Abstract
Bakgrunn
lunge er en hyppig åsted for kolorektal kreft (CRC) metastaser. Etter kirurgisk reseksjon, har lungemetastaser tilbakefall vært knyttet til tilstedeværelsen av mikrometastaser, potensielt tilgjengelig for en høydose kjemoterapi administrert via lunge adjuvant isolert perfusjon (ILP). Vi ønsket å finne ut
in vitro
den mest effektive stoffet når det gis til CRC cellelinjer i løpet av en kort eksponering og
in vivo
umiddelbar og forsinket toleranse når administrert via ILP.
Fremgangsmåter
Først effekt av forskjellige cytotoksiske molekyler mot et panel av humane CRC-cellelinjer ble testet
in vitro
ved hjelp av cytotoksisk analyse etter 30 minutters eksponering. Deretter tidlig (operative) og forsinket (1 måned) toleranse av to konsentrasjoner av molekylet administrert via ILP ble testet på 19 voksne griser bruker hemodynamisk, biologisk og histologiske kriterier.
Resultater
In vitro
, gemcitabin (GEM) var den mest effektive medikament mot utvalgte CRC cellelinjer.
In vivo
, GEM ble administrert via ILP ved vanlig (20 mikrogram /ml) eller høy (100 mg /ml) konsentrasjoner. GEM administrering var assosiert med forbigående og doseavhengig pulmonær vasokonstriksjon, som fører til en frivillig reduksjon i pumpe innstrømning for å opprettholde en stabil pulmonalt arterietrykk. Etter denne modulasjon, ble ILP ved bruk av GEM ikke forbundet med noen systemisk lekkasje, systemisk skade og akutt eller forsinket histologisk pulmonær toksisitet. Farmakokinetiske studier avslørte opptak doseavhengig forbundet med heterogen fordeling av molekylet inn i lungeparenkym, og vedvarende cytotoksisitet av venøs avløp.
Konklusjoner
GEM er effektiv mot CRC cellene selv etter en kort eksponering . ILP med GEM er en trygg og reproduserbar teknikk
Citation. Pagès P-B, facy O, Mordant P, Ladoire S, Magnin G, Lokiec F et al. (2013) Isolert Lung Perfusjons som en adjuvant behandling av tykktarmskreft lungemetastaser: En preklinisk studie i en gris Model. PLoS ONE 8 (3): e59485. doi: 10,1371 /journal.pone.0059485
Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, USA
mottatt: 23 august 2012; Godkjent: 14 februar 2013; Publisert: 18 mars 2013
Copyright: © 2013 Pagès et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av franske nasjonal League mot Kreft [SW /SP-116F.2010] og vitenskapelige komité School of Medicine i Dijon, Frankrike. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Om 11% av pasienter som lider av tykktarmskreft (CRC) vil etter hvert utvikle lungemetastaser [1]. Denne tilstanden er forbundet med fem-års overlevelsesrater som strekker seg fra 5 til 50%, i henhold til muligheten for å oppnå fullstendig kirurgisk reseksjon [2] – [7]. Til tross for kirurgisk fjerning, forekommer lunge tilbakefall på mer enn 40% av pasientene, sannsynligvis på grunn av mikrometastaser som allerede var til stede under den innledende prosedyre [3]. Adjuvant kjemoterapi forbedrer progresjonsfri men ikke total overlevelse [8], og økningen av systemisk dose er assosiert med uakseptable toksisitet [9].
Den komplette tumor og metastase kontroll har alltid vært hjørnesteinen i kreftterapi. Videre har nylige data indikerer at metastase er en flerveis prosess hvorved kreftceller kan frø fjerne områder, så vel som den primære svulsten i seg selv [10]. Denne senere prosess, kjent som «self-seeding, «har blitt validert i ulike eksperimentelle modeller [11], og utgjør et sterkt argument i favør av lokal kontroll av metastatiske sykdommer.
For å redusere tilbakefall av CRC lungemetastaser, har enkelte forfattere utviklet teknikk for isolerte lunge perfusjon (ILP) [12], som tillater å øke dosen av cytotoksisk middel levert til lungevevet uten systemisk eksponering. Denne teknikken har vist seg å være trygg og effektiv mot CRC lungemetastaser i gnagermodell [13] – [17]. Hovedmålet med denne studien var å fastslå
in vitro
den mest effektive stoffet når det gis til CRC cellelinjer i løpet av en kort eksponering og
in vivo
umiddelbar og forsinket toleranse når administrert via ILP i en gris modell.
