Abstract
AS1411 (tidligere kjent som AGRO100) er en 26 nukleotid guanin rike DNA aptamer som danner en guanin quadruplex struktur. AS1411 har vist lovende verktøy som behandling for kreft i fase I og fase II kliniske studier uten å forårsake store bivirkninger. AS1411 hemmer tumorcellevekst ved å binde seg til nucleolin som er abnormt uttrykkes på cellemembranen av mange tumorer. I denne studien benyttet vi en enkel teknikk å bøye en mye brukt kjemoterapeutisk middel, doxorubicin (Dox), til AS1411 å danne et syntetisk narkotika-DNA addukt (DDA), betegnes som AS1411-Dox. Vi demonstrerer nytten av AS1411-Dox ved behandling av hepatocellulært karsinom (HCC) ved å evaluere målrettet levering av Dox til Huh7-celler
in vitro
og i en murin xenograft modell for HCC.
Citation: Trinh TL, Zhu G, Xiao X, Puszyk W, Sefah K, Wu Q, et al. (2015) En syntetisk Aptamer-Drug Addukt for målrettet leverkreft Therapy. PLoS ONE 10 (11): e0136673. doi: 10,1371 /journal.pone.0136673
Redaktør: Ratna B. Ray, Saint Louis University, USA
mottatt: 12 mars 2015; Godkjent: 06.08.2015; Publisert: 02.11.2015
Copyright: © 2015 Trinh et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:. forfatterne takker National Institute of Heath for tildeling av midler til dette prosjektet R01 CA133086 til (CL) og (WT). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hittil eneste kurative behandlinger for leverkreft er levertransplantasjon eller tumor reseksjon. Ofte leverkreft oppdages ved sent stadium, og det finnes i dag få kjemoterapeutiske behandlinger tilgjengelig. Sorafenib og doxorubicin er stoffer som danner grunnlaget for systemisk kjemoterapi behandlinger som brukes til å behandle leverkreft. Men disse behandlingene er palliativ og bare forsinkelse svulst utvikling og progresjon. Disse uønskede behandlinger av leverkreft er ikke svært vellykket, og kan føre til iatrogen sykdom på grunn av off-target bivirkninger. Derfor behandlingsmetoder som spesifikt retter svulstvev er svært ønskelig. Målrettet terapi oppnår selektiv levering av legemiddel mediert av gjenkjennelseselementer som kan binde seg med høy affinitet til overuttrykt reseptorer på målet kreftceller [1]. Mulige anerkjennelse elementer inkluderer; antistoffer [2], vitaminer [3,4], og særlig aptamerer [5]. Nukleinsyre aptamerer er enkelt-trådet (ss) oligonukleotider med unike intramolekylære konformasjoner med evne til å gjenkjenne spesifikke molekylære mål. Oligonukleotid aptamerer er vanligvis isolert gjennom systematisk Evolution of ligander ved eksponentiell berikelse (SELEX) [6,7]. Kreftcelle-spesifikke aptamerer kan isoleres direkte ved hjelp av levende cancerceller, ved hjelp av Cell-SELEX [8]. Aptamerer holde mange fordeler fremfor andre gjenkjenningselementer [9]. SELEX er vanligvis mer effektivt og kostnadseffektivt enn antistoffutvikling. Advantagous funksjoner i oligonukleotid aptamerer inkluderer; lette automatisert syntese, enkel modifisering av funksjonelle deler, høy stabilitet, lang holdbarhet, lav immunogenisitet, og den enkle motgift utvikling av antisense DNA-syntese [10,11]. Disse fordelene gjør aptamerer en attraktiv metode for biomedisinske eller kliniske applikasjoner, inkludert målrettet terapi.
