Abstract
østrogenreseptor (ER) β variant ERβ2 er uttrykt i aggressive kastrering resistent prostatakreft og er blitt vist å korrelere med redusert total overlevelse. Genome-wide uttrykk analyse etter ERβ2 uttrykk i prostatakreftceller avslørt at surstoffmangel var en høy- est over tema. Her viser vi at ERβ2 samhandler med og stabiliserer HIF-1α protein i normoxia, og dermed indusere en hypoksisk genekspresjon signatur. HIF-1α er kjent for å stimulere metastase ved å øke ekspresjon av Twist1 og øke vaskularisering ved direkte aktivering av VEGF-ekspresjon. Vi fant ut at ERβ2 samhandler med HIF-1α og piggybacks til HIF-1α respons element til stede på de proksimale Twist1 og VEGF arrangører. . Disse funnene tyder på at i det minste en del av de onkogene virkningene av ERβ2 medieres av HIF-1α og at målsøking av denne ERβ2 – HIF-1α Interaksjonen kan være en strategi for å behandle prostatakreft
relasjon: Dey P, Velazquez-Villegas LA, Faria M, Turner A, Jonsson P, Webb P, et al. (2015) Østrogen Reseptor p2 induserer Hypoksi underskrift Gene Expression av Stabiliserende HIF-1α i prostatakreft. PLoS ONE 10 (5): e0128239. doi: 10,1371 /journal.pone.0128239
Academic Redaktør: Sonia Rocha, University of Dundee, Storbritannia
mottatt: 26 november 2014; Godkjent: 23 april 2015; Publisert: May 26, 2015
Copyright: © 2015 Dey et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Alle microarray-filer er tilgjengelige fra NCBI Gene Expression Omnibus database (tiltredelse antall GSE35095)
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av The Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) gir HIRP100680 og RP110444, Texas Emerging Technology Fund Avtalen no. 300-9-1958, Robert A. Welch Foundation (Grant E-0004), den svenske Cancer Fund og Marie Curie Actions FP7-PEOPLE-2011-COFUND (VEKST 291 795) via VINNOVA Mobilitetsprogrammet for vekst (til C.W.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesse eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en langsomt progredierende sykdom, først behandles med androgen- deprivasjonsterapi (ADT) [1], men vanligvis tilbakevendende i en mer aggressiv form som er androgen uavhengig [2, 3]. Mest aggressive prostatacancere uttrykker høye nivåer av androgenreseptoren (AR) og, i tillegg, benytter en rekke mekanismer for å aktivere AR i fravær av sin ligand. For eksempel kan kreften tilegne seg evnen til å syntetisere AR ligander, phosphorylate AR eller gjennom alternativ spleising, skape en konstitutivt aktiv AR [4]. I motsetning til dette er uttrykk for hoved isoformen av østrogen reseptor β (ERβ /ESR2), ERβ1, redusert i løpet av prostatakreft progresjon [5-8]. ERβ1 har vist seg å ned-regulere ekspresjonen av AR, så ved uttømming av ERβ1, ekspresjonen av AR er i det vesentlige [9] økt. I tillegg har ERβ1 nylig blitt vist å indusere apoptose i prostata kreftcellelinjer ved å aktivere FOXO3a /Puma sti [10]. ERβ1 har også blitt vist å hemme epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) ved oppregulering prolylhydroksylase domene 2 (PHD2 /EGLN1) og deretter avtagende hypoksi induserbar faktor 1α (HIF-1α /HIF1A) nivåer [11, 12]. Tvert imot, er ERβ spleisevariant ERβ2 [13] uttrykt i sent stadium metastatisk prostata kreft og atom ERβ2 uttrykk korrelerer med redusert samlet overlevelse [14]. ERβ2 inneholder en avkortet ligand-bindende domene (LBD) og en unik C-terminale aminosyresekvens som kodes av et unikt alternativ ERβ2-spesifikk exon kalt cx [13]. Dette ERβ isoform mangler kapasitet til å binde ligand, homodimerize og aktivere kanoniske ERβ1 genekspresjon trasé, men kan heterodimerize med ERα dermed hemme ERα aktivitet [13]. Nuclear ERβ2 øker invasivitet av PC3 celler [14] og øker cellulær proliferasjon og uttrykk for Twist1 (TWIST1) og c-myc (MYC) i både PC3 og 22Rv1 celler, noe som indikerer mulige onkogene roller ERβ2 i prostata kreft [15].