Materialer og metoder
In vitro Anti tumor Effect
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP.
et panel av menneskelige kolorektal adenokarsinom cellelinjer (HT29, HCT8, HCT116, SW480) ble valgt til å representere mangfoldet av CRC chemo følsomhet og mutasjonsstatus (tabell 1), kjøpt fra den amerikanske Tissue og celle Collection (ATCC®, Rockville, MD, USA) og vedlikeholdes i kultur som anbefalt.
forbindelser
følgende forbindelser ble valgt som de mest effektive medikamenter mot CRC i klinisk setting [18] – [19]. gemcitabin (GEM) (Gemzar®, Lilly) , Cisplatin (Cisplatine Mylan®, Mylan), 5 fluorouracil (5 FU) (Fluorouracile Accord®, Accord Healthcare), oksaliplatin (Eloxatine®, Sanofi), Raltritexed (Tomudex®, Hospira) og Irinotecan (Campto®, Pfizer).
Cytotoksisitet assay.
Anti tumoral virkning av disse forbindelser ble bestemt ved bruk av cytotoksisk analyse, slik som tidligere beskrevet [20]. I korthet ble cellene sådd ut i 24-brønners plater, tillates å vokse til konfluens i 24 timer, og utsatt for utvalgte forbindelser alene eller i kombinasjon i 30 minutter. Etter 4 dager ble cellene farget ved hjelp av krystallfiolett, og absorbansen ble målt i hver brønn ved hjelp av en automatisk fotometer (590 nm filter, Spectra-®, Varian, Frankrike). Celleoverlevelse ble beregnet som prosentandelen av absorbansen i behandlede
vs
ubehandlede brønner, og IC50 (konsentrasjon oppnå en inhibering av vekst av 50% av cellene) ble bestemt. Den mest effektive stoffet ble definert som forbindelsen med lavest IC50 [20], og testet i kombinasjon med den nest mest effektive sammensatte.
Isolert Lung Perfusjons
Animals.
Tre måneder gamle store hvite griser (n = 19), veier 50 ± 3 kg hver, ble kjøpt fra Hazotte (Beaumont, Frankrike). Dyrene ble akklimatisert til laboratoriemiljø for 7 dager med fri tilgang til mat og vann. Forsøk ble godkjent av Animal etikkomiteen ved Universitetet i Burgund, Frankrike (A0809).
Anestesi.
Dyr ble bedøvet som tidligere beskrevet [21]. Det systemiske arterielle blodtrykk ble overvåket gjennom et kateter innsatt i leddarterien. Hjertefrekvens, EKG, nasal temperatur, oksygen blod metning ble overvåket ved hjelp av NICO system (Novametrix Medical Systems, Wallingford, CT). Ufraksjonert heparin (100 UI /kg) ble administrert før vaskulær utelukkelse av lungen. For å oppnå perioperative analgesi, ble 20 ml av ropivakain 0,75% injiseres i perilesional huden og brystveggen. Tramadol og paracetamol ble foreskrevet i den postoperative perioden med jevne mellomrom.
Surgical Technique.
Etter å ha plassert dyret på høyre lateral decubitus, en venstre postero-lateral torakotomi ble utført i fjerde intercostals plass . Posen ble åpnet sterkt, og venstre hovedlungepulsåren (LMPA) og både venstre lungevenene (LPV) ble isolert. Kanylering ble utført ved anvendelse av et metall tippet-anguled kanylen (High Flow aortabuen kanyle 3,8 mm, Terumo®, Ann Arbor, USA) satt inn i LMPA og en venøs kanyle (DLP venstre Hjertet Vent kateter, Medtronic®, Minneapolis, USA) settes inn i konvergens av LPVs via venstre atrium (LA). En skjerm linjen ble satt inn i opprinnelsen til LMPA. Den LMPA og LA var enn fastklemt, venstre lunge ble ventilert og venstre hoved bronkie ble fanget å tilstoppe bronkial arteriell blod [22].
Isolert Lung perfusjon.