konjugater av narkotika og anerkjennelse elementer (f.eks antistoff-medikamentkonjugater) har blitt nøye studert av ledende farmasøytiske selskaper for å oppnå målrettet terapi [2,12]. Aptamerer, på grunn av deres iboende fordeler, er forventet å spille en viktig rolle i målrettet levering av terapeutiske midler i fremtiden. Den enkle stedsspesifikke kjemisk modifisering av aptamerer stor grad forenkler konjugering med narkotika, inkludert kjemoterapeutika og fotosensibiliserende, eller med nanomaterialer, som for eksempel karbon nanorør eller gull nanopartikler [13,14]. I tillegg nukleinsyre aptamerer er svært stabil, noe som gir en verdifull mulighet til å utforme aptamer-terapeutiske konjugater gjennom en rekke kjemiske reaksjoner eller ved dannelse av fysiske komplekser. Vi har utviklet et syntetisk stoff-DNA addukt (DDA) teknologi for enkel og effektiv narkotika-DNA konjugering, inspirert av de naturlig dannet addukter mellom nukleinsyrer og ulike kjemikalier, slik som de dannet mellom genomisk DNA og Dox under administrasjon av Dox. DDAs er stabile ved relativt lave temperaturer (for eksempel 4 ° C) for langtidslagring, men er i stand til å frigjøre legemidler ved fysiologiske temperaturer (ca. 37 ° C). Bemerkelsesverdig er den DNA-ryggraden i DDAs også motstandsdyktig mot nuklease spaltning, mest sannsynlig på grunn av den steriske hindring hindrer nuklease-binding. De kombinerte funksjonene i DDA-teknologi gjør det til en lovende metode for utvikling av nye behandlingsformer for målrettet leveren kreftbehandling.
I dette arbeidet har vi fokusert på AS1411 (AGRO100), en velkjent DNA aptamer, for tiden i fase II kliniske studier for behandling av akutt myelogen leukemi (AML) og nyrecellekreft (RCC) [15,16]. Flere studier har vist at AS1411 binder til plasmamembranen nucleolin, som er sterkt uttrykt av mange kreftcelletyper, og induserer tumorcelle-apoptose [17-19]. Selv om effekten av AS1411 er blitt vurdert i mange kreftformer, er den terapeutiske styrken av denne aptamer ofte begrenset. For å løse dette problemet, her har vi utviklet et AS1411-doxorubicin addukt (AS1411-Dox) å kombinere målretting evne AS1411 og den terapeutiske styrken av Dox. Vi evaluerte nytten av AS1411 og AS1411-Dox i en leverkreft (HCC) modell. Resultatene identifisere AS1411-Dox addukt som en roman legemiddel for behandling av HCC.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Prøver ble oppnådd med godkjenning av University of Florida Gainesville Health Science Center Institutional Review Board (IRB-01). Sammenkoblet tumor og ikke-tumor levervev ble anvendt i denne studien. Vi har også fått egen godkjenning for generering av cellelinjen HCO2 (utviklet fra en HCV /HBV-free HCC vev i vår lab). Ingen donororganer ble hentet fra henrettede fanger eller andre institusjonaliserte personer. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag. Alle dyrestudier ble godkjent av University of Florida Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
Aptamer DNA forberedelse
Alle DNA-prober ble syntetisert på en ABI3400 DNA /RNA synthesizer (Applied Biosystems , Foster City, CA, USA). Biotin ble koblet på 5′-enden av DNA-prober for strømningscytometri-analyse. De ferdige sekvensene ble deretter avbeskyttes i AMA (ammoniumhydroksyd /40% vandig metylamin 1: 1) ved 65 ° C i 30 minutter og ytterligere renset ved revers-fase HPLC (ProStar, Varian, Walnut Creek, CA, USA) videre en C-18 kolonne ved anvendelse av 0,1 M trietylamin acetat (TEAA, Glen Research Corp) og acetonitril (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) som elueringsmiddel. DNA-produktene ble tørket og deretter detritylerte ved å løse opp og inkubering av DNA-produktet i 200 ul 80% eddiksyre i 20 minutter. Den detritylerte DNA-produktene ble deretter utfelt med NaCl (3 M, 25 mL) og etanol (600 ul). UV-Vis-målinger ble utført med et Cary Bio-100 UV /Vis-spektrometer (Varian) for sonde kvantifisering.
Cellekultur
Alle kreftcellelinjer med unntak HCO2 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). HCO2 ble utviklet fra en HCV /HBV-free HCC vev i vårt laboratorium. Hu767, en primær hepatocytter prøve ble erholdt fra en frisk donor fra Cellz Direct (Raleigh, NC). Celler ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (varme-inaktivert, GIBCO) og 100 IU /ml penicillin-streptomycin (Cellgro) ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 5% CO
2 . Celletettheten ble bestemt før hvert forsøk ved hjelp av en hemocytometer.
