Abstract
En allment akseptert paradigme innen kreft biologi er at solide tumorer er uni-forfedrenes er avledet fra en enkelt grunnlegger og dens etterkommere. Men data har vært jevnt påløper som indikerer tidlige svulster hos mus og mennesker kan ha en multi-forfedrenes opprinnelse som en initiert primogenitor forenkler transformasjon av nabo co-genitors. Vi har utviklet en ny mus modell som tillater bestemmelse av klonal arkitektur av tarmsvulster
in vivo Hotell og
ex vivo
har validert denne modellen, og deretter brukte den til å vurdere klonal arkitektur adenomer , intramucosal karsinomer og invasive adenokarsinomer av tarmen. Andelen av multi-doms svulster ikke signifikant endring som svulster gått fra adenomer med lavgradig dysplasi [40/65 (62%)], for å adenomer med høygradig dysplasi [21/37 (57%)], for å intramucosal Kreftsvulster [10/23 (43%]), til invasive adenokarsinomer [13/19 (68%)], som indikerer at klonen som følge av primogenitor fortsetter å eksistere sammen med kloner som følge av co-genitors. Videre neoplastiske celler fra forskjellige kloner innenfor et multi-anen adenocarcinom har også blitt observert for samtidig å invadere inn i den underliggende muskulatur [2/15 (13%)]. Dermed intratumoral heterogenitet som oppstår tidlig i tumordannelse vedvarer gjennom tumorigenesis
Citation. Zahm CD, Szulczewski JM, Leystra AA, Paul Olson TJ, Clipson L, Albrecht DM, et al. (2016) Avansert intestinal cancer ofte Opprettholde en Multi-Ancestral Architecture. PLoS ONE 11 (2): e0150170. doi: 10,1371 /journal.pone.0150170
Redaktør: Kwong-Kwok Wong, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, UNITED STATES
mottatt: 6 oktober 2015; Godkjent: 10 februar 2016; Publisert: 26 februar 2016
Copyright: © 2016 zahm et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/) av National Institutes of Health (R01 CA123438 til RBH, P30 CA014520 til University of Wisconsin Carbone Cancer Center, P30 DK058404, prekliniske modeller for Digestive Diseases Core, Vanderbilt Digestive Diseases Research Center, P50 CA095013, translasjonell patologi og Imaging Core, Vanderbilt GI SPORE, K08 CA84146 til ATT, T32 CA009135 til CDZ og AAL, og T32 CA090217 til TJPO) og oppstart midler fra University of Wisconsin-Madison Seksjon for gastroenterologi og Hepatology, Department of Medicine, og School of Medicine og folkehelse til RBH
Konkurrerende interesser.: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Den heterogenitet av svulster har blitt anerkjent i flere tiår. Neoplastiske celler i en enkelt svulst varierer i flere skjelnes egenskaper, inkludert differensiering tilstand, formeringshastigheten, metastatisk potensial, og terapeutisk respons. Historisk, ble to modeller for å forklare intratumoral heterogenitet foreslått. Den klonal evolusjon modell hevder at forskjellige subkloner oppstå fra en enkelt forløper som en følge av molekylære forandringer, etterfulgt av seleksjon for ulike microenvironments innenfor et tumor [1]. I motsetning til dette, anfører kreft stamcelle-modell som en liten populasjon av stamceller som stammer fra en enkelt forløper er ansvarlig for tumor vedlikehold, men avkommet kan skille på flere ulike måter [1]. I begge modellene, to viktige forutsetninger er at svulster er uni-forfedrenes, stammer fra en enkelt grunnlegger, og at en subklon slutt vil akkumulere mutasjoner som driver metastaser til andre organer.