Den ekstrakorporal sirkulasjon systemet består en pumpe (Biomedicus®, Minneapolis, USA), varmeveksler, reservoar og PVC rør av ¼ tommers diameter. Priming ble oppnådd med en oppløsning inneholdende 850 ml voluven (6% hydroksyetylstivelse 130 /0,4) og 150 ml blod fra lungene sirkulasjon. Etter å ha startet perfusjon, ble pumpestrømningen gradvis økes for å oppnå en midlere LMPA trykk som tilsvarer trykket målt før fastklemming. Kjemoterapi ble deretter injisert i kretsen [23], pumpestrøm ble modulert for å stabilisere middel LMPA trykk, og kjemoterapi perfusjon varte i 30 minutter, fulgt av en 15 minutters periode av utvasking. Ved 5, 10, 20 og 30 min av perfusjonen ble det systemiske blodprøver tatt. Ved 30 min perfusjon, ble to lungeprøver tatt for å måle konsentrasjonen av medikament i lungevevet og for å vurdere den histologiske akutt lungeskade. Væskeprøver ble tatt i perfusjonen krets for å måle konsentrasjonen av medikamentet, og lunge avløp ble trukket for å evaluere dens cytotoksisk effekt på tumorceller
in vitro
. På slutten av prosedyren, ble kanyler trukket tilbake, torakotomi ble lukket på en midlertidig brystet tube, og dyrene ble vekket.
Eksperimentelle grupper.
fase I studien har definert en maksimal tolerert dose følgende en 30-minutters intravenøs infusjon av GEM ekvivalent med systemisk dose på 20 ug /ml /h [24]. Som et fremspring, idet konsentrasjonen av GEM brukt til ILP var 0 ug /ml (kontroll, n = 5), 20 ug /ml (faste dosegruppe, n = 7 dyr) og 100 ug /ml (høy dose, n = 7).
farmakokinetikk.
for å determinate konsentrasjonen av GEM inn blodprøver og lungeparenkym, prøver ble spin-tørket ved 4 ° C og 12 000 G i løpet av 10 minutter. Kvantifisering av GEM i plasma og surpernatant ble deretter oppnådd ved hjelp av isocatic revers-fase høy ytelse væskekromatografi (HPLC) system som tidligere beskrevet [25]. Konsentrasjon av GEM ved slutten av ILP ble etablert i kretsen, i to forskjellige lunge biopsier, og i den systemiske sirkulasjonen. Residual cytotoksisitet av venøs avløp ble undersøkt ved hjelp av serielle fortynninger og in vitro cytotoksisk assay.
Akutt systemisk toksisitet.
ILP prosedyren ble utført på nitten griser. Systemisk toksisitet av GEM ble evaluert ved måling av lever- og nyrefunksjon. Hemodynamisk toleranse ble vurdert ved å registrere puls og systemisk blodtrykk.
Akutt lungetoksisitet.
Respiratory toleranse ble bestemt ved å ta gjennomsnittet LMPA trykk, oksyhemoglobin (SpO2) og partialtrykket av karbondioksyd under utånding (PCO2). Alvorlighetsgraden av lungelesjoner ble vurdert histologisk hjelp av Chiang poengsum, som ble opprettet for å vurdere akutt lungeskade etter iskemi /reperfusjon sekvens av transplanterte lunger [26]. Kort fortalt, denne poengsummen esteems lesjoner som ødem og celle infiltrasjon. Ødem scores som en for perivaskulær ødem; 2 for peribronchial eller interstitiell ødem; 3 for alveolar ødem. Celleinfiltrasjon scores som 2 for perivaskulær celle infiltrasjon; 3 for interstitiell celle infiltrasjon; 4 for alveolar celle infiltrasjon. Summen av alle de patologiske scorene var stillingen for hver omfang, og da har vi beregnet gjennomsnittsskår for venstre lunge med summen av den øvre og den nedre lapp score, der 0 er en normal poengsum.
forsinket toksisitet.
Etter en måned med oppfølging, tolv dyr ble reoperert på. Forsinket toksisitet ble vurdert etter de samme metoder og kriterier som beskrevet for akutt giftighet. Dyrene ble deretter avlives etter en intrakardiell injeksjon av Pentobarbital (Dolethal®, VETOQUINOL).
