Abstract
Samler bevis tyder på at makrofager aktivere mesenchymale stamceller (MSC) for å skaffe seg pro-inflammatorisk fenotype. Men rollen som MSC aktiveres av makrofager i magekreft er fortsatt i stor grad ukjent. I denne studien, har vi funnet at MSC ble aktivert av makrofager for å produsere økte nivåer av inflammatoriske cytokiner. Cell kolonidannelse og Transwell migrasjon analyser avslørte at supernatanter fra de aktiverte MSC kunne fremme både mage epitelceller og magekreft celleproliferasjon og migrasjon. I tillegg ble ekspresjon av epiteliale-mesenchymale overgang (EMT), angiogenese, og stemness-relaterte gener økning i aktiverte MSC. De fosforylerte formene for NF-kB, ERK og STAT3 i mage celler ble økt med aktive MSC. Inhibering av NF-kB-aktivering av PDTC blokkerte virkningen av aktiverte MSCer på mage kreftceller. Samtidig injeksjon av aktiverte MSC med magekreftceller kan akselerere magekreft vekst. Videre humane perifere blod monocytter avledet makrofager aktiveres også MSC til å spørre magekreft celleproliferasjon og migrasjon. Til sammen våre funn tyder på at MSC aktivert av makrofag kjøpe pro-inflammatorisk fenotype og rask magekreft vekst i en NF-kB avhengig måte, noe som gir nye bevis for modulering av MSC av svulstens mikromiljø og ytterligere innsikt til rollen stromal celler i magekreftutvikling og kreft progresjon
Citation:. Yang T, Zhang X, Wang M, Zhang J, Huang F, Cai J et al. (2014) Aktivering av stamceller av makrofager Tekster Menneskelig Gastric Cancer vekst gjennom NF-kB Pathway. PLoS ONE 9 (5): e97569. doi: 10,1371 /journal.pone.0097569
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan
mottatt: 18 februar 2014; Godkjent: 21 april 2014; Publisert: 13. mai 2014
Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den store forsknings Plan of Natural Science Foundation National of China (Grant nr 91129718), Stiftelsen National Natural Science of China (Grant nr. 81302119, 81201660, 81071421), Jiangsu-provinsen for fremragende Sci-tech Innovation team i Høyskoler og universiteter (Grant no. SJK2013-10), Jiangsu-provinsen prosjekt av vitenskapelig og teknologisk innovasjon og prestasjoner Transformation (Grant no.BL2012055), Jiangsu-provinsen utestående Medisinsk faglig leder og Sci-tech Innovation teamet Program (Grant no.LJ201117), Foundation Natural Science i Jiangsu-provinsen (Grant no.BK2012709, BK20130540), Program Foundation Doctoral of State Kunnskapsdepartementet (Grant nr. 20113227110011), Jiangsu-provinsen for Natural Scicence Research in Høyskoler og universiteter (13KJB320001). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de hyppigst forekommende kreftformer og holder en vesentlig årsak til kreftdødelighet over hele verden [1], [2]. I Kina er det ca 360 000 personer dør av magekreft hvert år [3]. Selv om forekomsten har gått ned de siste årene i Vesten, er fortsatt verre overlevelse [4]. I løpet av de siste tiårene har stor innsats blitt utøvd å belyse patogenesen av magekreft. Imidlertid er den komplekse mekanismen for magekreft fremdeles avdekket. Samle bevis indikerer at langvarig kronisk betennelse er en av de viktigste årsakene til tumorigenesis. Frigjøring av proinflammatoriske mediatorer og økte lokale nivåer av oksygen og nitrogen arter kan bidra til kreftutvikling [5]. Den feilregulert produksjon av cytokiner i inflammatorisk mikromiljøet stimulerer uttrykket av gener assosiert med kreftutvikling og modifiserer strukturelle trekk av mikromiljøet for å akselerere kreft initiering og progresjon [6] -. [9]
Tumor mikromiljøet består av ulike stromale celler , inkludert infiltrere immunceller, carcinoma-assosiert fibroblaster (kafeer), mesenchymale stamceller (MSC), og blod og lymfatiske vaskulære nettverk. Disse cellene kommuniserer med hverandre og utgjør inflammatoriske mikromiljøet og bidra til tumorgenese [10], [11]. Blant de stromale celler, makrofager, som viktige immun regulatoriske celler, spiller en dominerende rolle i forvaltningen av betennelse i svulstens mikromiljø. For eksempel, makrofager isolert fra tumor-mikromiljøet av brystkreftpasienter hemmelige kjemotaktiske cytokiner for å forsterke metastaser av karsinom celler [12]. Makrofager har også blitt vist å fremme inflammatorisk respons og tumorigenesis gjennom innvirkning på ekspresjon av inflammatoriske cytokiner og endre den molekylære onkogene programmer innenfor epitelceller [13].