Utarbeidelse og karakterisering av AS1411-Dox addukt
Ved hjelp av en modifisert protokoll [20], AS1411-Dox addukt ble utarbeidet ved å inkubere Dox (500 uM), DNA (20 uM), og formaldehyd (0,37%) i reaksjonsbuffer (20 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl og 0,5 mM EDTA; pH 7,0) ved 10 ° C over natten. Det resulterende DDA ble renset ved reversfase væskekromatografi (HPLC) (ProStar, Varian, Walnut Creek, CA, USA) på en C-18-kolonne, ved anvendelse av 0,1 M trithylamine acetat (TEAA, Glen Research Corp) og acetonitril (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) som elueringsmiddel. Rensede prøver ble lyofilisert, avsaltet og dissoved i Dulbeccos buffer (Sigma Aldrich), og lagret ved -20 ° C for fremtidig bruk. Molar ekstinksjonskoeffisienter av 11500 M
-1cm
1 ved 480 nm gratis Dox og 7677 M
-1cm
1 ved 506 nm for kovalent bundet Dox i addukt ble brukt for narkotika kvantifisering av UV-Vis spektrometri [20]
Studier av spesifikke bindingsevnen og bindende affinitet
De bindende evner aptamerer eller narkotika aptamer addukter. (konsentrasjoner endelige DNA: 200 nM) ble bestemt ved hjelp av flowcytometri. Celler (2 x 10
5) ble inkubert i bindingsbuffer (200 ul, 4,5 g /l glukose, 5 mM MgCl
2, 0,1 mg /ml gjær tRNA (Sigma Aldrich) og 1 mg /ml BSA ( Fisher Scientific) i Dulbeccos PBS (Sigma)) på is i 30 min, etterfulgt av vasking to ganger med vaskebuffer (1 ml, 4,5 g /l glukose og 5 mM MgCl
2 i Dulbeccos PBS (Sigma)). Utfelte celler ble suspendert i bindingsbuffer (200 ul) før strømningscytometri-analyse på en FACScan-cytometer (BD Immunocytometry Systems). Data ble analysert med WinMDI programvare. Bindingsaffiniteten av hver probe ble bestemt ved anvendelse av en serie av probe-konsentrasjoner. Som negative kontroller, tilsvarende analyser ble utført ved hjelp av tilfeldige DNA-sekvenser (tilfeldig bibliotek) på de samme tilsvarende konsentrasjoner. Den økte midlere fluorescensintensitet av celler som er bundet av fargestoff-merkede prober ble sammenlignet med celler som er bundet av fargestoff-merket tilfeldige sekvenser. Disse fluorescens-verdier ble anvendt for å beregne dissosiasjonslikevektskonstant (
K
d
) ved montering av avhengighet av fluorescensintensiteten av celler som er bundet av sonder (
F
) på sonden konsentrasjon (
L
) til ligningen: Hvor B
max representerer den maksimale bindingskapasitet. Hver bindingsanalysen Forsøket ble gjentatt uavhengig i tre eksemplarer.
Intracellulær legemiddeldosering
Drug utgivelse i celler ble evaluert med konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM). Alle cellulære fluorescerende bilder ble samlet på en Leica TCS SP5 konfokal mikroskop (Leica Microsystems Inc., Exton, PA) med en 63x oljeneddyppingsobjektivet og Leica Confocal Software. Celler ble observert i DIC modus. Cellene ble behandlet med gratis Dox (2 mm), AS1411-Dox addukt, eller kontroll DNA-Dox adduktpartiklene (2 mikrometer Dox ekvivalenter). Legemidler ble suspendert i Dulbeccos PBS og cellene ble inkubert (37 ° C, 5% CO
2) i 1 time. Inkubasjon ble etterfulgt av Hoechst farving med Hoechst 33342 (10 ug /ml) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) i 30 minutter før vasking med Dulbeccos PBS. De resulterende cellene ble deretter observert i henhold mikroskop.
Selektiv cytotoksisitet
Cell cytotoksisitet ble evaluert med CellTiter 96 celleproliferasjonsanalyse (Promega, Madison, WI, USA). Celler (5 × 10
4 /brønn) ble behandlet med gratis Dox, AS1411, kontrollere DNA-Dox addukt, og AS1411-Dox addukt (henholdsvis) i FBS fritt medium. Alle behandlingene ble suspendert i PBS. Etter inkubasjon i 1 time (37 ° C, 5% CO
2), ble mediet fjernet, og friskt medium (10% FBS, 100 IU /ml penicillin-streptomycin, 200 pl) ble tilsatt for ytterligere cellevekst (48 h). Deretter ble mediet fjernet igjen, og CellTiter reagens (20 ul) fortynnet i friskt medium (100 pl) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 1-2 timer. Absorbansen (490 nm) ble registrert ved hjelp av en mikroplateleser (Tecan Safire mikroplateleser, AG, Sveits). Celleviabilitet ble bestemt i henhold til produsentens beskrivelse.