Statistisk analyse.
Kategoriske variabler ble rapportert som tall og proporsjoner. Normale kontinuerlige variabler er rapportert som betyr ± standardavvik. Når det gjelder de hemodynamiske parametre, sammenlignet vi de moderate middelverdier av en måte gjentas til det samme dyret ved gjentatte målinger ANOVA. En lineær regresjon ble utført for å beregne korrelasjon mellom kontinuerlige variabler. Når resultatene av avviksanalyse var statistisk signifikant (p 0,05), utførte vi en
posthoc
sammenligning ved hjelp Benferroni metode for å redusere risikoen α. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av Stata 12 statistisk programvare (StataCorp, College Station, USA).
Resultater
cytotoksiske analysen
Gis gjennom en kort eksponering, GEM var mer effektiv enn 5 FU, cisplatin, oksaliplatin eller irinotekan (figur 1 A og B). Raltitrexed viste den samme effekt som GEM i HCT8 og HT29, men ikke i HCT116 og SW480-celler. Adjunction av raltitrexed til GEM ikke øke sin cytotoksisitet (figur 1 C). Derfor GEM alene ble valgt for ILP prosedyren.
A- IC50 verdier etter in vitro eksponering for 30 min fra CRC celler SW480, HT28, HCT116 og HCT8 med oksaliplatin, 5 FU, Cisplatin, GEM, Irinotecan og Raltitrexed. B-Dose-responskurver etter in vitro eksponering for 30 min fra CRC celler SW480, HT28, HCT116 og HCT8 med oksaliplatin, 5 FU, cisplatin, GEM, irinotecan og Raltitrexed. C- Dose-responskurver etter in vitro eksponering for 30 min fra CRC celler SW480, HT28, HCT116 og HCT8 med kombinasjon av GEM og Raltitrexed.
Farmakokinetikk
Etter 30 min av perfusjon, GEM konsentrasjon var større for høy dose enn for vanlig dose gruppen målt i kretsen (74,29 ± 18,06 vs 22,85 ± 6,51 mikrogram /ml, p = 0,0001) og i lungeparenkym (141,46 ± 117,07 mikrogram /g henholdsvis vs 56,91 ± 28,06 pg /g, p = 0,014). Cytotoksisitet analyse viste en opprettholdt cytotoksisk effekt av lungen avløpet ved enden av ILP, uten noen forskjell mellom den vanlige dose og den høydosegruppen selv for 10% fortynning av lungen avløpet (figur 2). I systemisk sirkulasjon, den maksimale konsentrasjonen av GEM etter ILP var 0,638 ± 0,27 ng /ml for høydose gruppen og 0,248 ± 0,15 mikrogram /ml vanlig dose gruppen (tabell 2).
Celler ble eksponert for ulike fortynninger (10%, 50% og 100%) av lunge avløpsvannet.
Akutt systemisk toksisitet
Når det gjelder systemisk hemodynamisk toleranse, ingen signifikant endring ble observert i blodtrykk, puls, og elektrokardiogram som bestemt før, under og etter operasjonen (Tabell 3). Ingen store lever- eller nyre akutt giftighet ble notert (tabell 4).
Akutt lungetoksisitet
Før klem, individuelle variasjoner i gjennomsnitts LMPA trykket ble notert ved baseline, med verdier fra 18 til 34 mmHg. Etter klemming ble perfusjon tilsig gradvis økes for å oppnå et tilsig på 500 til 600 ml /min. I GEM gruppene økte midlere LMPA trykket gradvis, noe som førte til å redusere innstrømming av den ekstrakorporale pumpen for å opprettholde det opprinnelige midlere LMPA trykk (figur 3A). Som en konsekvens av den midlere LMPA trykket var ikke signifikant forskjellig mellom de tre gruppene (figur 3B), men den midlere perfusjon innstrømnings ved 30 minutter var lavere i GEM gruppene enn i kontrollgruppen (figur 3A). Det var en invers korrelasjon mellom konsentrasjonen av GEM i perfusjon kretsen og den gjennomsnittlige strømnings etter 30 min perfusjon (p = 0,0158). Det var ingen forskjell i midlere LMPA trykket før og etter ILP (p = 0,7187, figur 3C). Histologiske analyser viste en midlere Chiang poengsum på 5,05 ± 3,52 i kontrollgruppen, og ingen signifikant forskjell i GEM grupper. Det var heller ingen sammenheng mellom Chiang score og GEM dose tilført (p = 0,7491, tabell 5) eller GEM konsentrasjonen inn i lungeparenkym (p = 0,7278).