stamceller (MSC) er en annen hovedkomponent av tumoren mikromiljøet og er ansett som forløpercellene kreft forbundet mesenchymale celler og endotelceller [14]. De tidligere studier har indikert at MSC hemmelige løselige faktorer for å fremme kreftcelle proliferasjon og metastase [10]. I en betennelse-assosiert magekreft modell, kan MSC aktiveres mot kafeer å øke kronisk betennelse og kreft progresjon [15]. Videre MSC har blitt rapportert å rekruttere monocytter /makrofager til å fremme tumorvekst i et CCR2-depedent måte [16]. Interaksjoner mellom makrofager og MSC produsere et aktivert, pro-inflammatoriske fenotype med høy CXCL10 og IL-6-sekresjon, som kan påvirke inflammatoriske mikromiljøet [17].
Magekreft er en klassisk modell for kronisk inflammasjon til kreft. Imidlertid er rollen til MSC aktiveres ved macrophage i magekreft og den underliggende mekanisme er fremdeles i stor grad ukjent. I denne studien, har vi funnet at MSC ble sterkt aktivert av makrofager i henhold inflammatorisk tilstand, for å produsere inflammatoriske cytokiner og tumor-fremmende faktorer, som fører til forbedring av gastrisk epitelial celle og cancer celleproliferasjon og migrering gjennom aktivering av NF-kB pathway. Våre resultater tyder på at makrofager-aktiverte MSC fremme magekreft vekst og progresjon i henhold betennelsestilstand.
Materialer og metoder
Cell Culture
Menneskelig magekreft cellelinje HGC-27, menneskelig gastrisk epitelial cellelinje GES-en, og menneskelig akutt monocytic leukemi cellelinje THP-1 ble kjøpt fra institutt for biokjemi og cellebiologi ved Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). GES-1 og THP-1-celler ble dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen), og HGC-27-celler ble opprettholdt i høy-glucose DMEM (H -DMEM, Invitrogen) med 10% FBS. MSC var avledet fra navlestreng og dyrket i lav glukose DMEM (L-DMEM, Invitrogen) med 10% FBS. Celler ble alle inkubert ved 37 ° C i fuktig cellekultur inkubator med 5% CO
2. Den ferske navlestreng vev ble samlet fra friske barseltids mødre etter skriftlig informert samtykke ble innhentet. MSC ble isolert og karakterisert som tidligere beskrevet [18]. Alle forsøksprotokoller ble godkjent av etikkomiteen i Jiangsu University. MSC ved passering 3 ble valgt for forsøkene.
Overstående Forberedelse
For utarbeidelse av makrofag forbundet MSC supernatant, MSC (3 × 10
5) ble sådd til følge. THP-1-celler (1:01 forhold) ble tilsatt til friskt medium i nærvær eller fravær av LPS (1 pg /ml). Etter ko-dyrking i 48 timer ble mediet fjernet og cellene ble forsiktig vasket med PBS for å fjerne THP-1-celler. Supernatantene fra aktiverte MSC ble samlet 24 timer senere, filtreres med et 0,22 um filter og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Når den brukes for cellefunksjonsanalyser, ble supernatantene fra aktiverte MSC blandet med like stort volum av 10% FBS-inneholdende H-DMEM eller RPMI-1640 medium. For signalveien analyser ble cellene behandlet med supernatantene fra aktiverte MSC i 1 time
Luminex analysen
Menneskelig cytokin chemokine magnetiske kuler panelsett (# HCYTOMAG-60K) (Millipore, Billerica, MA, USA) ble utviklet for å påvise granulocytt-kolonistimulerende faktor (G-CSF), blodplateavledet vekstfaktor-BB (PDGF-BB), monocytt kjemotiltrekkende protein- 1 (MCP-1), tumornekrosefaktor-α (TNF-α), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), IL-10, IL-1β, IL-4, IL-6 og IL-8 i supernatanten fra aktiverte MSC. Alle prosedyrer ble behandlet i henhold til produsentens anvisninger. Signalene ble registrert og analysert ved hjelp av Luminex200 System (Millipore).