Farging av vev ved hjelp AS1411-Biotin
FFPE- (formalinfiksert parafin embedded) lever kreft vevssnitt hentet fra pasienter ble utsatt for farging hjelp AS1411 aptamer . Vevssnittene ble deparaffinized to ganger i xylen i 15 minutter hver, vasket med serie på 100%, 95%, 80% og 70% for 1 min hver og skylles med destillert vann. Vevssnitt ble så inkubert i 10 mM natriumcitratbuffer (pH 6.2) ved 95 ° C i 30 minutter, ble prøver så mikrobølgebehandlet i 2 minutter og tillatt å avkjøles ved romtemperatur. Etter å ha blitt vasket to ganger i PBS i 5 minutter hver, ble vevssnitt inkubert i 3% H
2o
2 i PBS i 30 minutter og deretter blokkert med biotin-blokkeringsløsning (Vector, Laboratories). Vevssnitt ble deretter probet med 200 nM AS1411-biotin i 1 time ved romtemperatur og vasket 3 ganger i 0,5% PBST og inkubert med HRP-konjugert streptavidin-oppløsning (Dako) i 30 minutter ved romtemperatur. Til slutt, vevssnitt ble behandlet med DAB-peroksidase-substrat-oppløsning (Dako) inntil fargen utviklet (ca. 5 min). Stained vevssnitt ble undersøkt og bildene ble tatt av et lysmikroskop.
Immunocytochemistry av leverkreftceller ved hjelp AS1411-FITC
Celler ble sådd på Superfrost objektglass (Fisherbrand) på dagen før farging . Celleglassene ble vasket to ganger i PBS i 5 minutter hver, blokkert i 5% BSA i PBS og inkubert med 200 nM av AS1411-FITC i 1 time ved romtemperatur. Objektglassene ble deretter vasket 3 ganger i 0,5% PBST og montert med Vectashield monterings reagens inneholdende DAPI (Vector Laboratories). Lysbilder ble undersøkt under et konfokal mikroskop.
Western blotting-analyse
Hjerte, nyre og tumorvev ble tatt fra hver mus ved avslutning av studien. Vev ble lysert i RIPA-buffer inneholdende Proteinase Inhibitor Cocktail (Sigma Aldrich) og inkubert på is i 30 min. Etter sentrifugering ved 13300 x g i 15 min ved 4 ° C ble supernatanten overført til et nytt rør og konsentrasjonen av protein ble bestemt ved Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad) ifølge produsentens protokoll. Protein ble analysert på 12% SDS-PAGE-geler. Proteinene ble deretter overført på nitrocellulosemembraner og probet med spaltede caspase-3-antistoff (Cell Signaling Technology, Inc.), fulgt av det passende sekundære antistoff med HRP-konjugert (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Immunoreaktive bånd ble påvist ved anvendelse av SuperSignal West Pico Substrat (Thermo Scientific).
Cell syklus detektering ved strømningscytometri ved bruk av propidium jodid.
Hver brønn i en 6-brønns plate ble podet med 100000 Huh7 lever kreftceller og behandlet med 5 uM av AS1411 i 24 timer eller 48 timer. Ved slutten av behandlingen ble cellene trypsinert og deretter oppsamlet og vasket to ganger i iskald PBS. Cellene ble deretter fiksert med iskald 70% etanol ved -20 ° C i 30 minutter. Cellene ble deretter vasket to ganger i kald PBS og deretter inkubert med rykende 20 ug /ml propidiumjodid og 100 ug /ml RNaseA i kald PBS i 1 time ved 4 ° C i mørket. Cellesyklus ble analysert ved hjelp av strømningscytometri, fulgt av påføring av FlowJo programvare.