En prolifererende svulsten er ofte utsatt for hypoksisk tilstand, på grunn av sin høyere metabolske behov og mangel på neovakularisering å holde tritt med sine krav. Hypoksi fremmer neuro-endokrine differensiering av prostata tumor, noe som øker dens aggressiviteten [16]. Transkripsjonsfaktoren HIF-1α er en sentral faktor i responsen av cellene til hypoksi. I celler med normalt oksygennivå, er HIF-1α hydroksyleres av prolylhydroksylase, et enzym som bruker oksygen som kofaktor og er aktiv bare under normoksiske betingelse [17]. Prolyl hydroksylering bevirker HIF-1α å samvirke med Von Hippel Lindau faktor (VHL), som fører til ubiquitinering og nedbrytning av HIF-1α av proteasomet komplekset [18-21]. Nylig har flere studier funnet at HIF-1α protein kan stabiliseres uten en reduksjon i oksygenspenningen ved faktorer som virker sammen med oksygenavhengig HIF-1α degradering [22-24]. Etter stabilisering, translocates HIF-1α til kjernen og aktiverer transkripsjon av gener som er involvert i angiogenese. I kreftformer, endringer HIF-1α uttrykket av gener som fører til økt tumor metabolisme og metastasering, og skaper en svært aggressiv svulst. For eksempel, HIF-1α avhengig regulering av Twist1 uttrykk er et viktig steg i metastase [25]. Siden ERβ2 har foreslått onkogen rolle i prostatakreft, og dens spleisevariant ERβ1 er en tumor suppressor kjent for å hemme HIF-1α, vi her undersøkt om ERβ2 kan øke HIF-1α stabilisering, og om denne mekanismen ligger til grunn korrelasjonen av begge faktorer med aggressive, metastasering, prostatakreft.
Materialer og metoder
Reagenser og cellekultur
22Rv1 og PC3 cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). 22Rv1 celler ble holdt i RPMI-1640 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Sigma, St. Louis, Missouri), 25 mM HEPES-buffer og 2 mM L-glutamin (Invitrogen Carlsbad, CA), mens PC3-celler ble holdt i RPMI-1640 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Sigma, St. Louis, MO). Alle forsøkene brukt celler under passasjen 30.
HIG2 luciferase plasmid har blitt beskrevet tidligere [26], PXP2-Twist1-LUC og PXP2-mTwist1-LUC har blitt beskrevet [25].
Anleggs av en induserbar system for ERβ2 og biotin ligase uttrykker PC3 celler (PC3 Bira)
en transposon-basert system medier doksycyklin-regulert uttrykk for ERβ2 ble brukt til å stabilt transfektere 22Rv1 og PC3 prostata kreft celler. Disse cellelinjer er beskrevet andre steder [15]. For konstruksjon av PC3-celler som uttrykker biotin-ligase, ble PC3-celler transfektert med plasmid som uttrykker pBirA
Escherichia coli
biotin holoenzyme syntetase (BIRA) fra den aktin-promotoren og valgt med G418 ved 500 ug /ml. Etter to uker ble kloner isolert og analysert for biotinylering aktivitet.
Protein ekstrakt fremstilling
å fremstille hel-celle-ekstrakter, ble cellene vasket to ganger med PBS, lysert i 10 ganger pakket cellevolum av lysis buffer [0,1% Nonidet P-40, 250 mM KCl, 5 mM Hepes, pH 7,9, 10% (vol /vol) glycerol, 4 mM NaF, 4 mM natriumortovanadat, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM EGTA, 1 mM ditiotreitol, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, proteasehemmer cocktail, PhosStop (Roche, Indianapolis, IN)] i 15 minutter på is og deretter sentrifugert ved 14000 x
g
i 10 minutter.
