Abstract
Tidlig avgjørelse på tumorrespons etter anti-kreft behandling er fortsatt et udekket medisinsk behov. Her undersøkte vi hvorvidt
in vivo
avbildning av apoptose ved hjelp av lineær og cyklisk (disulfid-bundet) form av ApoPep-1, et peptid som gjenkjenner histon H1 eksponert på apoptotiske celler, på et tidlig stadium etter behandling kunne forutsi tumor respons på behandlingen senere. Behandling av magekreftceller med cistplatin eller cetuximab alene indusert apoptose, mens kombinasjonen av cisplatin pluss cetuximab mer effektivt indusert apoptose, som oppdaget ved å binde med lineær og syklisk form av ApoPep-en. Forskjellene mellom de monoterapi og kombinasjonsbehandlingen var mer bemerkelsesverdig som detektert med den sykliske skjema i forhold til lineær form. I tumor-bærende mus, ble apoptose avbilding utført 1 uke og 2 uker etter initiering av behandling, mens tumorvolumer og vekter ble målt 3 uker etter behandlingen.
In vivo
fluorescens bildebehandling signaler som oppnås ved opptak av ApoPep-en til svulsten var mest bemerkelsesverdige i gruppen injisert med syklisk form av ApoPep-en på en uke etter kombinasjonsbehandling med cisplatin pluss cetuximab. Korrelasjonsanalyse viste at bildesignaler ved syklisk ApoPep-en på en uke etter behandling med cisplatin pluss cetuximab i kombinasjon var mest nært beslektet med svulst volumendringer (r
2 = 0,934). Disse resultatene viser at
in vivo
apoptose avbildning ved hjelp Apopep-en, spesielt syklisk ApoPep-en, er en følsom og intelligent verktøy for tidlig avgjørelse på magen tumorrespons etter kreftbehandling.
Citation: Jung HK, Wang K, Jung MK, Kim IS, Lee BH (2014)
In Vivo
nær-infrarødt Fluorescens Imaging av apoptose Bruke Histone H1-Targeting Peptide Probe etter Anti-Cancer Behandling med Cisplatin og Cetuximab for tidlig avgjørelse på tumorrespons. PLoS ONE 9 (6): e100341. doi: 10,1371 /journal.pone.0100341
Redaktør: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, USA
mottatt: 02.04.2014; Godkjent: 23 mai 2014; Publisert: 20 juni 2014
Copyright: © 2014 Jung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle data er inkludert i manuskriptet
Finansiering: Denne studien ble støttet av et stipend fra nasjonale R D Program for Cancer Control, Ministry of Health . Velferd, Republikken Korea (0720550-2 til Byung-Heon Lee) og et tilskudd NRF-2012M2A2A7035589 (til Byung-Heon Lee) gjennom National Research Foundation of Korea. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den nest største årsaken til kreft død på verdensbasis [1]. Mono kjemoterapi for avansert magekreft inkluderer kapecitabin eller 5-fluorouracil, mens kombinasjonsterapi omfatter cisplatin pluss 5-fluorouracil eller cisplatin + kapecitabin [2]. Dessverre har magekreft vist lav ansvar for kjemoterapi. Svarprosenten ved fremskreden ventrikkelcancer varierer fra 10-30% for monoterapi og 30-60% for kombinert kjemoterapi [2]. I tillegg molekyl målrettede medikamenter slik som cetuximab (anti-epidermal vekstfaktor-reseptor-antistoff trastuzumab) og (anti-Her2-reseptor-antistoff) er brukt i kombinasjon med kjemoterapi, noe som resulterer i forskjellige responsrate [3] – [5]. I lys av disse lave responsrater, overvåking og tidlig avgjørelse av magen tumorrespons etter behandling med anti-kreft narkotika er derfor svært viktig i forvaltningen av kreftbehandling.