Transwell Migration Assay
Etter behandling med supernatanten fra aktiverte MSC i 48 timer, GES-1 og HGC-27-celler ( 1 x 10
5 /brønn) ble satt inn i det øvre kammer (8 um) (Corning, NY, USA) i serumfritt medium. Den komplette medium ble plassert i det nedre kammer. Etter inkubering i 12 timer, ble cellene igjen ved bunnen av polykarbonatmembran tørkes av med bomullspinner. Cellene migrerer til den nedre overflate av membranen ble deretter fiksert med metanol i 30 minutter. De migrerte celler ble farget med krystallfiolett i 15 min og tellet i seks tilfeldig felt under mikroskopet (100 x).
cellekolonidannelse Assay
Celler ble samlet opp etter behandling med supernatanter fra MSC i 48 timer og sådd ut i 6-brønns plater (1000 celler /brønn) og dyrket i 10 dager. Mediet ble skiftet hver tredje dag. Ved slutten av vekstperioden ble cellene fiksert med metanol i 30 minutter og farget med krystallfiolett i 15 min. Celle kolonier ble fotografert og antall kolonier ble regnet for statistisk analyse.
RNA Utvinning og Real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner . Fem mikrogram RNA ble brukt for kvantitativ real-time PCR-analyse. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Sekvensene av spesifikke primere ble alle oppført i tabell S1.
Western Blot
Celler ble lysert og homogenisert i RIPA buffer supplert med komplett proteasehemmere. Lik mengde av proteiner (200 ug) ble oppløst i 12% SDS-PAGE. Proteinene ble deretter overført til PVDF-membraner etter elektroforese. Etter blokkert i 5% (vekt /volum) fettfri melk i 1 time ved romtemperatur ble membranene deretter inkubert ved sine respektive hensiktsmessige fortynninger av spesifikke primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Kildene til primære antistoffer var: anti-Oct4, anti-Sox2, anti-vimentin og anti-fosfor-STAT3 (Signalway antistoff, USA), anti-GAPDH (Kangcheng, Shanghai, Kina), anti-E-cadherin, anti- ERK1 /2, anti-fosfo-ERK1 /2 og anti-N-cadherin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-PCNA, anti-STAT3, anti-NF-kB, anti-fosfo-NF-kB kB, anti-CyclinD1, anti-VEGF og anti-C-Jun (BioWorld Technology, Louis Park, MN, USA), anti-C-myc (ProteinTech Group, Chicago, IL, USA).
Animal modell
Tre til fem uker gamle BALB /c nakne mus ble kjøpt fra SLAC Laboratory Animal senter (Shanghai, Kina). Dyrene ble opprettholdt i henhold til institusjonelle retningslinjer, og alle studiene ble utført med godkjenning av Universitetet komité for bruk og vedlikehold av dyr av Jiangsu University. HGC-27-celler (1 x 10
6) og MSC (5 x 10
5) ble trypsinert, vasket og resuspendert i 200 ul PBS, respektivt. Deretter ble cellene blandet og ko-injisert inn i den venstre flanken av nakne mus. Svulster ble kirurgisk fjernet 20 dager etter injeksjon, fotografert og vektet. Tumorstørrelse ble vurdert av skyvelære måling og beregnes på grunnlag av den modifiserte ellipsoiden formel (L × B × W /2), hvor L representerer lengde, og W representerer bredde.
