR-transfekterte HCT116-celler behandlet med 3 nM aldosteron i nærvær eller i fravær av en pM spironolakton og utsatt for CoCl
2 behandling eller hypoksi og (B) pchMR- eller pcDNA3-transfekterte HCT116-celler dyrket med 10% FCS alene henhold normoksiske og hypoksiske dyrkningsbetingelser. I panel A, ble verdiene av VEGFA mRNA-ekspresjon for hver prøve sammenlignet med de av ustimulerte pchMR-transfekterte kontrollceller, angitt som 1. I panel B, ble verdiene av VEGF-mRNA-ekspresjon av serumaktiverte pchMR-transfekterte celler sammenlignet med de av pcDNA3-transfekterte kontrollceller, angitt som 1. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 3-4). * P 0,05 vs pchMR-transfekterte kontrollceller eller pcDNA3-transfekterte celler, ANOVA etterfulgt av Bonferroni t-test eller Student t-test når det passer
Til slutt, på baser i siste rapportene fra Calvani. og samarbeidspartnere på rollen til KDR uttrykt i HCT116 cellene i å opprettholde celle overlevelse etter eksponering for langvarig hypoksi, vi analysert, i pchMR transfektert HCT116-celler, en mulig årsakssammenheng mellom MR aktivitet og DDF uttrykk endringer. Faktisk disse forfatterne viste at KDR medierer en sen VEGF-avhengig induksjon av HIF-1α, som fører til den autokrine produksjon av VEGFA, siden de kunne inhibere både HIF-1α-induksjon og overlevelse av hypoksiske HCT116-celler, med enten anti-VEGFA eller anti-DDF antistoffer. [21] Således, som et innledende eksperiment demonstrerte vi nærvær av en funksjonell VEGF /KDR /HIF1α autokrin løkke i vårt HCT116-cellelinjen, ved å reprodusere den manglende sen induksjon av HIF-1α ved VEGFA antistoffer i celler dyrket under hypoksiske betingelser (fig. S1).
Vi deretter demonstrert at, i pchMR-transfekterte HCT116-celler, SF-aktivering induserte en betydelig reduksjon i nivåene av KDR mRNA. KDR-mRNA-ekspresjon ble redusert i aldosteron stimulerte pchMR-transfekterte HCT116-celler til omtrent 65% i forhold til deres ikke-stimulerte kontroller (fig. 7A), og i enda større grad i serumstimulert pchMR- transfektert HTC116 sammenlignet med pcDNA3-transfekterte kontroller (fig. 7B ). Påfallende, selv om spironolakton ikke vesentlig endre DDF uttrykk nivåer, det viste seg å reversere bare delvis effekten av aldosteron behandling i pchMR-transfekterte HCT116-celler. Faktisk, selv om det ble observert en tilsvarende reduksjon i KDR ekspresjon i aldosterone- og spironolakton-aldosteron-behandlede celler sammenlignet med kontroller, i det sistnevnte tilfelle reduksjonen var ikke statistisk signifikant (fig. 7A). Grunner som kan forklare ulike spironolakton potens reversere effektene oppstår ved aktiv MR på ulike mål eller i ulike sammenhenger vil bli diskutert nedenfor.
Effekter av aldosteron product: (A)
eller serum product: (B)
på KDR mRNA nivåer.
cellekultur og behandlinger forholdene var som i figur 4, eller figur 6 panel B-Normoxia hhv. Analyser av KDR mRNA-nivåer ble utført ved real-time PCR og resultatene (N = 5) er gitt som i Figur 5. * p 0,05 vs pchMR-transfekterte kontrollceller eller pcDNA3-transfekterte celler, ANOVA etterfulgt av Bonferroni t-test eller student t-test når det passer.
Diskusjoner
Fordi tidligere studier har vist at MR uttrykk er nedregulert i både kolorektal og lunge kreft, har det blitt foreslått at MR kan fungere som en tumor-suppressor genet [23].
Her etablerer vi en link mellom underexpression av MR, redusert pasientens overlevelse og oppregulering av tumor angiogenese ved avansert kreft stadium. Ved hjelp av en in vitro modell basert på et kolon carcinoma cellelinje, hvor vi tvunget MR uttrykk, tilbyr vi også bevis for at aktivert MR kan svekke den uttrykk for VEGFA og dens reseptor 2 /KDR.
En kobling mellom MR ekspresjon og angiogenese i CRC har tidligere blitt foreslått. [22] Her viser vi at omfanget av MR-positive celler er omvendt korrelert til MVD i vevsprøver, støtter hypotesen om at redusert MR uttrykk lanserer en undertrykkende rolle som utøves av MR på tumor angiogenese. Å gi innsikt i den rollen MR i CRC angiogenese, vi viste at re-uttrykk for aktivert MR i en tykktarmskreft cellelinje, preget av en ganske lav MR protein nivå, og dermed etterligne en viktig funksjon til stede i CRC in vivo, fører til en spesifikk nedgang i mRNA-ekspresjon av VEGFA blant annet angiogen faktor analysert, i celler i henhold til normoksisk dyrkningsforhold. Disse dataene gir en direkte demonstrasjon av et undertrykkende rolle av MR i tumorangiogenese drevet av ondartet epitel. Det er bemerkelsesverdig at våre funn i kolon celler er i samsvar med resultatene av en fersk undersøkelse i en transgen musemodell som viser at langsiktig
in vivo
MR overekspresjon, i nærvær av fysiologiske mengde av aldosteron, spesielt downregulated VEGFA genuttrykk i hjertet [33].
lite er kjent om regulering av angiogene vekstfaktorer i vevet under normoksisk forhold.