In vivo eksperimenter
NOD. Cg-Prkdc (SCID) IL2 mus ble kjøpt fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) og ligger ved Dyreavdelingen ved University of Florida, ble protokollen godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité. Svulsten xenograft mus modell ble utviklet av subkutant sprøyte 5×10
6 av in vitro-formert Huh7 HCC celler (i 100 ul DPBS buffer) i mus på høyre flanke. Rygg tumornoduler fikk lov til å vokse til et volum på ~ 100 mm
3 før behandlingsstart. Tumor-bærende mus ble tilfeldig inndelt i fire grupper, med 5 mus i hver gruppe: (i): behandlet med AS1411; (Ii): behandles med gratis Dox, (iii): behandlet med kontroll DNA-Dox addukt; og (iv): behandlet med AS1411- Dox addukt. Den doksorubicin dosering ble holdt i samme i gruppe (ii), (iii) og (iv) med 2 mg /kg; og AS1411 dosering i gruppe (i) ble derfor opprettholdt som er lik den i gruppe (iv). Legemidler ble administrert gjennom halevene-injeksjon hver annen dag, etterfulgt av tumorstørrelse måling. Kroppsvekten av hver mus ble også målt hver annen dag for å overvåke potensialet legemiddeltoksisitet. Ved slutten av undersøkelsen ble musene avlivet humant; hjerte, nyre og tumorvev ble samlet når tumorvolumet overskredet 2000 mm
3 eller utviklet sårdannelse.
Resultater og Diskusjon
AS1411 Aptamer bindende affinitet for leverkreft cellelinjer og pasient svulstvev
Nucleolin er abnormt uttrykkes på cellemembranen av mange tumortyper, inkludert glioma, prostata og leverkreft [21-24]. Som AS1411 virker ved først å binde seg til cellemembranen nucleolin [19], søkte vi å bestemme tilstedeværelsen av celleoverflate-ekspresjon nucleolin i HCC cellelinje Huh7 og i en kultur av humane primære hepatocytter Hu767. Ved strømningscytometri-analyse av immunfarget celler, observerte vi at nucleolin ble uttrykt på cellemembran av Huh7-celler, men ikke i Hu767 celler (figur 1A). For å avgjøre om AS1411 kan være nyttig som en markør for HCC tumor bildebehandling, vi konjugert AS1411 til FITC og utført flekker på to HCC cellelinjer; Huh7-celler og HCO2-celler, en ny HCC cellelinje utviklet i vårt laboratorium (figur 1B). Likeledes ble AS1411-Biotin anvendes for å utvikle immunhistokjemisk farging av parafin-innleiret HCC pasienter tumorprøver. 21 HCC svulst vevsprøver (formalinfiksert og parafin embedded) fra HCC pasienter ble analysert, og i 15 prøver AS1411 ble funnet å fortrinnsvis binde i tumor regioner sammenlignet med tilstøtende ikke-svulstvev. AS1411 viste den sterkeste flekker rundt kjernen, hvor nucleolin er den mest tallrike. Imidlertid AS1411 også farget membranen og cytoplasma av leverkreftceller klart skille tumorvevet, noe som indikerer avvikende transport av nucleolin gjennom HCC tumorceller (figur 1C venstre panel). Signaldeteksjon på ikke-svulstvev ble begrenset til kjernen (panel figur 1C høyre). Ytterligere data bekrefter at AS1411 flekker membranen av tumorceller og fortrinnsvis flekker lever svulstvev, sammenlignet med nucleolin antistoff som ofte bare flekker atom nucleolin (S1 og S2 figurene). Resultatene indikerer at AS1411 bindes fortrinnsvis til leveren kreftceller og kan skille tumor og ikke-tumorvev ved forskjellen i fargeintensitet. Dataene viser at AS1411 er en egnet kandidat for videre utvikling som en Drug-DNA addukt for den spesifikke målrettingen av leverkreft.
(a) Nucleolin oppdages på celleoverflaten av Huh7 (til venstre), men ikke på Hu767 (primær hepatocytter, høyre). 1 million celler av hver cellelinje ble inkubert med 2UG /ml Nucleolin antistoff og 1 ug /ml, sekundært antistoff fra mus-FITC i 1 time ved 4 ° C, hvilket ble etterfulgt av strømningscytometri. (B) AS1411 kan flekke membran nucleolin på Huh7 og HCO2. Levende celler ble inkubert med 200 nM av AS1411-FITC i 30 minutter ved romtemperatur og undersøkt under et konfokalt mikroskop. (C) AS1411 flekker membran nucleolin i tumorvev, men bare atom nucleolin av ikke-svulstvev. Parafin innleiret vevsprøver fra pasienter ble inkubert med 200 nM av AS1411-biotin i 1 time ved romtemperatur. Signal ble utviklet ved hjelp av HRP-konjugert streptavidin og DAB peroxydasesubstrat (Dako).