Tradisjonelt avgjørelse på tumorrespons er utført ved å måle endringer i tumorstørrelse ved hjelp av computertomografi (CT). Et slikt tumorstørrelse basert avgjørelse på tumorrespons, men er vanligvis tilgjengelig i to måneder etter begynnelsen av behandlingen. I henhold til retningslinjene for Response evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST), når det er minst 30% reduksjon i tumorstørrelse, blir behandlingen betraktes som en partiell respons, mens når det er en økning i tumorstørrelse 20% eller større, det er definert som en progressiv sykdom [6]. For å redusere forbruk av tid og kostnader for en anti-tumor terapi, er det nødvendig å gjøre go /no-go beslutning om behandling tidligere enn gjeldende metoden basert på tumorstørrelse måling av CT.
Måle opptaket av
18F-fluorodeoxyglucose (
18F-FDG) av svulsten ved hjelp av positronemisjonstomografi (PET) avbildning har gjort oss i stand til å gjøre en tidligere beslutning om tumorrespons etter at anti-tumor terapi enn størrelse baserte CT bildebehandling.
18F-FDG opptak av tumorvevet blir redusert ved reduksjonen i metabolismen og byrden av tumorceller etter kjemoterapi. Imidlertid er det kjent at opptaket av
18F-FDG avhenger hovedsakelig av histopatologiske typer av magekreft. For eksempel Signet-ring cellekreft og mucinous adenokarsinom opptak
18F-FDG ved lave nivåer på grunn av lave nivåer av GLUT-1 transporter [7], [8]. Disse funksjonene gjør vedtak om magekreft respons ved
18F-FDG opptak begrenset. I tillegg er noen typer av tumor, for eksempel brystkreft, viser metabolsk bluss, en midlertidig økning av
18F-FDG-opptak etter kjemoterapi, som er vanskelig å skille den fra tumor tilbakefall [9].
når tumorceller blir behandlet med kjemoterapi og molekylære målrettede medikamenter, de vanligvis dø av apoptose [10] – [12]. Apoptotisk celledød synes å forekomme før anatomisk forandring eller reduksjon i tumorstørrelse [13], [14]. I dette gjelder, vil avbildning av apoptose gjør oss i stand til å avgjøre om svulsten er lydhør overfor en behandling på et tidligere stadium enn gjør avbildning av størrelsesreduksjon. Videre apoptose representerer direkte tumor celledød, mens
18F-FDG-opptak representerer tumor forbrenningen og dermed indirekte representerer tumor celledød. Apoptotiske celler sette signaturer eller biomarkører på overflaten, for eksempel fosfatidylserin og histon H1, som er liten eller fraværende på overflaten av friske celler [15] – [17]. Apoptose bilde sonder som annexin V og dipicoyl sink amid som binder seg til fosfatidylserin har blitt utnyttet for overvåking svulst celle apoptose
in vivo product: [15] -. [17]
Vi har tidligere identifisert ApoPep -1 det anerkjent apoptotiske og nekrotiske celler ved binding til histon H1 på overflaten av apoptotiske celler og i kjernen av nekrotiske celler, henholdsvis [18]. ApoPep-1 har vist seg å være akkumulert i svulsten etter behandling med doksorubicin [18]. Dessuten har det vært brukt for å avbilde myocardial celledød på et tidlig stadium etter hjerteinfarkt for vurdering av langvarige hjertefunksjon [19]. For terapeutiske formål, har ApoPep-1 blitt anvendt som en målsøkende gruppe for å forbedre legemiddel og T-celle-levering til tumor etter induksjon av apoptose av kjemoterapi [20], [21]. I denne studien undersøkte vi hvorvidt
in vivo
bildesignalene for apoptose oppnådd ved opptak av lineære og sykliske (disulfid-bundet) form av ApoPep-1 på et tidlig stadium etter behandling er korrelert med forandringer i tumorvolum senere og er i stand til å gjøre en tidlig avgjørelse på tumorrespons mulig.
Materialer og metoder
Syntese og fluorescens merking av peptider
Linear (CQRPPR) eller syklisk (CQRPPRC, cyklisering via disulfid binding til amino- og karboksyterminaler) form av ApoPep-1-peptider ble syntetisert og renset ved anvendelse av høy ytelse væskekromatografi (HPLC) til . 90% renhet ved Peptron Inc. (Daejeon, Korea). Peptider ble merket med FPR675 nær-infrarødt (NIR) fluorescens fargestoff (Bioacts Inc., Incheon, Korea.)