Data har vært jevnt påløper for en tredje modell av intratumoral heterogenitet: faste tumorer kan ha en multi-anen arkitektur [2]. Vi har vist at arvelige og carcinogen-induserte tarmsvulster i laboratoriet mus kan være avledet fra flere erne [3, 4]. Våre funn er i samsvar med de til et annet laboratorium som viser at arvelige og sporadiske kolorektale svulster hos mennesker kan være multi-doms i arkitektur [5, 6]. Således, i motsetning til en utbredt akseptert paradigme innen kreft biologi, kan solide svulster har en multi-anen sted følgelig være heterogen likesom de nettopp begynner å dannes.
innledende studier med dyremodeller hovedsakelig som grunnlag på aggregering chimeras. Slike mus ble samlet ved å smelte sammen tidlige embryoer. Typisk er en embryo båret Rosa26 avstamning markør som uttrykker p-galaktosidase, slik at celler fra denne embryo flekk blå i nærvær av 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid, mens celler fra de andre embryo forbli hvit. Svulster som er heterotypic, sammensatt av blå og hvite neoplastiske celler, har en multi-forfedrenes opprinnelse. Bruken av aggregering kimærer har gitt ny innsikt i de tidlige stadier av tumorigenesis. Dessverre har dette kraftige eksperimentelle verktøy noen betydelige begrensninger. Generering av aggregering kimærer er svært tidkrevende og kostbart, så det antall dyr som ble analysert er ofte lavt. Den klonal arkitekturen i en hvilken som helst svulst kan bestemmes bare etter en lengre fargeprosedyre som inkluderer to fikseringstrinn og en inkubering over natten ved 37 ° C. Fargingen er ofte ufullstendig fordi substratet skal diffundere inn i svulsten; følgelig ikke alle svulster kan scores. Videre de tøffe forholdene forby enhver påfølgende molekylære analyser.
I denne studien har vi utviklet en ny musemodell som gjør at klonal arkitekturen i tarmsvulster skal fastsettes
in vivo Hotell og
ex vivo
, validert denne modellen, og deretter brukte den til å bestemme klonal arkitektur intestinal cancer. Resultatene støtter ideen om at adenomer har en multi-forfedrenes opprinnelse, og at dette tidlig mangfoldet vedvarer som svulster overgang fra en godartet til ondartet tilstand.
Metoder
Mus stammer og generering av mosaikk mus
Dyrestudier studier~~POS=HEADCOMP ble utført under protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Wisconsin i samsvar med retningslinjer fastsatt av Office of Laboratory Animal Welfare ved National Institutes of Health. C57BL /6J (B6), FVB /NJ (FVB), B6.Apc
Min /J-mus som var heterozygote for
Min
allel av
adenomatøs polypose coli genet product: (
Apc
Min /+), og B6.129 (Cg) -Gt (ROSA) 26Sor
TM4 (ACTB-tdTomato, -EGFP) Luo /J-mus som var hemizygous for mT /mg reporter ble hentet fra The Jackson Laboratory. FVB /N-Tg
(Fabp1-Cre) 1Jig mus hemizygous for Fabp1-Cre transgenet i hvilken promotoren fra rotte fettsyrebindende protein er kondensert til genet som koder for Cre rekombinase, noe som resulterer i mosaikk ekspresjon av Cre før ferdigstillelse av tarm morphogenesis, ble hentet fra National Cancer Institute Mouse Repository på Frederick. Beholdning av disse stammene ble opprettholdt av søsken kors og tilbakekryssing med B6 eller FVB mus som ble importert hver femte generasjon. Avkom ble genotypet ved hjelp av DNA isolert fra tå klipp for PCR som beskrevet av leverandørene av dyr.
En mus som bærer
Min
allel av
Apc
ble identifisert i laboratoriet av Dr. William F. Dove ved University of Wisconsin følgende mutagenese med ethylnitrosourea [7, 8]. Grunnleggeren og dens avkom presenteres med bleke føtter på grunn av blodtap fra svulster i tarmen [7]. Tumor mangfold, vekst og progresjon i
Apc
Min /+ mus er avhengig av genetisk bakgrunn. B6
Apc
Min /+ mus utvikler i gjennomsnitt 100 tarmsvulster og vanligvis dø ved 150 dagers alder [7]. Svulster er initiert etter tapet av APC aktivitet i intestinale epitelceller kort tid etter fødselen, og de er nesten alltid godartede adenomer [9-13]. I motsetning (SWRxB6) F1
Apc
Min /+ hybrider utvikle noen svulster og lever vanligvis et år eller mer [14]. Svulstene i disse musene er ofte invasive kreftformer som tidvis metastaserer til regionale lymfeknuter, antagelig på grunn av økt levetid [14].