Vurdering av AS1411 cytotoksisitet i HCC cellelinjer
AS1411 har cytotoksiske egenskaper mot brystkreft og forbedrer effektiviteten av kjemoterapi i glioma behandling [25,26]. For å kunne vurdere eventuelle cytotoksiske effektene av AS1411 på leveren kreft celler
in vitro
vi inkuberes Huh7 celler med ulike konsentrasjoner av AS1411 fra 1 mikrometer til 10 mikrometer i 48 timer. Etter inkubering cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTS-analyse. Ingen effekt ble observert i Huh7-celler som ble behandlet med en lav dose av AS1411. Imidlertid redusert celleproliferasjon ble observert i celler behandlet med AS1411 konsentrasjoner på 5 uM eller høyere (figur 2A). Vi fant ingen åpenbare induksjon av celle apoptose, AS1411 ble tidligere rapportert å indusere tumor celle apoptose [25]. Derfor søkte vi å undersøke i hvilken grad der Huh7 celler blir hemmet av AS1411. Cellesyklusanalyse ble utført ved flowcytometri på celler behandlet med AS1411 i 24 og 72 timer. Behandling av Huh7 celler med fem mikrometer AS1411 induserte en økning i celler arrestert i S-fasen og G2 /M fase. Prosentandelen av celler arrestert i S-fasen økte fra 7,92% til 14,7% etter 72 timers behandling (Fig 2B og 2C). En større effekt ble observert ved behandling med AS1411 med celler arrestert i G2 /M fase; med prosentandelen av celler pågrepne øker fra 17,4% til 31,5% etter 24 timers behandling og opp til 35,5% etter 72 timers behandling (figur 2C). Arrest i G2 /M sjekkpunkt kan gjøre det mulig celler til å gjennomgå apoptose og innsats for å øke G2 /M arrest kan øke følsomheten av celler, til kjemoterapeutiske intervensjoner [27-29]. Disse resultatene tyder på at AS1411 av seg selv inhiberer Huh7-celleformering i en doseavhengig måte, og at mens AS1411 ikke direkte induserer cytotoksiske virkninger i target Huh7 celler som den gjør hemme tumorcelleformering i en viss grad ved å indusere G2 /M arrest. Selv om bare over en eneste tredjedel av cellene ble arrestert i G2 /M ved behandling med 5 uM AS1411, kan høyere doser vise seg å være mer effektiv, slik som antydet ved en ytterligere reduksjon av levedyktige celler etter behandling med 10 uM som indikert ved cellenes levedyktighet analyse (fig 2A). Denne effekten kan bli ytterligere forsterket ved kombinasjon med et kjemoterapeutisk middel for behandling av leverkreft. Vi besluttet å kombinere doksorubicin (Dox) med AS1411 for å danne AS1411-Dox-adduktet.
(a) Huh7 ble inkubert med AS1411 i konsentrasjoner fra 1 uM til 10 uM i 2 dager ved 37 ° C og deretter underkastet MTS analysen. (B) cellesyklus arrest ble testet ved flowcytometri av PI-farget celler. FLOW dataene indikerer cellesyklusarrest i AS1411 behandlede celler og cellesyklusen i prosent (c) Analyse av flowcytometri data viste at en mye større andel av behandlede celler ble arrestert ved S og G2 /M-fasene, sammenlignet med ubehandlede celler.
Utarbeidelse og nytten av AS1411-Dox addukt
Dox er en mye foreskrevet kjemoterapeutisk brukt i kreftbehandling. Dox er istand til å danne addukter med DNA [30,31]. Dox addukt ble fremstilt ved å inkubere Dox med formaldehyd, som ble anvendt som reduksjons og tverrbindingsmiddel i løpet av adduktdannelse. Spesielt ble AS1411-Dox-adduktet fremstilt ved å inkubere aptamerer med Dox og formaldehyd i reaksjonsbuffer ved 10 ° C over natten (figur 3A). Residual aptamer, medikament, og formaldehyd ble fjernet fra reaksjonsblandingen ved hjelp av reversfase-væskekromatografi (HPLC). Resultatene indikerer at DDA viste sterk absorbans ved 260 nm (fra medikament og DNA) samt noen absorbans fra 490 nm (utelukkende fra medikament) (S3 Fig). Renset addukt ble frysetørket og avsaltet. UV-Vis spektrometri resultatene ytterligere bekreftet den karakteristiske stoffet absorbans rundt 490 nm i renset DDA (Fig 3C). Basert på tidligere rapporter, molar ekstinksjonskoeffisient på 7677 M
-1cm
1 ved 506 nm for Dox i DDA ble brukt for narkotika kvantifisering i addukt [20]. Følgelig ble AS1411-Dox addukt bestemt til å ha 5,4 ± 0,1 (S.D., n = 3) kopier av Dox-grupperinger pr AS1411 tråd. Tilsvarende er en ikke-bindende kontroll-DNA (tabell S1) ble også brukt til å fremstille en kontroll addukt med Dox (kontroll-Dox).
