Abstract
Mål
Denne studien forsøkte å observere endringer i tumor angiogenese etter oppvarmet Lipiodol (60 ° C) infusjon via leverpulsåren i en kanin modell av VX2 leverkreft.
Materialer og metoder
Tjue kaniner med VX2 leversvulster ble tilfeldig delt inn i 2 grupper (10 kaniner i hver gruppe). Under anestesi ble et trans-kateter hepatisk arteriell infusjon utføres, og Lipiodol (37 ° C; kontrollgruppe) eller oppvarmet Lipiodol (60 ° C, ble behandlet gruppe) ble injisert i hepatiske arteriene i dyrene. Deretter ble forandringer i tumor angiogenese vurdert ved hjelp av følgende markører og metoder. 1. Vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor (VEGFR) og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) ekspresjonsnivåene i tumoren ble vurdert ved hjelp av Western-blotting og real-time kvantitativ polymerasekjedereaksjon (PCR). 2. proliferating cell nuclear antigen (PCNA) uttrykk i svulsten ble vurdert gjennom immunhistokjemisk farging. 3. De morfologiske endringer i tumor vaskulære endotelceller ble observert ved anvendelse av transmisjonselektronmikroskopi (TEM).
Resultater
VEGFR og VEGF mRNA og protein ekspresjonsnivåene ble redusert i den behandlede gruppen sammenlignet med den kontrollgruppe. PCNA-proteinet viste reduserte ekspresjonsnivåer i den behandlede gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. TEM indikerte at endotelceller endoplasmatiske retikulum utvidet, den chondriosome var hoven, og endotelcelle microvilli ble redusert etter oppvarmet Lipiodol infusjon.
Konklusjoner
tumor angiogenese av kaniner med VX2 kreft ble hemmet etter arteriell oppvarmet Lipiodol infusjon sammenlignet Lipiodol infusjon
Citation. Cao W, Xu X, Zhang J, Duan Y (2013) Tumor Angiogenese etter oppvarmet Lipiodol Infusion via leverpulsåren i et Rabbit Modell av VX2 leverkreft . PLoS ONE 8 (4): e61583. doi: 10,1371 /journal.pone.0061583
Redaktør: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA
mottatt: 06.12.2012; Godkjent: 11 mars 2013; Publisert: 24 april 2013
Copyright: © 2013 Cao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Natural Science Foundation National of China (No. 81170400, https://www.nsfc.gov.cn) og Shaanxi-provinsen Science and Technology Development Projection (No.2011K13-01-16; http: //www.sninfo.gov.cn). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kateter chemoembolization (TACE) har blitt akseptert som en av de mest effektive formene for palliativ behandling for pasienter i midten og slutten stadier av leverkreft (HCC) så vel som for de som ikke er gode kandidater for kirurgi i asiatiske land, inkludert Kina [1], [2], [3]. Imidlertid er langsiktig overlevelse etter en TACE prosedyre ikke tilfredsstillende; fem-års overlevelse for tiden varierer fra 9% til 32% [4], [5]. TACE kan redusere tumorstørrelsen [6], [7]. Imidlertid har andre studier funnet TACE å være utilfredsstillende fordi tumorangiogenese kan øke etter TACE, og bare en liten andel av HCCs gikk fullstendig nekrose [8]. Derfor hemme tumor angiogenese etter TACE terapi kan være en lovende strategi for å bedre behandlingseffekt.
Nylig har noen studier brukt thermo å undertrykke tumorvekst i leveren [9] og har bekreftet at behandling med Lipiodol 60 ° C forlenger overlevelsen av kaniner med VX2 kreft ved å hemme tumorvekst. I tillegg påvirker denne behandlingen serum ASAT lik Lipiodol ved 37 ° C [10]. In vivo studier har også vist at oppvarmet saltvannsinfusjon via leverarterien kan endre tumor vaskulær permeabilitet ved å påvirke uttrykket nivåer av VEGF eller VEGFR [11], [12], fordi disse to proteinene er to viktige faktorer som er knyttet til tumor angiogenese [13 ], [14]. Derfor er målet med denne studien var å observere endringer i tumor angiogenese og analysere de underliggende årsakene etter trans-lever-, arteriell, oppvarmet (60 ° C) Lipiodol embolisering via leverpulsåren i en kanin modell av VX2 leverkreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til protokoll godkjent av vår institusjonelle dyr omsorg og bruk komité (2.010.038) og i samsvar med institusjonelle retningslinjer.
dyremodeller
Tjue mannlige New Zealand hvite kaniner (som veier 3,0-3,5 kg, gjennomsnittlig 3,2 ± 0,2 kg) ble valgt tilfeldig fra forsøksdyr sentrum av vårt universitet. VX2 karsinom-celler ble opprettholdt som en tumor linje i vårt laboratorium.