In vitro binding av peptider til apoptotiske celler
SNU16 human magekreft cellelinje var kjøpt fra KCLB (Seoul, Korea). For å indusere apoptose, ble cellene behandlet med cisplatin (300 ng /ml), cetuximab (200 ug /ml), og cisplatin (300 ng /ml) pluss cetuximab (200 ug /ml) i kombinasjon i 24 timer. Konsentrasjonene av cisplatin og cetuximab ble valgt i henhold til de tidligere rapporter [22], [23]. Etter behandling ble cellene inkubert med 10 pM fluorescein-isotiocyanat (FITC) -konjugert lineær eller syklisk form av ApoPep-1 ved 4 ° C i 1 time. Som kontroll, ble cellene farget med Alexa488-konjugert annexin V (Life Technologies, Carlsbad, CA) i 15 min ved RT. Prosenter av fluorescerende (peptid-bundet eller annexin V-bundet) celler ble målt ved strømningscytometri.
Anti-tumor-behandling av mus og tumorstørrelsesmåling
Alle dyreforsøk ble utført i henhold institusjonelle retningslinjer og i henhold til dyret protokoll godkjent av veiledning av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Kyungpook National University (tillatelse nr KNU 2012-15).
Åtte uker gammel kvinne atymiske (
nu /nu
) Balb /c mus ble kjøpt fra Orient laboratorier (Seongnam, Korea) og ble holdt under spesifikke patogen-frie forhold med laboratorium chow og vann
ad libitum
. Mage tumorxenotransplantater ble etablert av subkutant injisere 1 x 10
7 SNU-16 celler i 100 mL saltvann inn i høyre flanke. Tumorene fikk nå 50-60 mm
3 av volumet før randomisering og behandlingsstart. Behandling av tumorbærende mus med cisplatin og cetuximab ble utført i henhold til en tidligere beskrevet protokoll [24]. Mus ble delt opp i fire behandlingsgrupper (
n
= 6 per gruppe) og behandling i to uker: 1) kontroll saltoppløsning; 2) cisplatin (5 mg /kg, intraperitonealt (i.p.) injeksjon, en gang per uke i totalt to injeksjoner); 3) cetuximab (1,5 mg /kg, i.p., to ganger per uke for totalt fire injeksjoner); 4) cisplatin (5 mg /kg, i.p., en gang per uke i totalt to injeksjoner) pluss cetuximab (1,5 mg /kg, i.p., to ganger per uke i totalt fire injeksjoner). En runde med behandling omfatter injeksjon av cisplatin på dag 1 per uke og cetuximab på dag 1 og dag 4 per uke. Endringer i tumorstørrelse ble målt over tre uker. Diameter på tumor ble målt med automatisk caliper. Tumorvolumene ble beregnet ved anvendelse av formelen: volum = (lengde x bredde x høyde) /2, hvor lengde, bredde og høyde betyr at den lengste dimensjon, kortere dimensjon parallell med mus legeme, og diameteren av tumor vinkelrett på lengden og bredden hhv. Vekten av tumoren ble målt etter isolering av tumormasse.