Eksperimentelle mus ble generert ved første passering B6
mT /mg
hunnene til B6
Apc
Min /+ menn å generere B6
Apc
Min /+;
mT /mg
mus som deretter ble krysset til FVB
Fabp1-Cre
mus til å generere (FVBxB6) F1
Apc
Min /+;
Fabp1-Cre
;
mT /mg
hybrider. Eksperimentelle F1 hybrider fikk lov til alder til 150 dager eller til døende å vurdere klonal arkitektur av svulster på ulike stadier.
Fluorescence endoskopi
Fluorescence endoskopi ble utført ved hjelp av en modifisert Karl Storz Coloview system som tidligere beskrevet [15, 16]. I korthet, mus ble bedøvet med isofluran og gitt en klyster for varm PBS for å fjerne enhver avføring. Endoskopet ble innsatt omtrent fire centimeter og deretter langsomt trukket tilbake ved hjelp av en Optotronics diodepumpet faststofflaser satt til 437nm ved en effekt på 100 mW som lyskilde. Video ble samlet under hele prosedyren og stillbilder ble tatt til fange av hver svulst. Mus fikk lov til å våkne opp etter inngrepet.
Video og stillbilder ble behandlet med Fiji pakke med ImageJ å visualisere normale og dysplastiske krypter uttrykker grønt fluorescerende protein.
Imaging av hele mounts
intestinalkanaler ble fjernet intakte ved obduksjon, åpnet i lengderetningen, skyllet med PBS, fiksert i 4% paraformaldehyd i 4 timer og lagret ved 4 ° C i 70% etanol. Tynntarmen, cecum og tykktarm ble montert i 0,4% agarose i PBS og avbildes for å fange rød fluorescens (mT; tdTomato) og grønn fluorescens (mg; EGFP) ved anvendelse av enten et Zeiss mikroskop ved 12.5x og eller Nikon mikroskop ved 20x forstørrelse (se S1 File for ytterligere detaljer).
Hel-mount bilder som brukes for statistisk analyse ble oppnådd på Zeiss mikroskop og behandlet ved hjelp av Fiji bildebehandlings pakke med ImageJ [17]. En makro ble brukt til å sikre konsistens mellom bilder. Kort, makro søkte en katalog for Zeiss bildefiler (Zvi) og konvertert dem til å åpne Mikrosmiljøvern (OME) Tagged Image File Format (TIFF) ved hjelp av Loci Bio-formater importør /eksportør å bevare meta data [18]. Deretter avsluttet settet med følgende funksjoner med innstillinger basert på hvilke protein ble fotografert (tdTomato eller EGFP): trukket bakgrunn, forbedret lokal kontrast (CLAHE), sett autothreshold, og konvertert til binær. En gang i binære, de områdene av bildet som inneholder ingen vev ble fylt med gult. Resultatet ble et binært bilde hvor hvitt representerer vev uttrykker tdTomato og svart representerer vev uttrykker EGFP (S1 figur).
Patch størrelse analyse
For å vurdere forholdet mellom mosaicism og klonal arkitektur, rød og grønne flekker av tarmepitelet i eksperimentelle mus ble analysert ved hjelp av avstands kartene som tidligere beskrevet for aggregering kimærer [3, 4]. Kort fortalt ble flate binære bilder av hver intestinal seksjon konvertert til distansere kartbilder, som viser for hver posisjon Euklidsk avstand til nærmeste motsatt farge, bruker EBImage programvarepakken [19]. Den gjennomsnittlige minimumsavstand til motsatt farge tiltak mosaikk patch størrelse, som ble sammenlignet med patch størrelser fra aggregering chimeras (S2 fig).