Western blotting
Tyve mikrogram protein ble applisert på en SDS-PAGE 10% Bis-Tris-gel med Tris-buffer og overført til en nitrocellulosemembran etter elektroforetisk separasjon. Membraner ble blokkert med 5% fettfri tørrmelk i 0,1% TBST buffer og analysert med anti-ERβ2 (produsert i laboratoriet), Twist1 (sc-15393), og HIF-1α (sc-10790) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, California). Primære antistoffer ble brukt på 1: 200-1000 fortynninger, og sekundært antistoff ble brukt på. 1: 10000
RNA ekstraksjon og real-time PCR
RNA ekstraksjon ble utført med Qiagen mRNA utvinning kit i henhold til standardprotokollen. cDNA ble syntetisert fra 1 ug av total RNA med First Strand System i samsvar med standard protokoll (Invitrogen Inc. NY). Real-time PCR ble utført med SYBR Grønn jeg farge mester mix (Applied Biosystems Foster City, California). Primere (Integrated DNA Technologies, Inc. Coral, IA) var: 18s rRNA forover (F), 5′-CCT GCG GCT TAA TTT GAC TCA-3 «og revers (R), 5′-AGC TAT CAA TCT GTC AAT CCT GTC C-3; glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase F, 5»-TGA CAA CTT TGG TAT YCG TGG AAG G-3 «og R, 5′-AGG CAG GGA TGA TGT TCT GGA GAG-3′ (referanse gener); ERβ2 F, 5-ACT TGC TGA ACG CCG TGA CC-3 og R, 5»-CCA TCG TTG CTT CAG GCA A-3 «; Twist1 F, 5»-GGA GTC CGC AGT CTT ACG AG-3 «og R, 5′-TCT GGA GGA CCT GGT AGA GG-3». qPCR reaksjoner ble utført med en 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) under anvendelse av optimaliserte forhold for SYBR grønn I fargestoff-system: 50 C i 2 minutter, 95 C i 10 minutter, etterfulgt av 40-50 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 C i 50 sekunder. Optimal primer Konsentrasjonen ble bestemt i preliminære forsøk, og forsterkning spesifisitet bekreftet av dissosiasjon kurve analyse.
In vitro oversettelse og bakteriell uttrykk
HIF-1α og ERβ2 ble oversatt ved hjelp av TNT Hurtig koblet transkripsjon /oversettelse Systems (Promega Madison, WI). I korthet ble 0,2 ug av HIF-1α eller ERβ2 ekspresjonsvektorer (T7-promoter) ble tilsatt til en alikvot av det TNT Hurtig konsentrat-blanding og inkubert i et volum på 50 ul i 60 minutter ved 30 ° C. Den in vitro-syntese av protein ble bekreftet ved SDS-PAGE. For bakteriell uttrykk BL21-DE3 bakterieceller ble brukt til å uttrykke Hans-LBD-ERα, Hans-LBD-ERβ1, Hans-LBD-ERβ2 og Hans-LBD-ERβ2ΔCX ekspresjonsplasmider.
Trekk ned fra PC3 eller HEK293 celler
PC3 celler ble transfektert med 3 pg Bira (biotin ligase) uttrykk plasmid, 3 ug plasmid som inneholder biotinylering konsensus merket reseptorer B7TEV-ERα, B7TEV-ERβ1, B7TEV-ERβ2 og B7TEV-ERβ5 sammen med 3 ug pcDNA3 HA-HIF-1α «Addgene plasmid 18949» eller pcDNA3 HA-HIF-1α P405 /A-P564 /A «Addgene plasmid 18955» eller pcDNA3 HA-HIF-1α Δ401-603 (pcDNA3 HA-HIF-1αΔODD) beskrevet av Kondo
et al Hotell og Yan
et al
. [27, 28] i en 100 mm kulturplate. For HEK293 celler biotin ligase ble transient transfektert. Etter 48 timer ble cellene skrapet, pelletert og lysert i 300 ul NETN (20 mM Tris (pH = 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40), kort ultralydbehandlet og sentrifugert for å fjerne smuss. 10 ul streptavidin magnetiske kuler (Pierce Rockford, IL) ble vasket i NETN og inkubert med 300 mL celleekstrakt i 2 timer i det kalde rommet. Kulene ble vasket (3 x 10 minutter rotasjon) med 300 ul NETN og kokt med 20 ul 2 x prøvebuffer [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), med 4% SDS, 20% (vol /vol) glycerol, og 0,004 % bromfenolblått] og underkastet SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembran for Western blot. Blottet ble undersøkt med HIF-1α antistoff (Santa Cruz Dallas, TX) 1: 1000 fortynning og sekundært antistoff. 1: 10.000 fortynning
In-vitro nedtrekk
2 ul
i vitro
settes HIF-1α protein ble inkubert med 25 ul av bakteriell lysat inneholdende His-ERβ2 (LBD) over natten, og kompleksene ble adsorbert på nikkel agarosekuler i 2 timer. Perlene ble vasket tre ganger med iskald NETN (20 mM Tris (pH = 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40). Kompleksene ble kokt med 20 pl av 2 x prøvebuffer, utsatt for SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembran for Western-analyser. Blottet ble probet med anti-HIF-1α antistoff (Santa Cruz). Primære antistoffer var på 1: 1000 fortynning, og sekundært antistoff i 1:. 10000