In vivo
NIR fluorescens avbildning av svulst apoptose
In vivo
NIR fluorescens bildebehandling ble utført etter den første og andre runde med behandling. Hver behandlingsgruppe (
n
= 6) ble delt inn i to undergrupper (
n
= 3) for bildebehandling med lineær og syklisk form av ApoPep-1, henholdsvis. Lineære og cykliske form av FPR675-merkede ApoPep-1 (1,45 mg /kg og 1,54 mg /kg, henholdsvis ekvivalent med 800 nmol /kg for hvert peptid) ble injisert gjennom halevenen til mus. Ved 90 minutter etter administrasjonen ble musene bedøvet og utsatt for avbildning. NIR fluorescens (vanligvis mellom 650 og 1100 nm) er foretrukket for
in vivo
optisk avbildning på grunn av sin lave vev absorpsjon og dype vev inntrengningsegenskaper [25]. Eksitasjon /emisjonsbølgelengde på den FPR675 fargestoff anvendt i denne studien var 675/698 nm. Bilder ble tatt med utforske Optix optiske bildesystem (ART Inc., Montreal, Canada). Dette tidsdomene tomografisk system har vist seg å være mer følsomme med høyere deteksjons dybde og romlig oppløsning enn en kontinuerlig bølge plan bildedannende system [26]. Oppkjøpet tid for en hele kroppen skanning var 15 min per mus. Fluorescens intensitet på region av interesse (ROI) ble målt ved hjelp av en analyse programvare levert av produsenten (ART Inc.).
Histologisk analyse av apoptose
Etter
in vivo
imaging, ble musene avlivet og tumorene ble fjernet og frosset hurtig i oktober innstøpningsmediet (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan). Vev ble kuttet i 6 mikrometer seksjoner og farget med DAPI (4 «, 6-diamidino-to-phenylindole) for kjernen kontra. Terminal deoksy-nucleotidyl transferase-mediert dUTP nick-end merking (TUNEL) farging ble utført ved bruk av Apoptag Red In Situ apoptose Detection kit henhold til instruksjonene fra produsenten (Millipore, Billerica, MA). Vevssnitt ble observert under et fluorescens mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland).
korrelasjonsanalyse mellom fluorescens intensitet og tumor volum
På 3 uker etter behandling (endepunkt eksperimenter), tumorvolum ble målt og tumorer ble isolert for vektmåling. Korrelasjonen mellom NIR fluorescensintensitet og tumorvolum ble evaluert ved lineær regresjonsanalyse ved bruk av Graphpad programvaren.
Stabilitet av peptider i serumet
Peptide stabilitet i serum ble undersøkt som tidligere beskrevet [ ,,,0],27]. Blod fra mus ble oppsamlet og tillatt å levre seg, og deretter serum ble oppnådd etter sentrifugering ved 4 ° C to ganger, etterfulgt av filtrering (0,22 pm pore). Peptid (100 ug i 50 ul PBS) ble inkubert med 50 ul av filtrert serum ved 37 ° C i den angitte tidsperiode. De inkuberte prøvene ble fortynnet 100 ganger og fraksjonert ved C18 revers fase FPLC med lineær gradient av acetonitril (Vydac protein og peptid C18, 0,1% trifluoracetat i vann i likevekt, og 0,1% trifluoracetat i acetonitril for eluering). For å bekrefte identiteten til toppen fra profilene til C18 revers fase FPLC, ble hver topp oppsamlet, vakuum-tørket, og analysert ved hjelp av massespektroskopi (MS) ved hjelp av en MALDI-TOF massespektrometer (Life Technologies, Carlsbad, CA).
statistisk analyse
Den statistiske signifikans av forskjeller mellom eksperimentelle og kontrollgruppene ble analysert ved hjelp av enveis variansanalyse (ANOVA).
Resultater
In vitro
deteksjon av apoptose av magekreftceller ved hjelp ApoPep-en etter behandling med cisplatin og cetuximab
for å undersøke deteksjon av apoptose ved ApoPep-en, ble magekreftceller behandlet med cisplatin, cetuximab, og cisplatin pluss cetuximab og deretter inkubert med lineær og syklisk form av ApoPep-en. Cyklisk form for ApoPep-1 (CQRPPRC) ble fremstilt ved tilsetning av cystein-rester ved den karboksyterminale av lineær form av ApoPep-1 (CQRPPR) og ringslutning via disulfid binding. Prosentandelene av apoptotiske celler som detekteres av den lineære formen av ApoPep-1 var omtrent 28%, 25% og 34% etter behandling med cisplatin, cetuximab, og cisplatin pluss cetuximab, henholdsvis (figur 1A). Prosentandelene av apoptotiske celler som detekteres av den sykliske form av ApoPep-1 var omtrent 56%, 49% og 78% etter behandling med cisplatin, cetuximab, og cisplatin pluss cetuximab, henholdsvis (figur 1B). Prosentandelene av apoptotiske celler som detekteres av annexin V var tilnærmet 43%, 40% og 45% etter behandling med cisplatin, cetuximab, og cisplatin pluss cetuximab, henholdsvis (figur 1C). Disse resultater viser at den kombinerte behandling med cisplatin og cetuximab induserer apoptose av magetumorceller på et høyere nivå enn ved behandling av cisplatin eller cetuximab alene gjør. Dessuten tyder disse resultater på at den sykliske form av ApoPep-en mer følsomt detekterer apoptose av magetumorceller enn den lineære formen av ApoPep-1 eller annexin V betyr.