3D rekonstruksjon av svulster
Noen adenomer fra mus avlives på 150 dagers alder ble skåret ut og optisk fjernet ved anvendelse av 2,2-thiodiethanol (TDE) som tidligere beskrevet [20]. Slettet adenomer ble montert
en bloc
i 97% TDE og multiphoton eksitasjon bildebehandling ble utført på en Prairie Technologies Ultima IV Imaging system på loci.
Bildestakker fra Ultima IV ble sydd sammen ved hjelp av standard~~POS=TRUNC innstillingene~~POS=HEADCOMP i Grid /Collection Stikking plug-in for ImageJ som distribueres som en del av Fiji-prosjektet [21]. Bakgrunn subtraksjon ble utført på begge kanaler ved hjelp av ImageJ subtrahere bakgrunn funksjon med en rullende ball radius på 40 piksler. Når den viser EGFP bare, ble en terskelverdi som brukes for å fjerne vev autofluorescens. Terskelen ble brukt likt for alle områder av alle bildene som ble brukt i gjenoppbyggingen. Bilder ble deretter åpnet med ImageJ 3D-visningen plug-in (Display som: Volum, Farge: Ingen; Threshold: 0, Omsampling faktor: 1) for å generere høy kvalitet 3D-gjengivelser av OME datasett
Immunohistochemistry
Alle skåret svulster ble enten innebygd i FSC 22 (Surgipath) og flash frosset eller plassert i formalin, behandlet og innstøpt i parafin. Blokker ble serielt seksjonert og kledd som to 5 pm snitt per lysbilde. Hver tiende lysbildet ble farget med hematoxylin og eosin. For mer fullstendig analyse, ble lysbilder av interesse farget av immunhistokjemi for CTNNB1 (1: 200 Renset Mouse Anti-β-catenin antistoff, BD Transduction Laboratories) bruker HistoMouse Max Kit (Invitrogen) eller ved immunfluorescens for grønt fluorescerende protein (EGFP) eller rød fluorescerende protein (tdTomato) (primær- 1: 1000 Leve- Colors EGFP monoklonalt antistoff, Clontech, og sekundær- 1: 1000 geit-anti-mus Alexa Fluor 488, Invitrogen, og /eller primær- 1: 200 anti-tdTomato, Rockland og sekundær- 1: 1000 geit anti-kanin Alexa Fluor 568, Invitrogen) og 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) ved å bruke forlenge Gold med DAPI montering media (molekylære prober). Merk at farging for EGFP og tdTomato var nødvendig fordi fiksering slukker fluorescerende signal
immunfluorescens
Histologiske snitt farget av immunfluorescens ble avbildet som beskrevet i hel-mount bildebehandling delen.; den eneste endringen var bruken av 4x, 5x, 10x eller 20x objektiv. Post-prosessering av bilde var ikke nødvendig. Histologiske snitt farget av immunhistokjemi eller hematoxylin og eosin (H E) ble avbildet på samme måte med en halogen lyskilde og ingen fargefiltre
Patologi
patologi hver lesjon ble vurdert. av to bord-sertifisert patologer (KAM og MKW) ved å undersøke H E beiset lysbilder. Svulster ble klassifisert som enten adenom med lavgradig dysplasi, adenom med høygradig dysplasi, intramucosal karsinom, eller invasiv adenokarsinom. De histologiske kriterier som brukes for klassifisering av lesjonene er definert som følger: lik den som er observert i menneskelige rørformede adenomer, lesjoner med lavgradig dysplasi utstilt hyperchromatic, avlange kjerner med lagdeling av kjerner halvveis mot luminal aspektet med strø mitose. I høygradig dysplasi, de hyperchromatic kjerner er større, avrundet og inneholder ofte en fremtredende nucleolus, stille atom stratifisering til luminal overflaten, viser kompleks arkitektur med back-to-back eller cribriform kjertler, og inneholder rikelig mitotiske tall (noen ganger atypisk) med områder av cellenekrose. I tumorer som oppviser intramucosal karsinom, kjernefysiske og cytologiske funksjoner er identiske med det som ses med høy grad av dysplasi, men disse lesjonene også demonstrere neoplastisk celle invasjon utover basalmembranen inn i lamina propria eller muscularis slimhinner og kan være forbundet med en desmoplastic reaksjon. For lesjoner å bli klassifisert som invasive adenokarsinomer, må de neoplastiske cellene invadere utover muscularis slimhinnen inn i minst submucosa. Den histologi av invasive svulster kan variere, slik at svulster kan være sammensatt av neoplastiske celler med velformede kjertler eller ark av celler uten kjertel formasjon, men i alle tilfeller er det en tilhørende desmoplastic respons.