Mammalian to hybrid assay
ERβ2 ble klonet inn i plasmidet som uttrykker Gal4DBD PM2 i ramme med den Gal4DBD domenet ved hjelp av BamHI- og Hindi restriksjonssetene gjør PM2-ERβ2. Den pVP16 plasmid (Clontech) ble anvendt for å klone den N-terminale HIF-1α (aminosyrer 1-401), oksygen destabilisering domene (aminosyrene 401-603) og det C-terminale domene (aminosyrene 603-826) i rammen med VP16 aktivering domene ved å bruke BamHI og PstI restriksjonsseter. For interaksjonsanalyser i PC3 cellene Gal4 responsive reporter FR-LUC 300 ng, PM2-ERβ2 500 ng og VP16 smeltet HIF-1α domener 200 ng ble transfektert hjelp PEI metode for transfeksjon som beskrevet av Longo et al. [29]
microarray og bioinformatiske analyser
Den tofargede komparativ microarray analyse dekker fullt ut kjent proteinkodende transkriptomet av 39.600 utskrifter og varianter ved hjelp av menneskelig OpArray arrays kjøpt fra Mikromatriser Inc. ( Huntsville, AL). Matrisen ble supplert med 133 oligonukleotider spesielt syntetisert for detaljert og robust analyse av kjernereseptorer, spleisevarianter, og coregulators. Den microarray analyse ble utført hovedsakelig som i Richter
et al
. [30]. For hver cDNA-syntese, ble 20 ug av total-RNA som brukes, og hver sammenligning ble replikert og fargestoff byttet. Bioinformatiske analyser ble utført ved hjelp av GenePix, R, og Pathway Studio programvare (Elsevier, Philadelphia, PA). Differensielt uttrykte genene ble definert ved anvendelse av en p-verdi på cut-off av p = 0,005 i kombinasjon med en M-verdi (log2 av fold-endring) cut-off på +/- 0.3. Berikelse analyse av gen ontologi (GO) av de biologiske prosessene ble utført med Fishers eksakte test med programvarens gensettene. Pathway bildene ble utformet i Pathway Studio. Microarray data er tilgjengelig i NCBI Gene Expression Omnibus under tilgjengelighetsnummeret GSE35095.
Chromatin Immunpresipitasjon (chip)
Under konfluent PC3 og 22Rv1 celler (90%) ble dyrket i en 150 mm tallerken og vasket to ganger med kald PBS og deretter fiksert i PFA (1%) i 10 minutter. Cellene ble vasket to ganger med kald PBS + proteaseinhibitor, skrapes med 150 ul resuspensjon buffer og sentrifugert (4000rpm, 10 minutter). Pelletene ble resuspendert i 750 ul ChIP lysis buffer (HEPES 50 mM, NaCl 140 mM, Triton 1%, protease-inhibitor) og cellene holdt på is i 30 minutter. Cellelysater ble ultralydbehandlet (60 pulser, 30 sekunder hver) med 30 sekunder brytes ved 4 ° C. Etter ultralydbehandling, ble 25 ul prøver innsamlet og lagret ved -20 ° C (inngang). Resten av 125 mL cellelysat fraksjonen ble brukt til følgende trinn. Prøvene ble pre-absorbert på 20 ul av G-proteinkoblet FLAG kodede magnetiske kuler ved 4 ° C i 2 timer og supernatanten oppsamlet. Prøvene ble deretter delt i to fraksjoner og antistoffer mot FLAG (2,5 ug) eller IgG (2,5 ug) ble tilsatt og inkubert over natten. Den neste dag, ble kulene vasket tre ganger med Chip lyseringsbuffer, en gang med Chip vaske høy saltbuffer (HEPES 50 mM, NaCl 500 mM, Triton 1%), og til slutt en gang med Chip vaskebuffer (Tris 10 mM, LiCl 250 mM, NP40 0,5%, EDTA 0,1 mM). Kulene ble resuspendert i 40 ul elueringsbuffer (50 mM Tris, SDS 1%, EDTA 10 mM) og inkubert ved 65 ° C natten over med et lite hull på hetten. Inngangs oppsamlet tidligere ble også plassert ved 65 ° C. Den neste dag ble prøver ble renset ved anvendelse av PCR-rensesett (Qiagen) og anvendt for qPCR-analyse ved å bruke de følgende primere. pHRE-Twist1 promoter (F) 5′-CGGGGGAGGGGGACTGGAAAGC-3 «; (R) 5»-AGGCCTCCTGGAAACGGTGCCG-3 «, VEGF-promoter: (F) 5′-ACAGACGTTCCTTAGTGCTGG-3′; (R) 5»-AGCTGAGAACGGGAAGCTGTG-3 «.
statistikker
Verdiene er uttrykt som gjennomsnitt med 95% konfidensintervall. En uparet tosidige
t
-test ble brukt til å sammenligne forskjellene mellom to grupper. Betydningen er presentert som *
p
0,05, **
p
0,005, og ***
p
0,001, og ikke-signifikante forskjeller presenteres som NS.