(a) Skjematisk beskrivelse av fremstillingen av AS1411-Dox addukt ved inkubering Dox (500 uM), AS1411 (20 uM), og formaldehyd (0,37%) ved 10 ° C over natten, fulgt av rensing ved reversfase-HPLC. (B) AS1411-Dox addukt forble sin bindende affinitet mot Huh7 etablert av dissosiasjonslikevektskonstant (
Kd
). (C) UV-Vis-spekteret viser absorbansen renset AS1411-Dox-addukt, med den karakteristiske absorbanstoppen av Dox ved 490 nm. (D) Strømningscytometri resultater indikerer innpassing evne AS1411 og AS1411-Dox-adduktet til Huh7 HCC celler, merk den ikke-spesifikke DNA-bibliotek detekterer ikke Huh7-celler (e) tilfeldig bibliotek og kontroll-DNA aptamerer og kontroll-DNA-Dox addukt i motsetning var ikke i stand til å spesifikt binde seg til Huh7 celler.
Som vi har vist, AS1411 var i stand til å binde seg til målet Huh7 leveren kreftceller. Vi deretter vurdert om den resulterende AS1411-Dox addukt opprettholdt innpassing muligheten til å målrette kreftceller. AS1411 og kontrollsekvensen ble biotinylert ved 5′-ende og anvendes til fremstilling av addukter med Dox. Streptavidin-PE (Phycoerythrin) konjugat farvestoff ble anvendt i flowcytometri å overvåke fluorescens fra celler inkubert med enten AS1411-Dox eller kontroll-Dox. Ukonjugert AS1411 ble anvendt som en positiv kontroll, og et bibliotek av tilfeldige DNA-sekvenser ble anvendt som en negativ kontroll. Intens celle farging av Huh7-celler ble observert ved inkubering med AS1411-Dox-addukt, noe som indikerer at narkotika-aptamer konjugat opprettholdt den spesifikke bindingsevne av det opprinnelige aptamer. Det fluorescerende intensitet var sammenlignbare med celler inkubert med AS1411, noe som tyder på en minimal effekt på bindingsevne av adduktet, når sammenlignet med ukonjugert aptamerer. I motsetning til dette, heller ikke den negative kontroll-DNA, og heller ikke kontroll-Dox addukt bundet til Huh7 celler (figur 3D). Bindingsaffinitetene av AS1411 og AS1411-Dox addukt for Huh7 celler ble videre undersøkt ved å bestemme dissosiasjonskonstant (
K
d
). Den AS1411-Dox addukt hadde en
K
d
av 57,3 ± 8,1 nM (sd n = 3), med AS1411-Dox addukt også binding til målet Huh7 celler med sterk affinitet .
K
d
verdien av AS1411-Dox er sammenlignbar med ofAS1411 (
K
d
= 54,8 ± 7,3 nM) (figur 3B). Den svakt redusert bindingsaffinitet for AS1411-Dox addukt kan skyldes små konformasjonelle endringer forårsaket av Dox-DNA adduktdannelse. Dox danner metylen linker til N2 av DNA-trådene (S4 fig). Dette er et viktig problem som må undersøkes nærmere ved NMR-spektroskopi for å belyse den fullstendige struktur av AS1411-Dox. Men disse effektene er minimal og AS1411-Dox beholder evnen til spesifikt å binde Huh7 celler. Disse dataene gir grunnlag for nedstrøms applikasjoner målrettet leverkreft terapi.