Kaninene ble bedøvet med intravenøs natriumpentobarbital (25 mg /kg). Deretter ble hårene over mageregionen av kaninene fjernet med 8% natriumsulfid, og regionen ble renset med saltvann. En suspensjon av VX2 svulstvev (ca 1,5-2 x 10
6 celler) ble injisert via en 18-gauge nål inn i venstre leverlapp percutaneously med ultralyd veiledning. Såret ble holdt sterile, og kaninen vitale tegn (spesielt frekvensen av åndedrett) ble nøye overvåket under implantasjon. Deretter ble antibiotika (gentamycin, 2,5 mg /kg) injisert intramuskulært etter implantasjon. Dyrene ble observert av sonografi (Acuson Corp., USA) inntil tumorene nådde 2 cm i diameter, og ble deretter brukt for eksperimentering. Ultralyd ble utført av samme operatør med en 7v3c sonde med en frekvens på 7,0 MHz.
Experimental Gruppering
Tjue tumorbærende kaniner ble tilfeldig delt inn i 2 grupper (n = 10 per gruppe) ; hver gruppe fikk en av to preparater.
Kontrollgruppen fikk en sammensetning av Lipiodol (Aulnay Sous-Bios, Frankrike) ved fysiologisk temperatur (37 ° C).
Behandlingsgruppen fikk et preparat oppnådd ved oppvarming Lipiodol til 60 ° C med en konstant temperatur kuvøse.
arteriell Kateterisering
et snitt ble gjort i de bedøvede kaniner å eksponere sin rett lårarterie. Deretter, en mikrokateter (2,7 /2,9 Fr deformerbare type, Terumo, Japan) ble innsatt i lårarterien og plassert inn i den hepatiske arterien under fluoroskopi.
Deretter, under fluoroskopi, perfusjonen preparat (1 mL /body) for hver gruppe ble gradvis hånd injisert i leverpulsåren, med stor forsiktighet for å holde kateterspissen i leverpulsåren og unngå utstrømming av preparatet. Etter intraarteriell injeksjon, ble kateteret fjernet, lårarterien ble ligert, og den operative såret ble lukket. Kaninen vitale tegn, spesielt dens åndedrett sats, ble nøye overvåket under angio-prosedyren. DSA bilder av VX2 levertumor farging ble ervervet før og etter infusjon.
Animal Sacrifice
Ved 24 timer etter tilberedning infusjon, ble dyrene avlivet med en overdose av kloralhydrat.
Immunohistochemistry
Tumor vevsprøver fra hver kanin ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin og innstøpt i parafin. Deretter ble 3- til 5-um-tykke skiver kuttet og behandlet for immunhistokjemisk farging.
For å påvise ekspresjon og plassering av PCNA protein i tumorvev, ble prøveseksjoner inkubert over natten ved 4 ° C med en mus anti-PCNA (Abcam, Cambridge, UK) monoklonalt antistoff og deretter med et anti-muse-sekundært antistoff (Dako) i 30 minutter ved romtemperatur, hvoretter bindingsreaksjoner ble visualisert med 3-30-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB) substrat . Kjernene ble lett kontra med hematoksylin. Immunhistokjemisk farging ble vurdert ved 2 patologer på en blindet måte. Hele delen av hvert bilde ble undersøkt under lysmikroskopi. De PCNA protein nivåer ble gradert i fire grupper: 0, ingen farging; 1+, cytoplasmatisk farge på mindre enn 10% av cellene; 2+, cytoplasma flekker i 10-50% av celler; og 3+, cytoplasmatisk farge i mer enn 50% av cellene
Real Time Kvantitativ Polymerase Chain Reaction
Svulsten prøvene ble samlet inn og lagret i RNAwait (Applygen, Beijin, Kina) på. – 70 ° C etter ble kaninene avlivet. Total RNA ble isolert fra prøvene med TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), og cDNA ble syntetisert fra 1 pg av total RNA med First-Strand cDNA Synthesis Kit (Toyobo, Osaka, Japan). Oligonukleotid-primere for polymerasekjedereaksjon (PCR) ble utført som følger: VEGF, 5′-GCAGAAGAAGGAGACAATAAACC-3 «og 5′-GCACGCAGGAAGGCTTGAATA-3′; VEGFR 5»-CCAGGGAGAAGCAGAGCCAC-3 «og 5′-TGCCAATACCAGCGGATGTG-3′; og β-aktin, 5»-CGAGATCGTGCGGGACAT-3 «og 5′-CAGGAAGGAGGGCTGGAAC-3». PCR reaksjoner ble utført i tre eksemplarer ved hjelp SYBR Grønn Real-time PCR Master Mix (Toyobo). De relative ekspresjonsnivåer av VEGF mRNA ble kvantifisert ved hjelp av to
-ΔΔCt metoden [15].