Sekvensering av
Apc
Parafin deler var forberedt på laser capture mikrodisseksjon (LCM) på områder av interesse ved farging for EGFP bruker HistoMouse Max Kit (Invitrogen) (grunnskole 1: 1000 Levende farger EGFP monoklonalt antistoff, Clontech). Tilstøtende seksjoner ble deretter kuttet på membran lysbilder og farget med metylenblått. Regioner av interesse ble fjernet via LCM med hjelp av translasjonsforskning Initiatives i patologi (TRIP) Lab, University of Wisconsin-Madison. Alternativt, hvis lappene var stor, ble vev skrapet for hånd fra ufargede lysbilder som inneholder formalinfikserte, parafininnstøpte seksjoner. Genomisk DNA ble ekstrahert fra den isolerte vev ved hjelp av Maxwell 16 automatisert rensesystem med Maxwell 16 FFPE Plus LEV DNA Purification Kit følge instruksjonene fra produsenten (Promega, Madison, WI). PCR-primere ble konstruert for å amplifisere to regioner i exon 15 (kodonene 747-953 og 1285-1513; S1 Table) fra mus
APC
genet, siden de fleste mutasjoner forekommer i disse to regionene [8, 22]. PCR ble utført i 35 sykluser. Hver syklus besto av 30 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 55 ° C, og 1 minutt ved 72 ° C. Alle amplifikasjonsprosedyrer inkludert DNA-frie kontroller bestående av amplifikasjonen cocktail og nuklease-fri vann (Promega) i stedet for templat-DNA. PCR-primere ble deretter anvendt for sekvensering. Mutasjon funn og analyser ble utført ved hjelp av mSeq 6.0.1 (Norman Drinkwater, McArdle Laboratorium for kreftforskning, Avdeling for kreftbehandling, School of Medicine og folkehelse, University of Wisconsin-Madison) og mutasjon Surveyor (Softgenetics) programmer.
Resultater
for å studere klonal arkitektur tarmsvulster, genererte vi mus som bærer tre genetiske elementer. De to første var transgener som er nødvendig for å etablere et mønster av mosaicism i tarmen. En transgen består av rotte fettsyrebindende protein 1-promoteren sammensmeltet med gen som koder for Cre rekombinase og den andre har
mT /mG
reporter. I celler som ikke klarte å uttrykke Cre, ble rød fluorescerende protein (tdTomato) utelukkende produsert fra reporteren selv under intestinal tumorigenesis; i celler som uttrykker Cre begynner på dag E13.5 (før ferdigstillelse av tarm morphogenesis og før Min tumordannelse), grønt fluorescerende protein (EGFP) ble utelukkende produsert som genet som koder for tdTomato ble slettet etter rekombinasjon. Således er disse to elementene opprettes et broket mønster av celler som uttrykker røde eller grønne fluorescerende proteiner i den distale tynntarm, cecum og tykktarm (S3 Fig). Dette mønsteret var stabil på alle tidspunkter vurderes (S5 Fig). Det tredje elementet var en enkelt kopi av
Min
allel av
adenomatøs polypose coli product: (
Apc
) genet [8]. Denne mutasjonen disponert musene til den spontane utvikling av tumorer i hele tynntarmen og tykktarmen. Siden reporter status bestemmes før svulster bearbeiding og Cre uttrykk er stabilt under tumorigenesis, svulster som består av en blanding av røde og grønne neoplastiske celler har en multi-forfedrenes arkitektur.