Intracellulær narkotika utgivelse fra AS1411-Dox addukter
De intracellulære atferd av gratis Dox og AS1411-Dox addukt ble undersøkt ved hjelp av konfokal laser scanning mikroskopi. I denne studien ble Huh7 celler inkubert med enten; fri Dox, den AS1411-Dox addukt, eller kontroll-DNA-Dox-addukt. Inkubasjon ble etterfulgt av farging med Hoechst 33342 for å lokalisere kjernen før mikroskopi observasjon. Free Dox hurtig akkumulert i cellene, som vist ved intens intracellulære fluorescens Dox (figur 4A). Intens medikament fluorescens ble også observert i Huh7-celler inkubert med AS1411-Dox-addukt, som indikerer opptak av dette addukt og medikamentfrigjøring fra adduktet. I kontrast, celler behandlet med kontroll-DNA-Dox addukt vist nokså svak medikament fluorescens. Etter å ha fastslått at AS1411-Dox addukt kan spesifikt gjenkjenne målrette Huh7 lever kreftceller, og levere Dox inn i denne målcellen, påfølgende
in vitro
cytotoksisitet ble evaluert av en MTS analyse. Celler ble behandlet med fri Dox og AS1411-Dox-addukt, henholdsvis, med en rekke doksorubicin konsentrasjoner. Mens verken aptamer AS1411 alene eller kontroll-Dox addukt indusert potent cytotoksisitet, både gratis Dox og AS1411-Dox addukt viste sammenlignbar doseavhengig cytotoksisitet i mål Huh7 celler (figur 4B). Disse data viser at de AS1411-Dox-addukter beholde spesifisiteten for binding til Huh7-celler
in vitro
og at konjugering av Dox til AS1411 forhindrer ikke Dox-mediert cytotoksisitet til målceller. Samlet utgjør disse dataene viser at AS1411-Dox addukt er i stand til å spesifikt mot Huh7 celler
in vitro
, effektivt levere Dox i delmål, celler og redusere celleviabilitet til et tilsvarende nivå som i fri Dox. Dataene indikerer også at adduktdannelse ikke hemmer intracellulær frigjøring av Dox. Disse resultatene motiverte oss til å teste effekt og mulige bivirkninger av AS1411-Dox
in vivo
, ved hjelp av en xenograft modell av Huh7 svulster hos mus.
(a) Confocal laser scanning mikroskopi bilder viser opptak av Dox inn Huh7 celler behandlet med 2 mikrometer gratis Dox, AS1411-Dox addukt eller styre DNA-Dox addukt, henholdsvis. Etter behandling ble cellene farget med Hoechst 33342 (skala bar: 50 mikrometer). Gratis Dox gått inn i noen celler; imidlertid bare Dox festet til AS1411 og ikke kontroll aptamer ble selektivt levert til Huh7-celler på grunn av bindingsaffiniteten til AS1411. (B) Cellene ble behandlet i 1 time med enten; 2 mikrometer gratis Dox, AS1411, AS1411-Dox addukt eller kontroll-DNA addukt., Før MTS analysen. Resultatene indikerer den spesifikke og potent cytotoksisitet i mål Huh7 celler indusert av AS1411-Dox addukt.
In vivo evaluering av AS1411-Dox addukt for målrettet leveren kreftbehandling
Det er flere godt dokumentert store bivirkninger av doxorubicin behandling, inkludert; vekttap, cardio cytotoksisitet og nephro cytotoksisitet [32-38]. Doksorubicin er svært giftig og administreres intra-lever i normale omstendigheter [39]. For å bestemme effekten av AS1411-Dox addukt, ble en murin modell av HCC testet. Den AS1411-Dox addukt ble fremstilt som beskrevet, og fast bestemt på å ha ca 5,4 ± 0,1 kopier av Dox per hver strand av AS1411. Igjen har vi brukt et kontroll-DNA-sekvens som ikke bindes til målet leverkreftceller, for å fremstille en kontroll-Dox-addukt. I korte trekk, NOD Cg-Prkdc (SCID) IL2 mus ble hver inokulert med 1 million Huh7 celler. Rygg tumornoduler fikk lov til å vokse til et volum på ~ 100 mm
3 før behandlingsstart. Tumor-bærende mus ble tilfeldig inndelt i 4 grupper (n = 5), og ble behandlet ved halevene-injeksjon med enten; (I) AS1411, (ii) fri Dox, (iii) kontroll-Dox-addukt, eller (iv) AS1411-Dox-addukt, respektivt. Dox dosering ble holdt ved 2 mg /kg, og doseringen av AS1411 i grupper (i) og (iv) var like. Tumorstørrelse og mus vekt ble målt hver annen dag, som indekser av legemidlets effekt og ikke-spesifikk cytotoksisitet. Den gjennomsnittlige tumor vekst ble beregnet tilsvarende (figur 5A).