Western blotting
Prøvene ble lysert i iskald lyseringsbuffer (2 mM EDTA , 10 mM EGTA, 0,4% NaF, 20 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 1% Triton X-100, proteaseinhibitorer, pH 7,5) ved anvendelse av en glasshomogenisator. Proteinkonsentrasjonene ble målt ved anvendelse av bicinchoninic syre (BCA) proteinanalyse (Pierce, Rockford, IL). Proteinene ble separert ved natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til Hybond ECL-nitrocellulosemembraner (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Western blot analyser ble utført ved anvendelse av et anti-VEGFR-antistoff (Abcam, Cambridge, UK) og et anti-VEGF-antistoff (Santa Cruz, CA, USA), og et anti-β-aktin-antistoff ble benyttet som intern kontroll. Deretter ble prøvene inkubert med et arts matchet pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundært antistoff. Blottene ble utviklet med en kjemiluminescens substratoppløsning (Pierce, Rockford, IL) og eksponert for røntgenfilm. De IDVs ble beregnet ved hjelp av en datastyrt bildeanalysesystem (Fluor Chen 2,0) og normalisert til uttrykk av β-aktin.
transmisjonselektronmikroskopi (TEM)
Etter at tumorvev ble oppnådd , urene microvessel fraksjoner isolert fra tumorvev ble valgt og delt inn 1 mm
3 stykker og fiksert med 2,5% glutaraldehyd-4% paraformaldehyd i flere dager ved 4 ° C. Deretter, ved bruk av standard prosedyrer, ble halv tynne og ultra tynne snitt fremstilt og farget med uranyl-acetat og bly-citrat, og endringer i tumor vaskulære endotelceller ble observert ved hjelp av TEM (JEM-1200EX, Jeol, Tokyo, Japan).
Statistiske analyser
Alle resultater er angitt som gjennomsnitt ± SD for hver gruppe. Den t-test ble utført for å sammenligne de to gruppene, og Mann-Whitneys U-test ble brukt for å sammenligne PCNA protein nivåer mellom gruppene. En P-verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 16.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Resultater
DSA Bilde
Etter embolisering, leveren DSA bilder av kaninene i Lipiodol (60 ° C) gruppen viste kontur opasitet i tumor-regionen, et tegn på fullstendig okklusjon av tumorvaskulatur, og de proksimale normale kar i kaniner fortsatt patent (fig. 1).
svulstene viste hypervascularity i leveren som bestemmes med DSA imaging (A, svart pil). Etter Lipiodol (60 ° C) injeksjon, svulstene er helt eller i stor grad de-vaskularisert og vises på DSA som Lipiodol fyller defekt (B, svart pil).
Immunohistokjemiske Funn
Immunhistokjemisk analyser avslørte at PCNA-protein-ekspresjon ble påvist i hovedsak på levedyktige VX2 tumorceller (fig. 2). Vi fant ut at PCNA uttrykk nivåer i den behandlede gruppen var lavere enn i kontrollgruppen (tabell 1)
Som oppdages gjennom immunhistokjemi, ble PCNA protein uttrykk oppdaget hovedsakelig i levedyktige VX2 tumorceller (brun;. A, kontroll 400 ×;.. B, behandlet 400 ×)
sanntids~~POS=TRUNC kvantitativ PCR og Western Blot Funn
Som oppdaget av sanntids kvantitativ PCR (fig 3) , VEGF og VEGFR mRNA-nivåer i den behandlede gruppe var betydelig lavere enn i kontrollgruppen. Western blot-analyser viste at ekspresjonsnivåene av VEGFR og VEGF-proteinet i den behandlede gruppen var også signifikant lavere enn i kontrollgruppen (fig. 3).