For å karakterisere tarm tumorigenesis i denne modellen, en kohort på 20 mus ble generert og avlivet 150 dagers alder. Forekomsten av tarmsvulster var 100% med et gjennomsnitt multiplisitet av 11 ± 5. En lav tumorbelastning var forventet på grunn av den homogene F1 genetisk bakgrunn og var meget ønskelig da det er begrenset mulighet for to uavhengig initiert svulster koaleserende som en konsekvens av nærhet [23]. Alle svulster fra denne gruppe mus som ble analysert var adenomer med lavgradig dysplasi.
Mange av adenomer i disse musene hadde en multi-forfedrenes arkitektur. Sammensetningen av tykktarmskreft var tydelig
in vivo
av fluorescens endoskopi (Fig 1A) og
ex vivo
bruker fluorescerende mikroskopi (Fig 1B). Av de 63 svulster i distal tynntarm og tykktarm, ble 32 (51%) bekreftet å være sammensatt av røde og grønne neoplastiske celler ved histologi (tabell 1 og figur 1C-1F). Funksjoner av transformasjon fra normal slimhinne til neoplasi /dysplasi var tap av krypten arkitektur, uttømming av overflaten mucin, og økt mitose samt tilhørende kjernefysiske endringer, inkludert trengsel, lagdeling, forlengelse og hyperchromasia. I tillegg dysplastiske røde og grønne celler hadde et forhøyet nivå av CTNNB1 (β-catenin), og ofte dette protein ble lokalisert til cellekjernen som bekrefter at cellene i begge linjene var neoplastisk (figur 1C-1F). Til slutt, røde og grønne neoplastiske kloner gjennomføres ofte unike mutasjoner i
APC plakater (tabell 2 og figur S4), noe som ytterligere indikerer at disse klonene er avledet fra forskjellige erne. Dermed er denne innovative musemodell ganske egnet for å studere klonal arkitektur tarmsvulster. Dessuten en viktig fordel med denne modellen er at den visualisering av forskjellige linjene ikke hindrer molekylære analyser inkludert immunhistokjemi og DNA-sekvensering.
klonal arkitektur colontumorer er synlig
in vivo
med fluoresens endoskopi. Tarmepitelet er et enkelt lag av celler som skiftes hver tre til fem dager. Nye celler produseres fra stamceller som ligger nær bunnen av hver krypten. I vår modell krypter er homotypisk rød eller grønn homotypisk med sistnevnte blir spesielt tydelig i løpet av fluorescens endoskopi, som hver krypten vises som en diskret grønn sirkel (A). Svulster kan bestå av kun røde krypter (venstre panel), en blanding av røde og grønne krypter (midtre panelet), eller bare grønne krypter (panel høyre). Svulstene er skissert i hvitt. Den høye variasjon i klonal arkitekturen er også tydelig i hele mounts (B). Svulster var homotypisk rødt (venstre panel), heterotypic (tre midterste paneler), eller homotypisk grønt (høyre panel). Blandingen av røde og grønne krypter varierer mellom multi-doms svulster, med noen som i hovedsak består av enten røde krypter eller grønne krypter, mens andre er omtrent like mange av begge typer. Histologi er nødvendig å fastslå arkitektur, som svulster kan vises heterotypic med neoplastiske krypter i én farge intermingled med normale krypter av den andre fargen. Den klonal arkitektur svulster er scoret fra histologiske snitt. Neoplastiske celler ble visualisert følgende H size bar = 1mm. Panelene C og E er vist ved samme forstørrelse; size bar = 500 um. Panel D viser en 4x forstørrelse i en tilstøtende del av den skisserte området Panel C. Panel F viser en 4x forstørrelse av området skissert i panelet E.