Resultater
Microarray og bioinformatiske analyse av prostata kreft celler uttrykker ERβ2 viser økt uttrykk av gener involvert i hypoksisk svar
Vi har tidligere vist at ERβ2 økt uttrykk for EMT-assosierte gener Twist1 og Slug (SNAI2) i prostatakreftceller [15]. Her utførte vi en transcriptomic studie for å undersøke effekten av ERβ2 på en objektiv måte. Vi sammenlignet PC3 celler som stabilt uttrykker ERβ2 med kontrollceller, og fant 585 gener for å bli vesentlig endret ved hjelp av vårt definert cut-off. Interessant, TGFB2, som er kjent for å bli stimulert av HIF-1α, var blant de mest sterkt oppregulert gener (nesten 9 ganger, ifølge microarray). Analysere anrikning av genet ontologi kategorier blant de regulerte gener, «
svar på hypoksi
«var den nest mest høy- est over funksjon (p = 8.0e-6), andre bare til» genekspresjon «(tabell 1). The «
Response til hypoksi
gruppen inkluderte 17 betydelig regulerte gener (TGFB2, EGLN1 (PHD2), EGLN3 (PHD3), SMAD3, HSD11B2, CAT, 2CCl, CDKN1B, MMP13, PLOD2, IL1B, Plau, SCNN1G , CRYAB, IL18, ITPR1, SOD2, ADM). I tillegg er det anrikede sub-nettverk, definert som genene blir ekspresjon mål for den respektive node, «naboer av HIF-1α» var den mest høy- est over en (p = 1.5e-09) med 41 regulerte medlemmer (tabell 2). Videre ble mange ERβ2-induserte gener funnet å være involvert i angiogenese (tabell 2), som også var en høy- est over tema (p 0,05). Av disse genene er SOD2, SCNN1G, CD24, HIG2, IGF2 og TGF-β2 alle stimulert av HIF-1α [26]. Også «
glukose metabolisme prosessen»
som HIF-1α er kjent for å regulere, ble overrepresentert (p 0,007), inkludert 9 gener (PFKP, akt1, IGF2, GOT2, PGM 5 avgis, CRYAB, GBE1, UGP2, FABP5). Dermed blir microarray analyse tydelig angitt hypoksi og HIF-1α funksjon som store temaene i ERβ2 funksjon (se S1 figur for validerte gener).
For å validere disse data, analyserte vi uttrykk for HIF-1α i PC3 og en annen prostatakreft-cellelinje-22Rv1, som begge er overuttrykkende ERβ2. Vi observerte en økning i HIF-1α protein nivå i ERβ2 uttrykke versus kontrollceller, men ingen endringer i tilsvarende mRNA nivå (fig 1A-1D). Dette stemmer med våre microarray resultater, som ikke registrerer endring i HIF-1α transkripsjonsnivå, men indikerte en endring i HIF-1α funksjoner (basert på anrikede trasé). Videre ble ERβ2 avhengig økning i HIF-1α protein nivåer bekreftet å være ledsaget av ERβ2 avhengig økning i HIF-1α aktivitet. Luciferaseaktiviteten av en reporter drevet av HIF-1α avhengig hypoksi induserbar gen 2 (HIG2 /HILPDA) promoter (HIG2-A-luc) [26] ble økt i nærvær av transfekterte ERβ2 ekspresjonsvektor (figur 2A-2C). I en tidligere studie viste vi at ERβ2-uttrykker PC3 cellene har økt nivå av Twist1 [15]. Her viser vi at ERβ2 økte også aktiviteten av et luciferase reporter drevet av HIF-1α-avhengige promotor Twist1 i LNCaP prostatakreftceller, og at denne effekten var avhengig av HIF-1α responselement (fig 3A-3C). Dette viser at HIF-1α aktivitet generelt er forbedret i prostata celler som uttrykker ERβ2.