Immunohistochemistry
formalin faste parafininnstøpte musetumor vevssnitt ble først deparaffinized i xylen, rehydrert gjennom gradert etanol. Seksjonene ble kokt i 10 minutter i citrat-buffer (pH 6,0, 10 mM) for antigen gjenfinning. Den endogen peroksidase-aktivitet ble inhibert med eksponering til 3% hydrogenperoksid i 10 minutter. Deretter ble seksjonene blokkert med 5% BSA (BOOSTER Bioengineering, Wuhan, Kina) og inkubert med passende fortynnet PCNA eller VEGF primært antistoff ved 37 ° C i 1 time. Etter å ha vasket med PBS, ble seksjonene deretter inkubert med sekundært antistoff fortynnet i 20 min. Endelig seksjonene ble visualisert med 3,3′-diaminobenzidin (DAB) og deretter kontra med hematoksylin for undersøkelse ved lysmikroskopi (200 ×).
primære humane monocytter Isolation
Humanmonocytter ble oppnådd fra buffy coat fra perifere blodprøver donert av frisk donor hjelp av Ficoll (Histopaque-1077) (Sigma, USA). Frisk RPMI 1640 supplert med 10% FBS ble endret etter 2 dager, og ikke-adherente celler ble fjernet og renset. Monocyttene ble inkubert i 7 dager og 50 ng /ml M-CSF ble tilsatt for å oppnå makrofager (M). Deretter 24 h supernatant utskilt av makrofager ble oppsamlet og filtrert. Adherente MSC ble behandlet med makrofagen supernatanten i fravær eller nærvær av LPS (1 pg /ml) i 48 timer og vasket. Supernatantene fra aktiverte MSC ble samlet 24 timer senere, og brukes for å følge studier.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble gjort med SPSS statistikk programvare 16,0. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD. Forskjeller i ulike grupper ble analysert ved hjelp av enveis ANOVA. Forskjeller mellom PDTC behandlinger ble testet av
t
test. Statistiske
P
verdi 0,05 ble ansett å være betydelig
Resultater
Co-kultur med Makrofager Under betennelsestilstand oppregulert Expression av inflammatoriske cytokin og Stemness Genes i. MSC
for å undersøke effekten av makrofagene på MSC i henhold inflammatorisk tilstand, vi ko-dyrkede MSCer med THP-1-celler i fravær eller nærvær av LPS (1 pg /ml) i 48 timer. THP-1-celler ble fjernet ved vasking PBS og de adherente MSC ble dyrket i friskt medium i ytterligere 24 timer (figur S1). Luminex Analysen ble utført for å bestemme nivåene av flere inflammatoriske forhold i supernatantene fra MSC. Resultatene viste at produksjonen av IL-6, IL-8, TNF-α, MCP-1, VEGF og G-CSF var signifikant økt i supernatanten fra MSC ko-dyrket med THP-1-celler i nærvær av LPS. Lave eller ikke målbare nivåer av disse cytokiner ble observert i MSC som ikke var co-kultivert med THP-1 celler (Figur 1a). For å bekrefte den økte ekspresjonen av disse inflammatoriske cytokiner, vi forhåndsdannet real-time PCR for å detektere mRNA-nivåer av disse cytokiner. Vi har funnet at i samsvar med de Luminex analyseresultatene (figur 1B), ko-kultur med THP-1-celler oppregulert i mRNA-nivåer av IL-6, IL-8 og TNF-α i MSC. For å avgjøre om co-kultur med THP-1 celler påvirker stemness av MSC, vi har oppdaget uttrykk for Oct4 og Sox2 i MSC ved hjelp av Western blot. Resultatene viste at både Oct4 og Sox2 proteinnivåer ble økt i MSCer som ble ko-dyrket med THP-1-celler (figur 1C). For ytterligere å bekrefte dette fenomenet, vi også undersøkt mRNA nivåer av Oct4 og Sox2 i MSC. Resultatene av real-time PCR viste at co-kultur med THP-1 celler oppregulert uttrykk for OCT4 og Sox2 gener i MSC (figur 1D). Generelt har disse resultatene tyder på at MSC var signifikant aktivert for å produsere høyere nivåer av inflammatoriske cytokiner ved ko-dyrket THP-1-celler under inflammatorisk tilstand.