A- Perfusjons tilsig i den isolerte lunge perfusert med gelatin (580 ± 178,88 ml /min), GEM 20 ug /ml (257,14 ± 202.62 ml /min) og GEM 100 ug /ml (210 +/- 138,92 ml /min) i løpet av 30 min (p = 0,0055). B- Perfusjon trykket i den isolerte lungene perfusert med gelatin, GEM 20 ug /ml, og GEM 100 ug /ml i løpet av 30 min. C- Mean venstre lungearterien trykket før og etter ILP med gelatin, GEM 20 mikrogram /ml og GEM 100 mikrogram /ml i løpet av 30 min (p = 0,7187).
Long Term Toxicity
Verken lunge nekrose eller fibrose ble observert, enten makroskopisk eller mikroskopisk. Oftest lesjoner beskrevet var peribronchial ødem og interstitiell celle infiltrasjon. Alvorlige lesjoner som alveolar cellulær infiltrering ble bare sett for de første tre dyrene i kontrollgruppen, som presentert en lungeødem ved enden av ILP fremgangsmåte relatert til en hurtig økning av innstrømningen. Det var ingen sammenheng mellom GEM konsentrasjonen i lungeparenkym og Chiang score (p = 0,0846) (tabell 5).
Kommentarer
I utgangspunktet utviklet som en adjuvant behandling av lungemetastaser som stammer fra sarkomer, har ILP vakt stor interesse på grunn av den høye pulmonal tilbakefall og redusert langtidsoverlevelse i denne patologi, selv etter fullstendig kirurgisk reseksjon [3]. Potensielle fordeler ved ILP omfatter levering av høydose cellegift til lungene, noe som fører til rask metning av lungeparenkym og begrenset systemisk lekkasje [14], [27] – [29]
interesse av.
in vitro
cytotoksiske analysen er å velge en kjemoterapi medikament for ILP prosedyren, som foreslått av tidligere studier. Link
et al
. demonstrert at
in vitro
analyser kunne identifisere aktive stoffer for individualisert leverpulsåren infusjon [30]. Kornmann
et al
. viste at pasienter med CRC som viste
in vitro
følsomhet kan ha nytte av bukspyttkjertelen og kolikk regional kjemoterapi med GEM [31]. Når du setter denne foreløpige analysen, valgte vi et panel av celler som representerer mangfoldet i CRC om vekstfaktorer signalveier [32]. Disse banene er målrettet ved metastatisk sykdom, alene eller i kombinasjon med cytotoksiske midler, inkludert oksaliplatin og irinotekan [33]. Men disse to stoffene var mindre effektiv enn GEM følgende kort eksponering, sannsynligvis fordi GEM utviser en doseavhengig effekt mens effekten av oksaliplatin eller irinotekan er mer tidsavhengig [24], [34], [35].
til dags dato er GEM ikke en standard systemisk behandling av metastastic CRC [33]. Men, som tidligere nevnt, noen publikasjoner rettferdiggjøre bruken av HTCA for å velge den aktive kjemoterapi på CCR-celler i løpet av en kort eksponering av 30 minutter [30], [31]. Det er å merke seg at stoffer som brukes i isolerte organ-perfusjon, for eksempel isolert lunge eller lever perfusjon, er ikke nødvendigvis de molekyler som benyttes for intravenøs behandling. I thorax onkologi, Hendricks et al. har rapportert oppmuntrende resultater i en fase I klinisk studie ved hjelp av melfalan under ILP å behandle lungemetastaser [22]. I denne studien primære cancere var kolorektalt karsinom, nyrecellekreft og sarkom, og melfalan var ikke en standardbehandling av noen av disse kreftformer. Tilsvarende i lever onkologi, melfalan har blitt rapportert å være assosiert med klinisk respons og forlenget overlevelse etter isolert lever perfusjon, til tross for sin begrensede effekt etter intra venøs administrasjon [28]. Isolert organ perfusjon er fortsatt en eksperimentell teknikk utføres av noen kirurgiske team i klinikken, og alle legemidler tilgjengelig for systemisk administrasjon har ikke blitt testet for isolert organ perfusjon. En av de viktigste fordelene med isolerte organ perfusjon, er å tillate bruk av høyere doser av cytotoksiske midler, og dermed utvide antall molekyler som er tilgjengelige for å oppnå en antitumoreffekt. Men til dags dato, er det ingen publikasjon i å vurdere effekten av gemcitabin på lungemetastaser fra CRC i klinisk setting.