A. Western blot av ekstrakter fra kontroll og to forskjellige 22Rv1 og PC3 kloner uttrykker ERβ2 analysert med HIF-1α antistoff. B. Den relative mRNA-ekspresjon av ERβ2 og HIF-1α i ERβ2clones av 22Rv1 cellelinje. Grafen viser data ganger endring sammenlignet med kontrollgruppen (gjennomsnitt tre separate forsøk (verdier ± S.E.M..) Beregnes ved hjelp av Student
t
-test, * p≤0.016). C. Relativ mRNA ekspresjon av HIF-1α i ERβ2 # 2 klon av det 22Rv1 cellelinje. Grafen viser data ganger endring sammenlignet med kontrollgruppen (gjennomsnitt tre separate forsøk (± SEM) beregnes ved hjelp av Student
t
-test, ** p≤0.006).
A. Skjematisk skisse av HIG2 promoteren konstruksjon hvor (X) representerer sekvensen av HIF-1α responselementer (HRE). B. Økende mengde av transient transfektert ERβ2-ekspresjonsplasmid inn i PC3-celler suksessivt aktiverer transient transfektert HIG2 promoteren som vist ved luciferase-assay av HIG2-A-LUC. Grafen viser dataene som en økning i luminescens fra celler transfektert med økt konsentrasjon av ERβ2 (gjennomsnitt av tre separate eksperimenter (verdier ± S.E.M..) Beregnet ved bruk av Student «s
t
-test, *** p≤0.0002). Sammenligning av konsentrasjoner-0μg til 1000 mikrogram. C. Tilsetning av ekspresjonsplasmid for HIF-1α aktiverer HIG2 promoter i PC3 cellelinjer. Grafen viser data som en økning i luminescens av celler transfektert med HIF-1α (gjennomsnitt av tre separate forsøk (± SEM) beregnes ved hjelp av Student
t
-test, **** p≤0.0001).
A. Beskrivelse av Twist1 promoter konstruksjoner brukt. B. LNCaP-celler transfektert med Twist1-promoter-luciferase reporter og økende konsentrasjon av ERβ2 ekspresjonsplasmid. Grafen viser dataene som en økning i luminescens fra celler transfektert med økt konsentrasjon av ERβ2 (gjennomsnitt av tre separate eksperimenter (verdier ± S.E.M..) Beregnet ved bruk av Student «s
t
-test, ** p≤0.0034). C. Transfeksjon av Twist1-promoter-luciferase reporter med (Twist) eller mutert (mTwist) HIF-1α respons element sammen med ekspresjonsplasmider for HIF-1α eller ERβ2 i LNCaP celler. Grafen viser data som en økning i luminescens av celler transfektert med økt konsentrasjon av ERβ2 (gjennomsnitt av tre separate forsøk (± SEM) beregnes ved hjelp av Student
t
-test, **** p≤0.0001, # ## p≤0.002).
ERβ2 direkte samhandler med HIF-1α forårsaker stabilisering
Siden ERβ2 øker uttrykket av HIF-1α protein, men ikke mRNA, vi spekulert i at HIF-1α stabilisering skjer via protein-protein interaksjon mellom ERβ2 og HIF-1α. For å teste denne hypotesen, festet vi bacterially uttrykt LBDs av ERα, ERβ og ERβ2 til en solid støtte og bestemt interaksjoner med
in vitro
oversatt HIF-1α. HIF-1a sterkt bundet til ERβ2, men ikke til tilsvarende mengder av villtype ERα eller ERβ LBDs. Denne interaksjonen var uavhengig av ERβ2 spesifikke sekvenser på grunn avkutting av aminosyrer kodet for av ERβ2 spesifikke exon ikke eliminere HIF-1α binding (ERβ2ΔCX) (figur 4A). Trekk ned av biotin-merket ERs uttrykt i PC3-celler viste spesifikk interaksjon av transfektert HIF-1α med ERβ2 og ERβ2ΔCX og bare en beskjeden samhandling med ERβ1 (fig 4B). Siden ERβ5 har den samme aminosyre-sekvens, og er avkortet ved den samme aminosyre som ERβ2, dvs. bare de små C-terminale peptider som er forskjellig mellom de to variantene bestemte vi oss for å teste denne varianten og undersøke dets interaksjon med HIF-1α. Som vist i figur 4B, interagerer sterkt med ERβ5 HIF-1α.