relative endringer i VEGFR eller VEGF-protein og mRNA-nivåer i tumorvev ble påvist etter behandling i hver gruppe (n = 10). A og B. VEGFR og VEGF mRNA uttrykk nivåer ble evaluert ved hjelp av sanntids kvantitativ PCR som beskrevet i Materialer og metoder. C og D. VEGFR og VEGF-proteinnivåer ble påvist ved hjelp av Western blot-analyse (øvre panel). β-actin ble oppdaget som en lasting kontroll. VEGFR og VEGF uttrykk nivåer ble kvantifisert gjennom densitometry og plottet som fold endring (nedre panel). Verdiene er presentert som gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter (*
P
. 0,05
vs kontrollgruppe
).
TEM Funn
TEM resultatene viste at den oppvarmede Lipiodol perfusjon indusert vaskulær endotelceller endoplasmatiske retikulum å utvide og chondriosome å hovne opp, og endotelcelle microvilli ble redusert (fig. 4).
Stimulert av oppvarmet ( 60 ° C) Lipiodol perfusjon, TEM-resultatene viste at tumoren endotelcelle mikrovilli redusert (A, 5000 x), den vaskulære endotelcelle endoplasmatiske retikulum utvidet, og det chondriosome ble svellet (B, 10000 x).
Diskusjoner
TACE for svulst de-vaskularisering ble utviklet i 1970 [16]. Foreløpig er TACE den mest brukte primærbehandling for unresectable HCCs og er også den mest brukte behandling for pasienter på venteliste for levertransplantasjon. TACE forsinker betydelig tumorprogresjon [17], men få studier har rapportert en økning i serum VEGF nivåer etter TACE [18]. De høye nivåene VEGF 1-2 dager etter TACE i HCC pasienter er forbundet med fjernmetastaser og negative resultater [19].
Lipiodol har blitt brukt som en bærer av antitumormidler i målrettet kjemoterapi for leverkreft, og Lipiodol er ikke bare brukes til å emulgere medikamenter for TACE, men også anvendt som et middel for embolisering trans-hepatisk arteriell embolisering og for tumor de-vaskularisering [17]. På grunn av at VEGF-proteinet uttrykket i tumorer kan reagere for å varme [11], og de levedyktige tumor vaskulære endotelceller er følsomme for varme skade [20], og massespektrometrisk analyse av stoffet viste at cisplatin ikke blir påvirket av varme [21], og doxorubicin og mitomycin-C er heller ikke degradert ved temperaturer på 60 grader C [21], oppvarmet Lipiodol som en ny embolic middel via leverpulsåren administrasjon kan fordele varmen og bland vanlige TACE narkotika (doxorubicin, mitomycin-C, cisplatin) til hele svulsten og kan påvirke VEGF protein expression nivåer i svulst eller tumor blodkar.
Hindre tumorangiogenese Etter oppvarmet Lipiodol Injection
Etter oppvarmet Lipiodol injeksjon, TEM viste at svulsten endotelceller endoplasmatiske retikulum utvidet, den chondriosome var hoven, og endotelcelle microvilli ble redusert, noe som er tegn på endotelceller skader. Disse skiltene, om enn indirekte støtte varmeeffekten på endotelceller i VX2 svulster; intra-arteriell Lipiodol (60 ° C) injeksjoner viste seg å resultere i tumor kapillær seng ødeleggelse.
Faktisk, selv om varme er toksisk for tumor vaskulære endotelceller, den nøyaktige virkning av varme på cellene varierer med varme omfang og varighet. Alvorlig eller langvarig varme kan endre intracellulære proteiner (for eksempel kollagen denaturering og lipidbilag tining) og indusere celledød; hvis varmen er mild eller kort varighet, kan det føre til en serie av adaptive genetiske endringer i cellene [22].