Andelen multi-doms svulster i mosaikk var lik den prosent observert i tidligere studier med aggregering chimeras (S2 figur, 40-52% i mosaikk versus 22-47% i aggregering chimeras). Dette funnet reflekterer mest sannsynlig at lappeteppe av røde og grønne celler i distal tynntarm og tykktarm vår mosaikk mus var sammenlignbar med lappeteppe av blå og hvite celler observert i aggregering chimeras i tidligere studier (S2 Fig). Alle 165 svulster i den proksimale tynntarmen var homotypisk rød (tabell 1), som rotte fettsyrebindende protein 1-promotoren er nesten ikke til uttrykk i denne regionen i fordøyelseskanalen (S3 Fig). Denne observasjonen tyder på at ekspresjon av fluorescerende proteiner fra reporteren er stabil under tumorigenesis. Fordi tumorigenesis ikke fører til aktivering av Cre eller mutasjoner i reporter, kan heterotypic svulster nøyaktig være fast bestemt på å ha en multi-forfedrenes opprinnelse. Denne tilnærmingen kan generelt anvendes til å studere den klonale arkitekturen av tumorer i andre vev, noe som krever bare bruk av en annen transgenet som uttrykker Cre rekombinase.
multi-anen arkitektur av tumorer ble ytterligere bekreftet via avbildning. Totalt fem flerdoms adenomer ble isolert, suspendert i TDE som monteringsmedium for å redusere spredning fra lipider, og avbildes med en multiphoton mikroskop. For hver adenom, ble de oppsamlede bildene settes sammen for å generere en tredimensjonal rekonstruksjon. Disse data indikerer at noen svulster kan være mer komplisert enn bare biclonal; antall adskilte fargede områder varierte to til fire (S2 tabell). I en overveiende rødt adenom, kunne tre separate grønne områder bli sett, noe som indikerer at denne svulsten kan være avledet fra fire gründerne hvis hver klone oppsto fra en unik initierende hendelse (figur 2). Men forberedelsene til bildebehandling hindret oss fra å være i stand til å utføre de sekvense studier som ville tillate oss å avgjøre om de separate grønne flekker hadde ulike mutasjonsprofiler, noe som vil gi ytterligere bevis på deres opprinnelse.
uttrykk for fluorescerende proteiner som letter bruken av multiphoton eksitasjon bildebehandling for å rekonstruere tumoren i tre dimensjoner Rekonstruksjon tillater undersøkelse av strukturen under overflaten av tumorer (A, overflate; B, sett fra siden) uten forvrengninger og gjenstander som oppstår når avbildning av flere histologiske snitt. Fire forskjellige fargede områdene var tydelig i en svulst. Tre diskrete grønne områder var tydelig når den røde ble trukket (C). Disse områdene av grønt ble atskilt med minst 100 mikrometer, noe som tilsvarer en diameter på 1 til 2 krypter.
Det fler forfedrenes arkitektur vedvarer som svulster fremgang fra godartet til ondartede tilstander. En andre kohort av mus ble generert og tillatt å eldes til døende. Den gjennomsnittlige alder var 494 ± 93 dager. Forekomsten av tarmsvulster var 100% med et gjennomsnitt multiplisitet av 15 ± 5, som var noe høyere enn det som ble observert i mus avlivet ved 150 dagers alder (p = 0,04; Wilcoxon Rank Sum, tosidige). I den døende mus, 16% av tumorene i den distale tynntarm og tykktarm ble intramucosal karsinomer og 13% var invasive adenokarsinomer (tabell 3). I likhet med det som ble observert i menneskelige kolorektal lesjoner, intramucosal karsinom vise neoplastisk celle invasjon inn i enten lamina propria eller muskularis slimhinner og kan være forbundet med en desmoplastic respons (figur 3). Merk at en tidligere studie viste at langvarige Min mus utvikler avansert sykdom, selv om svulstene viste liten genetisk ustabilitet [14]. For en lesjon å betrakte som en invasiv adenokarsinom det måtte være invasjonen av neoplastiske celler utover muskularis slimhinnen i det minste inn i submucosa. De neoplastiske celler ble ofte søyle i utseende med fremtredende nukleoli, hadde en cribriform arkitektur med back-to-back kjertler uten mellomliggende stroma, granulære eosinofil karyorrhectic rusk til stede i lumen av kjertelen, økt mitotisk aktivitet og forbundet med en desmoplastic respons. En multi-doms arkitektur ble observert i 62% av adenomer med lavgradig dysplasi, 57% av adenomer med høygradig dysplasi, 43% av intramucosal karsinomer, og 68% av invasive adenokarsinomer (tabell 3).