A. Hans-merket LBD-ERβ2 trekke ned med nikkel agarose perler av
in vitro
oversatt HIF-1α i forhold til Hans-merket LBD-ERα, Hans-merket LBD-ERβ1, Hans-merket LBD-ERβ2 og His tagget ERβ2ΔCX TNT er kjørefelt med bare kombinert retikulocyttlysat. B. Ekspresjon av biotin ligase Bira, HA-HIF-1α, og den N-terminale biotin konsensus peptid smeltet reseptor konstruerer B7TEV-ERα, B7TEV-ERβ1, B7TEV-ERβ2, B7TEV-ERβ5, og B7TEV-ERβΔCX i PC3 celler. Celleekstrakter ble deretter utsatt for nedtrekk med streptavidin magnetiske kuler og proteiner separert med SDS-PAGE etterfulgt av deteksjon med HIF-1α antistoff.
Oksygen destabiliserende domene (ODD) av HIF1α er ikke nødvendig for interaksjon med ERβ2 og ERβ5
for å undersøke, hvis oksygen destabiliserende domenet av HIF-1α var nødvendig for samhandling med ERβ2 vi konstruert et uttrykk plasmid av HIF-1α med aminosyrer 401-603 slettes som beskrevet tidligere [31] . Vi co-immunopresipitert dette domenet slettet HIF-1α med biotinylert ERβ2 og ERβ5. Som kan sees i figur 5A den HIF-1α med slettet ODD (Δ401-603) samvirker så sterkt som villtype indikerer at ODD domenet er unnværlig for interaksjonen. For å kartlegge samspillet ytterligere vi brukte pattedyr to-hybrid analysen hvor N-terminalen, ODD domene og C-terminalen av HIF-1α ble smeltet til VP16 og transfektert inn i PC3 cellene sammen med Gal4DBD smeltet ERβ2 og en reporter med Gal4 bindingssteder i foran luciferase. Som kan sees i figur 5B interaksjonen skjer fortrinnsvis med den N-terminale ende av HIF-1α.
A. PC3 celler transfektert med plasmider som uttrykker GFP, HIF-1α, HIF-1α ΔODD, Bira (biotin ligase), ERβ2 og ERβ5 med N-terminal biotinylering konsensus. Komplekser ble trukket ned med streptavidin magnetiske kuler. Trukket ned HIF-1α og HIF-1α ΔODD ble oppdaget ved hjelp av anti-HIF-1α antistoff. B. Transfeksjon av 200 ng av FR-luciferase alene, med 500 ng PM2-ERβ2 og 300ng av enten VP16-N-term HIF-1a (aminosyrer 1-401), VP16- ODD HIF-1a (aminosyrer 401-603) eller VP16-C-term HIF-1α (aminosyrer 603-826). Måling av luciferase aktivitet 24 timer etter transfeksjon.
Det er vel kjent at proliner 405 og 564 av HIF-1α i henhold normoxia er hydroksylerte av prolin hydroksylaser (PhD) og deretter godkjent av VHL faktor og senere målrettet for degradering [32]. Vi ønsket å finne ut om ERβ2 og ERβ5 interaksjon med HIF-1α er avhengig hydroksylering av disse proliner slik at samspillet vil også oppstå under normoksisk forhold. I figur 6, viste vi at WT og P405 /A-P564 /A mutert HIF-1α samhandle sterkt med ERβ2 uavhengig av ødeleggelse av Prolyl- hydroksyleringsmønstre nettsteder som tyder på at samspillet oppstår både under normoxia og hypoksi.
PC3 celler transfektert med GFP, HIF-1α, HIF-1α P405 /A-P564 /A, Bira (biotin ligase), ERβ2 og ERβ5 med N-terminal biotinylering konsensus. Komplekser ble trukket ned med streptavidin magnetiske kuler.
ERβ2 rekrutteres til HIF-1a respons elementer av Twist1 og VEGF arrangører
Til slutt, vi utforsket om ERβ2 kan binde til HIF -1α respons elementer ved hjelp av chip qPCR. Vi har registrert økte nivåer av ERβ2 rekruttert på HIF-1α responselementer på HIF-1α avhengig Twist1 og VEGF arrangører i både PC3 og 22Rv1 celler. Imidlertid ikke ERβ2 ikke bindes til promoterene fra den klassiske østrogenrespons element i pS2-genet (figur 7A og 7B).