Celler ble inkubert med cisplatin (300 ng /ml ), cetuximab (200 ug /ml), og cisplatin (300 ng /ml) pluss cetuximab (200 ug /ml) i kombinasjon i 24 timer. Celler ble høstet og inkubert med FITC-merket ApoPep-1 ved 4 ° C i 1 time eller med annexin V ved romtemperatur i 15 min. Data representerer prosentandeler av apoptotiske celler som målt ved flow-cytometri. (A-C) Prosenter av apoptotiske celler som detekteres av lineær form av ApoPep-en, cyklisk form av ApoPep-1, og annexin V, respektivt. PBS, fosfatbufret saltoppløsning; CPT, cisplatin; CET, cetuximab; CPT + CET, cisplatin pluss cetuximab.
In vivo
avbildning av apoptose av mage tumor ved hjelp ApoPep-1 i respons til cisplatin og cetuximab
For å undersøke
in vivo
deteksjon og avbildning av apoptose av mage tumor ved bruk av ApoPep-1, vi målte fluorescensintensiteten ved tumor ved akkumulering av NIR fluorescens-farvestoff-merket-ApoPep-1 til tumorvev etter den første og andre runden av behandlings (tilsvarende en uke og to uker etter initiering av behandling, henholdsvis). Kvantifisering av fluorescens-intensitet ved tumorstedet med enten lineær eller syklisk form av ApoPep-1showed at intensitetene var signifikant høyere i grupper behandlet med cisplatin, cetuximab, og cisplatin pluss cetuximab, sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe, etter den første eller andre runde av behandlingen (Figur 2A, 2B). Fluorescensstyrkene av lineær ApoPep-en var høyere i gruppen behandlet med cisplatin pluss cetuximab i forhold til gruppen behandlet med cisplatin alene (
p
0,05 og
p
0,05 etter første og andre runde med behandling, henholdsvis figur 2A) og cetuximab alene (
p
0,01 og ikke signifikant etter den første og andre runde med behandling, henholdsvis figur 2A). Spesielt fluorescensstyrkene på svulststedet ved syklisk ApoPep-en var bemerkelsesverdig høyere i gruppen behandlet med cisplatin pluss cetuximab i forhold til gruppen behandlet med cisplatin alene (
p
0,01 og
p
0,01 etter den første og andre runde med behandling, henholdsvis figur 2B) og cetuximab alene (
p
0,001 og
p
0,01 etter den første og andre runden av behandlings , henholdsvis figur 2B). Representative hele kroppen fluorescens bilder av lineær og syklisk form av ApoPep-en ble vist (figur 2C, 2D, henholdsvis). Det ble observert lite bakgrunnsfluorescens signaler i andre organer, inkludert lever og lunge (figur 2C, 2D).
SNU-16 mage tumor-bærende mus ble behandlet med cisplatin, cetuximab, og cisplatin pluss cetuximab. Etter at den første og andre runde med behandling, lineær eller syklisk form av FPR675 NIR fluorescens fargestoff-merket ApoPep-1 ble injisert intravenøst i mus.