(A) Luminex analyse for IL-6, IL-8, TNFa, MCP-1, VEGF og G-CSF-nivåene i supernatantene fra MSC. (B) Real-time PCR-analyser av IL-6, IL-8, TNFa, MCP-1, VEGF og TGF-β mRNA-ekspresjon i MSC. ***
P
0,001, **
P
0,01, *
P
0,05. (C) Western blot analyser av OCT4 og Sox2 proteinnivåer i MSC. (D) Real-time PCR-analyser av Oct4 og Sox2 mRNA uttrykk i MSC. ***
P
0,001, **
P
0,01, *
P
. 0,05
Macrophages- aktivert MSC Forbedret spredning og migrasjon av Gastric Epitelceller
Makrofager og MSC er viktige komponenter i svulstens mikromiljø. For å demonstrere de funksjonelle roller av makrofager-aktiverte MSCer, samlet vi supernatanten fra aktiverte MSC og inkubert med gastrisk epitelcellelinje GES-1 i 48 timer. Vi utførte cellekolonidannelse assay for å evaluere proliferasjon av GES-1-celler. Som vist i figur 2A, blir cellene inkubert med supernatanten fra aktiverte MSCer vokste hurtigere og dannet flere og større kolonier enn de i andre grupper. I tillegg inkubering med supernatanten fra aktiverte MSC også økt proteinnivåer PCNA og VEGF i GES-1-celler (figur 2B). Resultatene av transwell migrasjonsanalyse viste at antallet migrerte GES-1-celler i aktivert MSC pluss LPS gruppe var mer enn det i andre grupper (figur 2C). Resultatene av Western blot-analyser viste at makrofager aktiveres MSCer øket ekspresjonen av mesenchymale cellemarkører (N-cadherin og vimentin) og redusert ekspresjon av epitel cellemarkør (E-cadherin) i GES-1-celler (figur 2D). Vi neste fastsatte uttrykk for VEGF, MMP9 og TGF-β ved hjelp av real-time PCR. Som vist i figur 2E, inkubering med supernatanten fra Aktivering av MSC pluss LPS gruppe oppregulert ekspresjonen av VEGF, MMP9 og TGF-β i GES-1-celler. Dermed MSC aktiveres av makrofager i inflammatorisk miljøet betraktelig fremmet gastrisk epitel celleproliferasjon og migrasjon.
(A) Representative bilder av celle kolonidannelse analysen og histogram av kolonien nummer. Resultatene ble angitt som middelverdi ± SD fra tre brønner. **
P
0,01, *
P
0,05. (B) Western blot analyser for PCNA og VEGF protein nivåer. (C) Representative bilder av transwell migrasjonsanalyse og histogram over antallet migrerte GES-1 celler. Forstørrelse, × 100, skala bar = 50 mikrometer. ***
P
0,001, **
P
0,01, *
P
0,05. (D) Western blot analyser for E-cadherin, N-cadherin og vimentin proteinnivåer. (E) Real-time PCR-analyser av VEGF, MMP9 og TGF-β mRNA uttrykk. **
P
0,01, *
P
. 0,05
Makrofager-aktiverte MSC fremmet vekst og migrasjon av magekreft Cells
Siden makrofager-aktiverte MSC påvirke mage epitelcelleproliferasjon og migrasjon, vi neste fastsatte effekten av makrofager-aktiverte MSC på menneskers mage kreft HGC-27 celler. Resultatene av celle kolonidannelse analyse viste at HGC-27 celler inkubert med supernatanten fra makrofager-aktiverte MSCer vokste fortere og det dannet seg større kloner enn de andre gruppene (figur 3A). Western bolt analyser viste at protein nivåer av PCNA og VEGF i HGC-27-celler var signifikant oppregulert av supernatanten fra makrofager-aktiverte MSC (figur 3B). Transwell migrasjon analyse viste at antallet migrerte HGC-27-celler ble påfallende økt med supernatanten fra makrofager-aktiverte MSC (figur 3C). Western blot analyser viste at makrofager-aktiverte MSC indusert uttrykk av mesenchymale cellemarkører (N-cadherin og vimentin) og hemmet uttrykket av epitelceller markør (E-cadherin) i HGC-27 celler (Figur 3D). MRNA nivåene av VEGF, MMP9 og TGF-β ble også øket i HGC-27-celler etter behandling med supernatanten fra makrofager-aktiverte MSC (figur 3E). Tatt i betraktning at kreftcelle stemness er sterkt knyttet til migrasjon, vi har oppdaget uttrykket av stemness gener i HGC-27 celler. Uttrykket av Oct4 og Sox2 var spesielt oppregulert av supernatanten fra makrofager-aktiverte MSC (Figur 3F). I samsvar med real-time PCR resultater, ble proteinnivåer Oct4 og Sox2 også økt i HGC-27 celler ved supernatanten fra makrofager-aktiverte MSC (Figur 3G). I korte trekk, tyder disse resultatene på at makrofager aktiveres MSC også fremmes magekreft cellevekst, migrasjon gjennom induksjon av EMT og celle stemness henhold inflammatorisk tilstand.