i mus som fikk lov til alder til døende, noen svulster var adenomer med høygradig dysplasi (A og B), mens andre var intramucosal karsinom (CF). De neoplastiske celler som er identifisert på H E fargede seksjoner (A, C og D) var en blanding av de to røde og grønne celler (B, E og F). Panelene A og B er vist ved samme forstørrelse; size bar = 1mm. Paneler C og E er samme forstørrelse; size bar = 1mm. Paneler D og F er 4x utvidelser av området skissert i C.
Ondartede celler invaderer submucosa og muskularis propria kan også være avledet fra forskjellige grunnleggere. Totalt 15 invasive adenokarsinomer fra 10 mus ble analysert. Samtidig invasjon av røde og grønne neoplastiske celler ble observert hos 13%. Denne observasjonen viser at samspill mellom kloner kan vedvare selv som svulster begynne å invadere fra submucosa inn muskularis propria.
Diskusjoner
Vi ga en ny musemodell for tykktarmskreft, utført valideringsstudier til sammenligne våre resultater med tidligere eksperimentelle modeller, og deretter anvendes den modell for å studere den klonale arkitekturen av ondartet kreft i tarmen. Funnene ikke bare indikerer at kreft er sammensatt av celler avledet fra flere gründere, men at celler fra forskjellige opprinnelse kan samtidig invadere inn i tarmveggen muskulaturen. Dette funnet er i strid med den oppfatningen at alle solide tumorer er uni-doms og at en enkelt subklon til slutt får en selektiv fordel gjennom epigenetiske forandringer eller mutasjoner og dermed metastasizes fra den primære svulsten til fjerne steder.
Vår modell var validert ved hjelp av flere ulike tilnærminger. Den Fabp1-Cre transgenet ble valgt fordi det blir stabilt uttrykt i den distale tynntarm, cecum og tykktarm under embryogenese [24, 25] og før tumorigenesis oppstår i Min mus. I samsvar med denne påstanden, krypter innenfor det normale tarmen var enten helt rød i fravær av Cre uttrykk eller helt grønt i nærvær av Cre uttrykk. Dessuten er mønsteret av mosaicism er lik hos mus avlivet ved 150 dagers alder og de drepte når døende, noe som indikerer at mønsteret etablert tidlig under embryogenese er stabil i voksne mus (S5 Fig, S6 Fig, og S3 tabell). Hvis Cre ble spontant aktivert i forskjellige celler, ville tarmen gradvis vende mer grønt som mus alder på grunn grønne celler ikke kan konverteres tilbake til rødt. I begge grupper av mus, den proksimale delen av tarmkanalen var nesten helt rødt, mens den distale halvdel var en blanding av rødt og grønt med kolon er sammensatt av 37,6% grønne celler i mus avlivet ved 150 dager og 38,1% grønne celler i mus avlives når døende (p = 0,46, t-test). Alle 165 svulster som er dannet i den proksimale delen av tynntarmen, og 24 av 63 tumorer i tykktarmen og distale halvdel av tynntarmen var homotypisk rød (tabell 1). Denne observasjonen indikerer at Cre Fabp1-transgenet ikke er avvikende aktivert som et resultat av neoplastisk transformasjon. Andre svulster i den distale halvdel av tarmkanalen ble homotypisk grønn eller heterotypic. Prosentandelen av heterotypic, eller åpenlyst flere doms, svulster var lik den som ble observert i tidligere studier hvor aggregering chimeras var ansatt (S2 Fig). Mønsteret av røde og grønne neoplastiske kloner i et enkelt svulst varierer kraftig med rød og grønn blir sterkt blandet i noen tumorer (figur 1B). Slike komplekse blandinger ville være vanskelig å forklare ved det ubestemte ekspresjon av Fabp1-Cre transgenet i løpet av en enkelt klon.