In vivo
NIR fluorescens bildene ble tatt på 90 minutter etter administrasjon. (A) (B) Kvantifisering av NIR fluorescens signal intensitet av regionen av interesse (ROI) i grupper injisert med lineær og syklisk ApoPep-en. Stolper representerer signalintensiteten ved ROI oppnådd fra tre individuelle mus (gjennomsnitt ± S.D.). Stjernene representerer statistisk signifikans sammenlignet med PBS. Stjernene på brak representerer betydning i forskjell mellom de to gruppene. *
p
0,05, **
p
0,01, og ***
p
0,001 av enveis ANOVA (
n
= 3 per gruppe). (C) (D) Representative NIR fluorescens bilder ved opptak av lineære og cykliske ApoPep-1 til tumor ble vist. Skala barer representerer normalisert fluorescens intensitet. Sirkler representerer ROI.
Måling av tumorvolum og vekt etter anti-svulst behandling med cisplatin og cetuximab
For å undersøke antitumorvekst effekten av cisplatin eller cetuximab alene og i kombinasjon tumorvolum og vekter etter behandlingen ble målt. Behandling med cisplatin, cetuximab, og cisplatin pluss cetuximab redusert tumorvolum sammenlignet med ubehandlet kontroll, i den lineære ApoPep-en gruppe (
p
0,05,
p
0,05, og
p
0,001 henholdsvis figur 3 A) og i det sykliske ApoPep-en gruppe (
p
0,05,
p
0,01 og
p
0,001 henholdsvis figur 3B). Kombinert behandling av cisplatin og cetuximab mer effektivt redusert tumorvolum, sammenlignet med behandling med cisplatin eller cetuximab alene, i den lineære ApoPep-en gruppe (
p
0,05 og
p
0,05 henholdsvis figur 3 A) og i det sykliske ApoPep-en gruppe (
p
0,01 og
p
. 0,01, henholdsvis figur 3B)
SNU-16 mage tumor-bærende mus som ble analysert for bildesignalene etter den første og andre runde med behandling ble opprettholdt for måling av tumorstørrelsen. (A) (B) Måling av tumorvolumer på 3 uker etter behandling. (C) (D) måling av vekt av isolerte tumormasse på 3 uker etter behandling.
* p
0,05, **
p
0,01, og ***
p
0,001 av enveis ANOVA. Piler representerer tidspunktene for behandling. Stjernene representerer statistisk signifikans sammenlignet med PBS. Stjernene på brak representerer betydning i forskjell mellom de to gruppene. (E) TUNEL-farging av tumorvev. Grønn, apoptotiske celler; Blå, kjernen. PBS, fosfatbufret saltoppløsning; CPT, cisplatin; CET, cetuximab; CPT + CET, cisplatin pluss cetuximab. Skala barer representerer 50 mikrometer.
I likhet mønster av endringer i svulst vekter etter behandling med cisplatin, cetuximab, og cisplatin pluss cetuximab i forhold til ubehandlet kontroll ble observert i den lineære ApoPep-en gruppe (
p
0,01,
p
0,01, og
p
0,001 henholdsvis figur 3C) og i den sykliske ApoPep-en gruppe (
p
0,01,
p
0,01, og
p
0,001 henholdsvis figur 3D). Behandling med cisplatin pluss cetuximab mer effektivt redusert tumor vekter, sammenlignet med behandling med cisplatin eller cetuximab alene, i den lineære ApoPep-en gruppe (
p
0,05 og
p
0,05, henholdsvis figur 3C) og i det sykliske ApoPep-en gruppe (
p
0,01 og
p
0,01, henholdsvis, figur 3D). Nivåene av reduksjon i tumorvolum og vekter etter behandlingen mellom grupper injisert med lineær og syklisk form av ApoPep-en var lik, og det var ingen forskjell i tumorvolumer mellom disse to gruppene på tidspunktet for avbildning. Høyere nivåer av apoptose etter behandling med cisplatin pluss cetuximab i kombinasjon, sammenlignet med cisplatin eller cetuximab alene, ble ytterligere demonstrert av tunel farging av tumorvev (Figur 3E).