(A) Representative bilder av celle kolonidannelsesbestemmelsen og histogram av koloni nummer. Resultatene ble angitt som middelverdi ± SD fra tre brønner. *
P
0,05. (B) Western blot analyser for PCNA og VEGF protein nivåer. (C) Representative bilder av transwell migrasjonsanalyse og histogram over antallet migrerte HGC-27-celler. Forstørrelse, × 100; skala bar = 50 mikrometer. ***
P
0,001, **
P
0,01. (D) Western blot analyser for E-cadherin, N-cadherin og vimentin proteinnivåer. (E) Real-time PCR-analyser av VEGF, MMP9 og TGF-β mRNA uttrykk. ***
P
0,001, *
P
0,05. (F) Western blot analyse for OCT4 og Sox2 proteinnivåer i HGC-27 celler. (G) Real-time PCR-analyser av Oct4 og Sox2 mRNA uttrykk. **
P
0,01, *
P
. 0,05
makrofager-aktiverte MSC Fremmes Gastric celleproliferasjon og migrasjon gjennom NF-kB Pathway
for å utforske den mekanismen som er ansvarlig for å fremme rollen som makrofager-aktiverte MSC i celleproliferasjon og migrasjon, bestemt vi uttrykket av flere viktige signal transdusere for betennelse og kreft, inkludert STAT3, ERK og NF-kB, i gastriske epitel-celler og magekreftceller. Resultatene av Western blot-analyser viste at nivåene av p-STAT3, p-ERK og p-NF-kB var signifikant høyere i GES-1-celler behandlet med supernatanter fra aktiverte MSC enn de i andre grupper. Proteininnholdet av NF-kB hadde ingen endring, mens det av ERK og STAT3 litt redusert (figur 4A). Økningen i p-STAT3, p-ERK og p-NF-kB proteinnivåer ble også observert i HGC-27-celler etter behandling med supernatanter fra de aktiverte MSC (figur 4B). Vi har bekreftet den oppregulering av p-STAT3, p-ERK og p-NF-kB proteinnivåer av supernatantene fra de aktiverte MSC i en annen magekreft cellelinje SGC7901 (figur S2). For å avgjøre om nedstrøms målgener ble også aktivert i HGC-27 celler, undersøkte vi uttrykket av Cyclin D1, C-myc og C-Jun proteiner. Som vist på figur 4C, ble proteinnivået av Cyclin D1 og C-Jun forhøyet etter behandling med supernatanter fra de aktiverte MSCene.