Når det gjelder isolert organ perfusjon, er den klassiske doseøkning utforming ubrukelig hvis ekstrakorporal krets førte til en stabil state utsette organ parenchyma til aktive konsentrasjoner forbundet med normalt vev metning [36]. I vår studie, GEM-konsentrasjoner brukt under ILP var 18-40 ganger høyere enn
in vitro
IC50, som fører til stabile GEM-konsentrasjoner i kretsen gjennom perfusjon, med minimale systemiske lekkasjer. For begge grupper, GEM konsentrasjoner i kretsen var mye høyere (3-20 ganger) den som finnes i plasma hos pasienter behandlet med IV GEM [24]. Videre er den cytotoksiske aktivitet av lunge avløpet viste at de vedvarende høye GEM konsentrasjoner og bevart cytotoksisk aktivitet. Disse tre elementene indikerer en metning av lunge parenchyma som en helhet ved GEM under ILP prosedyre, men romlig fordeling forblir tvilsomt.
I ILP, ble innstrømningstrykket opprettholdes tilsvarende gjennomsnittelig pulmonalt arterietrykk måles før klem for å forebygge lungeødem og akutt lungeskade [37], [38]. Adjunction av GEM til kretsen var assosiert med en økning av intrapulmonal vaskulær motstand og påfølgende økning i gjennomsnittelig pulmonalt arterietrykk (mPAP). Denne forbigående vaskulær toksisitet av GEM har allerede blitt rapportert etter systemisk administrasjon, og beskrives som en forbigående vasokonstriksjon assosiert med en kapillærlekkasjesyndrom [39]. Vi viste at under ILP dette vaskulær fenomenet er doseavhengig og reversibel, forutsatt at senke ILP tilsig styrer mPAP. Til slutt fant vi heterogene konsentrasjoner av GEM i lungeparenkym henhold til regionen og hva gruppen vurderes, som allerede rapportert med andre cytotoksiske midler [40]. Denne heterogeniteten kan tolkes som en konsekvens av en usammenhengende legemiddelindusert vasokonstriksjon, og kan bli oppveid av den adjunction av vasodilatators under ILP ved hjelp av GEM.
Høyere histologisk Chiang poengsum ble funnet i kontrollgruppen enn i GEM gruppe, ved slutten av prosedyren og etter en måneds overlevelse. Franke et al. har vist at øket pulmonalt trykk i en innstilling av ILP vil resultere i skadelige virkninger på morfologi [37], men i vårt studium, trykket av perfusjon var signifikant forskjellig i kontroll og GEM grupper. Den eneste betydelige forskjell i pulmonalt hemodynamiske mellom gruppene var en signifikant høyere perfusjon tilsig i kontrollgruppen. Denne økningen av perfusjonen innstrømning kan være ansvarlig for de histologiske skadelige effekter.
Denne studien viste at ILP med GEM er en sikker og reproduserbar teknikk, tillater å levere høye doser av kjemoterapi til lunge parenchyma med svært begrenset systemisk lekkasjer. Men GEM-assosiert forbigående og doseavhengig pulmonal vasokonstriksjon førte til heterogen fordeling av GEM i lungeparenkym. Ytterligere eksperimenter for å optimalisere fordelingen av stoffet inn i lungeparenkym og for å teste effekten av denne tilnærmingen før man vurderer kliniske studier.
Takk
Vi takker Paul Van Schil (Antwerpen, Belgia ) for hans slag velkommen og presis undervisning av den kirurgiske teknikken. Vi takker også Valentin Derangere, Jean-Baptiste Lequeu, Thierry Benard, Philip Bastable og Pablo Ortega-Deballon for deres entusiastiske støtte til dette arbeidet.