Sammenheng mellom fluorescens intensitet og tumor volum
Vi undersøkte sammenhengen mellom fluorescensintensiteten av
in vivo
avbildning av apoptose etter den første og andre runde med behandling (tilsvarende en uke og to uker etter initiering av behandling, henholdsvis) og tumorvolum senere (ved 3 uker etter initiering av behandling). Fluorescensstyrkene til bilder tatt av syklisk ApoPep-en etter den første runden av behandlingen ble omvendt korrelert med tumorvolumer med sterkest avtalen (korrelasjonskoeffisient r
2 = 0,934, figur 4C), sammenlignet med de som er tatt av syklisk ApoPep- en etter den andre runde med behandling (r «> 2 = 0,705, figur 4D) og ved lineær ApoPep-en etter at den første (r’> 2 = 0,631, figur 4A) og andre runde med behandling (r «> 2 = 0,402, figur 4B).
data representerer korrelasjonen mellom NIR fluorescensintensiteter erholdt i figur 2A og 2B og tumorvolumer innhentet på figur 3A og 3B. (A) (B) Sammenheng mellom fluorescensintensiteter erholdt ved lineær ApoPep-en etter at den første og andre runde med behandling og tumorvolum. (C) (D) Sammenheng mellom fluorescensstyrkene innhentet av syklisk ApoPep-en etter første og andre runde med behandling og tumorvolum.
Stabilitet av lineær og syklisk ApoPep-1 i serum
Vi undersøkte om høyere nivåer av bildedannende signaler ved den cykliske ApoPep-1 sammenlignet med de til lineære ApoPep-en var på grunn av forskjellen i serum stabiliteten av peptider. Etter inkubasjon av de lineære og cykliske form av ApoPep-1 med museserum opp til 24 timer, ble mengden av peptidet som er igjen i serum analysert. Peptidet topp var skilles fra ikke-spesifikke topper i serum og mengden av lineære og cykliske form av peptidet igjen i serum, som beregnet av topparealet, ble ikke vesentlig endret til (henholdsvis figur 5A og 5B,) 24 timer. MS-analyse av hvert peptid topp bekreftet identiteten av den lineære (figur 5C) og cyklisk (figur 5D) form av ApoPep-1. Disse resultatene tyder på at både de lineære og cykliske former av ApoPep-1 er stabile i serumet opp til 24 timer uten noen forskjell i stabilitet i løpet av inkubasjonstiden perioden.
Lineære og cykliske ApoPep-1-peptider ble inkubert med museserum ved 37 ° C i de angitte tidsperioder. (A) (B) Lineære og cykliske form av ApoPpep-1-prøver og museserum ble fraksjonert ved C18 revers-fase FPLC. Y-aksen representerer absorbans-enhet ved 215 nm. Hvert peptid topp ble indikert ved en pil, og kan skilles fra serum topper. (C) (D) MS-spektrum av de lineære og cykliske peptid topp oppsamlet fra 24 timer FPLC fraksjon og syntetiske lineære og cykliske ApoPep-1.
diskusjon
Her viste vi at
in vivo
avbildning av apoptose ved opptaket av ApoPep-1 til tumor på et tidligere tidspunkt (en uke etter behandling) kunne forutsi magen tumorrespons og etterfølgende reduksjon i tumorvolumet på et senere tidspunkt (tre uker etter behandling). I tillegg er den cykliske form av ApoPep-1 viste høyere
in vitro
binding til apoptotiske celler og
in vivo
avbildningssignaler og mer bemerkelsesverdig forskjell mellom cisplatin eller cetuximab alene og cisplatin pluss cetuximab i kombinasjon enn lineær form av ApoPep-en gjorde (mer sensitiv deteksjon). Styrken på bildesignaler tatt av den sykliske ApoPep-en etter den første runden av behandlingen viste nærmere sammenheng med endringer i tumorvolum enn gjorde de ved lineær ApoPep-en (mer spesifikk påvisning). Disse resultatene tyder på at avbildning av apoptose ved hjelp av den sykliske ApoPep-en kan være et nyttig verktøy for en tidligere avgjørelse av mage tumor respons etter anti-kreft behandling enn tiden tilgjengelig verktøy basert på tumorstørrelse måling av CT scan.
apoptose bilde prober som gjenkjenner ulike biomarkører er merket med ulike bilde andeler og utnyttes for overvåking av tumorrespons etter kreftbehandling. For eksempel ble fluorescens fargestoff-merket annexin V gitt i kolon tumor-bærende mus etter en uke av cetuximab behandling og viste en topp opphopning ved 24 timer etter intravenøs administrasjon, som var forbundet med en reduksjon av epidermal vekstfaktor opptak og aktivering av caspase -3 [28].