Oppvarmet Lipiodol perfusjon kan ikke være tilstrekkelig til å indusere tumor vaskulære endotelceller død, men kan føre til en serie av adaptive genetisk eller intracellulære proteiner endringer som endringen av VEGFR-ekspresjon i tumor vaskulære endotelceller. På grunn av at endringen av VEGFR uttrykk er nært knyttet til endringer av endotelial celle morfologi [23], ble det observert morfologiske forandringer i tumor vaskulære endotelceller med TEM etter oppvarmet Lipiodol infusjon. Vi observerte reduksjonen i VEGF og VEGFR mRNA og protein uttrykk nivåer resulterte fra tumor- og endotel-celle responser på det oppvarmede Lipiodol perfusjon fremgangsmåte, henholdsvis. Den reduserte VEGF og VEGFR proteinnivåer kan skyldes svulst angiogenese hemming.
Hindre tumorvekst Etter Oppvarmet Lipiodol Perfusjons
Temperaturer over 42,5 ° C er effektiv på å undertrykke tumor cellevekst [24], men dersom temperaturen er hevet høyere enn 45 ° C, skade på normale leverceller blir irreversibel [24]. Ved å forstå den ikke-homogen fordeling av blodkar, avkjøling av tumorblodstrøm og tumorstørrelsesforskjeller, konkluderer vi med at temperaturen i den oppvarmede Lipiodol inne i tumorer må være minst 43 ° C. I denne studien, for det første vi gradvis hånd injisert under fluoroskopi for å unngå tilbakeløpskjøling i løpet av perfusjon, dernest vi brukte den perkutane matematiske temperatur opptaker for overvåking av perfusjon temperatur, slik at temperaturen i den oppvarmede Lipiodol inne i levervev var ikke mer enn 45 ° C under den oppvarmede perfusjon, og i vår studie proksimale normale kar av kaniner fortsatt patent observert av DSA etter oppvarmet perfusjon.
ved hjelp av immunhistokjemi, observerte vi lav PCNA protein uttrykk i tumorceller etter oppvarmet Lipiodol perfusjon. Ifølge våre PCNA data, behandling med 60 ° C Lipiodol markert hemmet tumorvekst i kaniner med VX2 karsinomer sammenlignet med de som ble behandlet med 37 ° C Lipiodol.
Det er blitt rapportert at tumor angiogenese inhibering forbedrer anti-tumor effekt [25]. Fordi anoxemic tumorceller har vist seg å være mer følsomme for varme enn normale celler [26], [27] og det oppvarmede Lipiodol kan ødelegge svulsten kapillær sengen, kan den oppvarmede Lipiodol holdes tilbake i tumoren, og varmen kan fordeles til de neogenetic kapillærene i hele svulsten. Teoretisk kan mer varme trenge inn i det ekstracellulære rom av tumorceller for å oppnå en øket terapeutisk effekt. De lengre tumor kapillarer forble i området fra 43 ° C til 45 ° C, jo mer helbredende effekt varmen hadde på tumorvev, og deretter resultere i hemning av tumor angiogenese og tumorcellenes vekst.
Begrensninger
Selv om vi forsøkte å bruke en perkutan matematisk temperatur opptaker for overvåking, men vi klarte ikke å måle temperaturen i det oppvarmede Lipiodol i hele svulsten. Viskositeten endring av Lipiodol med økt temperatur og virkningen av viskositet endring på svulst som biodistribusjon endring ble ikke vurdert i vår studie, men vil bli tatt opp i fremtidige studier.
VX2 tumor er godt kjent for å utvikle nekrose som kan endre neovascularization rente, så i denne studien har vi valgt VX2 svulster (14 dager etter implantasjon) for eksperimentell behandling, fordi de VX2 svulster i denne fasen har en forholdsvis stor svulst volum, men liten tumor nekrose og derfor har mindre effekt på neovascularization sats [10], [28].
Konklusjoner
Effektivt hemme tumor angiogenese etter TACE har vært en problemstilling i noen tid. I denne studien fant vi at redusert VEGF og VEGFR proteinnivåer kan skyldes svulst angiogenese hemming hos kaniner med VX2 kreft etter arteriell oppvarmet Lipiodol infusjon, men de kliniske fordelene ved denne tilnærmingen trenger ytterligere evaluering, slik som Lipiodol viskositet endring og biodistribusjon endring med økt temperatur og så videre, bør vurderes. Dermed kan denne studien slutt lette preklinisk forskning, og vi tror at oppvarmet Lipiodol injeksjon kan effektivt behandle avanserte eller tilbakevendende HCCs.