(A) GES-1 og (B) HGC-27 celler behandlet med supernatantene for aktiverte MSC. Ekspresjonen av p-STAT3, STAT3, p-ERK, ERK, p-NF-kB, og NF-kB-proteiner ble bestemt ved hjelp av Western blot. (C) Western blot-analyser for Cyclin D1, C-myc og c-Jun proteinnivåer i HGC-27-celler. (D) Western blot-analyser for p-NF-kB og NF-kB proteinnivåer i HGC-27-celler som ble behandlet med supernatanter fra de aktiverte MSCene i nærvær eller fravær av PDTC (100 nM). Antallet cellekolonier (E) og migrerte celler (F) for HGC-27 celler behandlet med forskjellige MSC-supernatanter i nærvær eller fravær av PDTC (100 nM). (G) Real-time PCR-analyser av VEGF, MMP9, og TGF-β mRNA-ekspresjon i HGC-27 celler behandlet med forskjellige MSC-supernatanter i nærvær eller fravær av PDTC (100 nM). **
P
0,01, *
P
. 0,05
Å fremtiden avgjøre om NF-kB spiller en stor rolle i funksjonene aktiveres MSC, HGC-27-celler ble forbehandlet med PDTC å inhibere NF-kB fosforylering og deretter inkubert med supernatanter fra de aktiverte MSCene. Vi har funnet at induksjonen av NF-kB fosforylering av aktiverte MSC i HGC-27-celler ble markert hemmet av PDTC (figur 4D). Resultatene av celle kolonidannelse og Transwell migrasjons analyser viste at den forbedrede proliferasjon og migrering av HGC-27-celler ved de aktiverte MSC ble signifikant redusert i PDTC-behandlede grupper (figurene 4E og 4F). Videre PDTC behandling også hemmet oppregulering av VEGF, MMP9 og TGF-β av aktiverte MSC i HGC-27-celler (figur 4G). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at de aktiverte MSC rask mage epiteliale celle og magekreft celleproliferasjon og migrasjon gjennom NF-kB.
makrofager-aktiverte MSC Fremmes Gastric Cancer Vekst in vivo
Gitt bevis for at makrofager-aktiverte MSC kan forbedre mage celleproliferasjon
in vitro
, vi lurte på om disse MSC utøves fremme rolle i magekreft vekst
in vivo
. Dermed vi co-injisert HGC-27 celler med de aktiverte MSC i nakne mus. Tyve dager senere ble tumorvev fjernet, målt og veiet. Som vist på figurene 5A og 5B, er xenograft tumorer i aktivert MSC-co-injiserte gruppen var større enn de i andre grupper. Immunhistokjemiske analyser ble utført for å bestemme ekspresjon av vekstrelaterte proteiner og pro-angiogene faktorer i tumorvev. Jo sterkere positiv farging av PCNA og VEGF ble observert i aktivert MSC co-injisert gruppe (figur 5C). Sanntids-PCR-analyser ble utført for å påvise ekspresjon av VEGF, MMP9 og TGF-β i tumorvev. Vi fant at uttrykket av alle disse genene i co-injisert gruppene var høyere enn i HGC-27 celler alene (Figur 5D). Resultatene av real-time PCR-analyser viste at mRNA-nivåer av Oct4, Sox2 og Sall4 var den høyeste i aktivert MSC co-injisert gruppe (figur 5E). I sammendraget, disse dataene indikerer at makrofager-aktiverte MSC rask magekreft vekst
in vivo
.
(A) Representative bilder av xenograft tumor vev og (B) volumet og vekten av svulst vev fjernet fra mus injisert med HGC-27-celler alene eller sammen med MSC. (C) Immunhistokjemisk analyser av PCNA og VEGF proteinnivået i tumorvev. Forstørrelse, × 200; skala bar = 50 mikrometer. (D) Real-time PCR-analyser av VEGF, MMP9, og TGF-β mRNA uttrykk i tumorvev. ***
P
0,001, **
P
0,01, *
P
0,05. (E) Real-time PCR-analyser av Oct4, Sox2, og Sall4 mRNA uttrykk i tumorvev. ***
P
0,001, **
P
0,01, *
P
. 0,05
Primær Monocytter aktivert MSC til spør gastric Cancer Cell Proliferation og migrasjon gjennom NF-kB
for ytterligere å bekrefte aktiveringen av MSC av makrofager til å be magekreft celleproliferasjon og migrasjon, isolert vi monocytter fra humant perifert blod og samlet supernatanten fra monocytter differensiert makrofager. Etter inkubasjon med supernatanten fra monocytter, makrofager differensierte, ble MSCer høstet og total RNA ble ekstrahert for real-time PCR-analyser. Som vist på figur 6B, behandling med supernatant fra monocytter, makrofager differensiert oppregulert i mRNA-nivåer av IL-6, IL-8, MCP-1, og VEGF i MSC. Vi deretter inkubert magekreftceller med supernatanten fra aktiverte MSCene. Resultatene av celle kolonidannelse og Transwell migrasjons analyser viste at supernatanten fra aktiverte MSCene forbedre proliferasjon og migrering av HGC-27-celler (figurene 6C og 6D). Vi har videre vist at inkubering med supernatanter fra de aktiverte MSCene økt ekspresjon av p-STAT3, p-ERK og p-NF-kB i HGC-27-celler (figur 6E). Samlet utgjør disse data tyder på at det i samsvar med THP-1 celler, humane primære makrofager aktiveres også MSC til å spørre magekreft celleproliferasjon og migrasjon gjennom NF-kB.