3H-merket butyl-2-metyl-malonsyre som binder seg til anioniske fosfolipidet ble gitt i kolon tumor-bærende mus ved 24 timer etter kjemoterapi og er akkumulert ved tumor etter 2 timer etter injeksjon, noe som ble ledsaget av en reduksjon av tumorvekter [29]. Fluorescens fargestoff-merket kaspase-aktivitet-baserte peptidet sonde ble gitt til mus som bærer tykktarm tumor i 12 timer etter behandling med Apomab å indusere apoptose, som i sin tur viste fluorescens-signaler ved 50 min etter injeksjon [30].
124I-merkede fosfatidylserin antistoff ble injisert i mus som bærer prostata svulst 24 timer etter behandling med kjemoterapi eller radioterapi, hvor bilder ble tatt 48 timer etter antistoff injeksjon og viste øket opptak av antistoffet i tumor og omvendt korrelasjon mellom antistoff opptak og endringen i tumorvolum (r «> 2 = 0,85) [13]. Sammenlignet med de tidligere rapportene, våre resultater tyder på at ApoPep-en er en lovende sonde i form av rask opptakshastighet (2 timer) og nær sammenheng med tumorvolumendring (r
2 = 0,934).
en syklisk form av et peptid er generelt mer stabile mot nedbrytning ved hjelp av protease og mer selektiv i mål-binding enn sin lineær form [31]. En syklisk form av RGD peptid, for eksempel, viser forbedret stabilitet mot pH-endringer [32]. Kliniske studier som en potensiell angiogenese hemmer gjennomgår med syklisk form av RGD peptidet [31]. I noen tilfeller kan imidlertid lineær form av et peptid som viste bedre bindende aktivitet og bildesignalene [31]. I denne studien sammenlignet vi lineær og syklisk form av ApoPep-en for å se hvilken form viser bedre aktivitet i å oppdage apoptose. Vi fant at syklisk form av ApoPep-en var mer sensitiv i forpliktende og oppdager apoptotiske celler enn sin lineær form. Hvorfor gjorde den sykliske form av ApoPep-en viser bedre
in vitro
bindende og
in vivo
deteksjon aktivitet på apoptotiske celler? Vi har undersøkt stabiliteten av peptider i serum. Det er tidligere beskrevet at ApoPep-1 var stabil opp til 2 timer i serum [33]. I denne studien utvidet vi inkubasjonstiden perioden og fant at både lineære og sykliske form av ApoPep-1 var stabile i nærvær av serum inntil 24 timer. Dette tyder på at forskjellen i serum stabilitet ikke bidrar til den forbedrede aktivitet målretting av den sykliske form av ApoPep-1 over den lineære formen av ApoPep-1. En alternativ forklaring kan være at dannelsen av anstrengt struktur av disulfid-binding kan føre til en mer fordelaktig binding til apoptotiske celler ved den cykliske ApoPep-1 over sin lineær form.
I tillegg til fluorescens fargestoffer, ApoPep-1 mai merkes med radioisotoper, som for eksempel
123I,
18F, og
68Ga, gjennom kjemiske linkere og brukes som en probe for SPECT (SPECT) eller PET billeddiagnostikk. Som en fremtidig retning, PET avbildning av apoptose ved hjelp av
18F-merket lineær eller syklisk ApoPep-1 gjenstår å bli undersøkt for overvåking av tumorrespons. ApoPep-1-basert avbildning av apoptose vil være nyttig i behandlingen av terapeutiske strategier i klinikker og bidra til utvikling av nye anti-kreft terapeutiske midler.