I PC3-celler (A) og 22Rv1-celler (B) som uttrykker doksycyklin-regulert ekspresjon ERβ2 binder denne ERβ isoform til HRE (HIF-1α respons element i Twist1 promoter) og VEGF promoter (HIF-1α respons element i VEGF promoter), men ikke til PS2 (ERE) promoter. Spon qPCR resultatene er vist med en ikke-spesifikk IgG og et spesifikt anti-M2-FLAG-antistoff immunutfelling. ERβ2 binding anriket bare i HIF-1α responselement inneholdende Twist1 og VEGF-promotorer, men ikke i den pS2 promoter som mangler HIF-1α responselement. Grafen viser data som en økning i binding av FLAG til Twist1 (pHRE) og VEGF promoter (gjennomsnitt av tre separate forsøk (± SEM) beregnes ved hjelp av Student
t
-test, * p≤0.028, # # p≤0.041 (PC3 celler) og ** p≤0.0049, ## p≤0.0481 (22Rv1 celler).
i konklusjonen, våre funn tyder på at ERβ2 binder seg til og stabiliserer HIF-1α og videre er co-rekruttert til viktige HIF-1α elementer i HIF-1a regulerte gener dermed styrke aktiviteten til HIF-1α under normoksisk forholdene i prostatakreftceller.
Diskusjoner
Response av normal vev til hypoksi er avgjørende for riktig vascularization og for påfølgende blodtilførselen til oxygenate og gi næring til vevet. en voksende svulst blir hypoksisk når nå flere som 1mm i størrelse [33]. den umiddelbare respons på hypoksi er en redusert Prolyl- hydroksylering av HIF-1α fører til økt stabilisering av dette protein. dette er fordi VHL, som induserer ubiquitinylation og etterfølgende nedbrytning av HIF-1α henhold til normoksisk betingelser, ikke kan binde seg til HIF-1α i fravær av prolyl-hydroksylering. Stabilisering av HIF-1α tillater regulering av gener som er involvert i angiogenese, slik som VEGF, som utskilles fra svulsten, tiltrekker endotelceller ved å binde seg til sine overflate VEGF-reseptorer og dermed gir økt tumor vaskularisering og vekst. HIF-1α øker også uttrykket av gener som er involvert i glykolysen, for å tilpasse svulsten til å overleve under forhold med lavt oksygen [34], og gener involvert i invasjon og metastasering som Twist1 [25].
Expression of ERβ2 korrelerer med dårligere prognose i prostata kreft [14] og ERα negativ brystkreft [35], men mulige onkogene handlinger ERβ2 blir ikke forstått. Vi viser her at det er en sterk korrelasjon mellom ERβ2 ekspresjon og HIF-1α proteinnivået, men ikke mRNA-nivået i prostata cancer cellelinjer PC3 og 22Rv1. ERβ2 øker aktiviteten av HIF-1α avhengige arrangører og rekrutteres til de Twist1 og VEGF arrangører, sannsynligvis med tethering til HIF-1α. Sammen funnene som er beskrevet ovenfor tyder på at HIF-1α medierer den oncogene effekt av ERβ2 gjennom en ikke-klassisk signalveien hvori ERβ2 binder seg til, og stabiliserer HIF-1α henhold til normoksisk betingelser. Dette er i tråd med andre studier som viser at HIF-1α samspill proteiner stabil HIF-1α ved å blokkere nedbrytningen [22-24].
Overraskende, selv om vi fant at ERβ1 ikke interagerer effektivt med HIF-1α, korrelere med sin manglende evne til å indusere HIF-1α responsive gener, er den unike siste ekson av ERβ2 ikke nødvendig for HIF-1α bindende. Angivelig, avkutting av ERβ1 C-terminalen eksponerer et nytt protein overflaten mediere interaksjon med HIF-1α.
Det gjenstår å vise om ERβ2 uttrykk korrelerer med nivåer av Twist en eller annen HIF-1α målgener i klinisk prøver. En fersk studie av Ragnum et al. [36] viser at androgen-deprivasjon terapi (ADT) fører til en redusert uttrykk av mange gener knyttet til hypoksi. Vi foreslår at uttrykk for ERβ2 eller ERβ5 kan motvirke effekten av ADT på hypoksi bundet gener i en prostata svulst, og dermed føre til kastrering motstand som resulterer i et dårligere utfall. Faktisk våre funn av ikke-hypoksisk stabilisering av HIF-1α tyder på at det kan være mulig å utvikle et lite molekyl å forstyrre ERβ2 og ERβ5-indusert HIF-1α stabilisering for anvendelse i terapi av visse aggressive former for prostatakreft. En oversikt over de beskrevne funnene er vist i figur 8.
Forslag til modell for hvordan ERβ2 stabiliserer HIF-1α og rekrutteres til VEGF og Twist1 arrangører.
I konklusjonen, uttrykk for den ERβ varianter ERβ2 og ERβ5 har tidligere vist seg å korrelere med aggressiv prostatakreft.