(A) Real-time PCR-analyser av IL-6, IL-8, MCP-1, og VEGF mRNA-ekspresjon i MSC. ***
P
0,001, **
P
0,01, *
P
0,05. (B) Representative bilder av cellekolonier og histogram av kolonien nummer. Resultatene ble angitt som middelverdi ± SD fra tre brønner. **
P
0,01, *
P
0,05. (C) Representative bilder av transwell migrasjonsanalyse og histogram over antallet migrerte HGC-27-celler. Forstørrelse, × 100; skala bar = 50 mikrometer. **
P
0,01. (D) Western blot analyser for p-STAT3, STAT3, p-ERK, ERK, p-NF-kB, og NF-kB proteinnivåer i HGC-27 celler.
Diskusjoner
i løpet av de siste tiårene, har koblingen av betennelse til kreft tiltrakk seg mye oppmerksomhet [5], [6]. Langvarig eksponering av epitelceller til inflammatorisk mikro fører til malign transformasjon [9], [19]. De stromale celler har vist seg å være kritisk involvert i utviklingen av betennelse til kreft ved å modulere inflammatoriske mikromiljøet [7], [8]. Makrofager og MSC er to viktige komponenter i tumor stroma og deltar i regulering av graden av inflammatorisk reaksjon i løpet av karsinogenese [16]. Men samspillet mellom makrofager og MSC i magekreft har ikke vært godt karakterisert.
Magekreft utvikles fra langvarig kronisk gastritt og er en klassisk modell av betennelse-relaterte kreft. Vi har tidligere isolert bosatt MSC fra menneskelige mage kreft vev og viste at magekreft vev avledet MSC utskilt mange inflammatoriske cytokiner og fremmet magekreft progresjon. Under prosessen med betennelse, monocytter /makrofager kan bli rekruttert til å gi gave til MSC med tumor-fremme egenskaper [16]. I tillegg
Helicobacter pylori
indusere kronisk betennelse i epitelceller mage celler gjennom utgivelsen av LPS som eksisterer i sine cellevegger. I denne studien vi forhåndsbehandlet MSCer med makrofager i nærvær av LPS for å etterligne magekreft mikromiljøet og for å bestemme om makrofager-aktiverte MSC bidra til magekreft progresjon. Vi demonstrerte at MSC inkubert med makrofager og LPS utskilt høyere nivåer av inflammatoriske cytokiner. En fersk studie rapporterte at kontinuerlig stimulering med makro kondisjonert medium induced MSC om å kjøpe en pro-inflammatorisk fenotype [17]. I samsvar med sin studie fant vi at kort tid inkubasjon med makrofager aktiveres også MSC å produsere høyere nivå av inflammatoriske cytokiner.
Epitelial-mesenchymale-overgang (EMT) er en betydelig prosess i løpet av kreft metastase [20]. I løpet av årene har reprogrammerings egenskaper relatert til EMT blitt tilskrevet for å forbedre cellulært plastisitet i kreftceller. Kreft stamcelle har blitt introdusert og vist seg å bidra til tumorgenese og tumormetastase [21] – [24]. Nyere studier tyder på at en undergruppe av stilk-lignende og mesenchymale-lignende celler viste en større tumorigenicity i mage epitelceller
in vitro og in vivo product: [25]. I denne studien, har vi funnet at aktiverte MSC, som var ko-dyrket med makrofager i nærvær av LPS, kan bemerkelsesverdig øke migreringen av mage-epitelceller samt magekreftceller.
