Abstract
Nyrecellekarsinom (RCC) er den mest dødelige typen urin kreft på grunn av sin okkulte angrep og motstand mot cellegift og stråling. Nylig har akkumulerende bevis antydet flekker, inhibitorer av 3-hydroksy-3-metyl-glutaryl-koenzym A (HMG-CoA) reduktase, ble forbundet med risiko reduksjon av kreft. I denne studien ønsket vi å undersøke mulige effekter av simvastatin på RCC celler og de underliggende mekanismene som simvastatin utøves sine handlinger. Med celleviabilitet, kolonidannelsen, og flowcytometrisk apoptose-analyser fant vi at simvastatin potente trykkes cellevekst av A498 og 786-O-celler i en tids- og doseavhengig måte. Konsekvent, xenograft modell utført i naken mus viste redusert tumorvekst med simvastatin behandling. I tillegg ble den hemmende effekten av simvastatin om migrasjon og invasjon også observert i
vitro
. Mekanisk, presenterte vi at simvastatin kunne undertrykke spredning og motilitet av RCC celler via hemme fosforylering av AKT, mTOR, og ERK i et tids- og doseavhengig måte. Ytterligere undersøkelser av den underliggende mekanisme avslørte simvastatin kunne utøve anti-tumor-effekter ved å hemme IL-6-indusert fosforylering av JAK2 og STAT3. Som konklusjon, disse resultatene antydet at simvastatin-indusert apoptose og dens antimetastase-aktivitet i RCC-celler ble ledsaget av hemming av AKT /mTOR, ERK, og JAK2 /STAT3 veier, noe som innebærer at simvastatin kan være et potensielt terapeutisk middel for behandlingen av RCC pasienter
Citation. Fang Z, Tang Y, Fang J, Zhou Z, Xing Z, Guo Z, et al. (2013) Simvastatin hemmer Nedsatt kreft celle vekst og metastasering via AKT /mTOR, ERK og JAK2 /STAT3 Pathway. PLoS ONE 8 (5): e62823. doi: 10,1371 /journal.pone.0062823
Redaktør: Zhongjun Zhou, The University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 15 januar 2013; Godkjent: 26 mars 2013; Publisert: 17 mai 2013
Copyright: © 2013 Fang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr 81172435). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nyrecellekarsinom (RCC) er den vanligste typen av nyrekreft, står for ca 90-95% nyre svulster [1]. På verdensbasis har dødeligheten på grunn av RCC skredet 100.000 pasienter årlig [2]. 25-30% av pasientene utvikler metastaser ved diagnose av RCC [3], med overlevelse ≥5 år i området fra 5% til 10%, og total median overlevelse på mindre enn ett år, [4], [5]. Kirurgisk inngrep er den primære behandling for lokaliserte RCC, men alene det har begrenset nytte hos pasienter med aggressive sykdom [1]. I tillegg har tradisjonelle cytostatika og immunterapi ikke klarte å demonstrere en fordel for pasienter i adjuvant [6]. De siste årene har sett en rask utvikling av molekylær målrettet terapi [7]. Blant de første linje målrettet terapi, sunitinib og temsirolimus er den mest representative, som kan blokkere signalveien av flere reseptor tyrosin kinaser (RTK) og mammalian target of rapamycin (mTOR) henholdsvis [8], [9]. Ikke desto mindre, ingen av inngrep ville bli betraktet som kostnadseffektivt ved en vilje til betaling terskel på 30.000 pounds per kvalitetsjusterte leveår [10]. Dermed er det et stort behov for behandling som kan forlenge overlevelsen uten sterkt økende kostnader eller svekke kvaliteten på pasientenes liv.
Statiner (eller 3-hydroxy-3-metylglutaryl koenzym A [HMG-CoA] reduktase inhibitorer) er en gruppe av stoffer, som er strukturelle analoger av HMG-CoA som hemmer omdannelsen av HMG-CoA til mevalonat [11], [12]. Utover sine kolesterolsenkende effekter, statiner utviser mange pleiotrope effekter, inkludert anti-betennelse og immunmodulering [13], [14], reduksjon i risikoen for ulike former for demens [15], og en reduksjon i proteinuri og progresjon av nyre sykdom [16], [17]. Av betydning, frem bevis viste at statiner kunne oppvise antineoplastiske effekter i en rekke kreftceller [18], inkludert prostata kreft [19] – [22], brystkreft [23] – [25], hepatisk cancer [26], [ ,,,0],27] og tykktarmskreft [28], [29]. Oppmuntrende, en retrospektiv nested case-control studie som involverte 500.000 veteraner rapporterte en beskyttende rolle av statiner mot utvikling av RCC [30]. Men den nøyaktige effekten av simvastatin mot RCC celler og de underliggende molekylære mekanismene er ikke godt dokumentert.
I dette arbeidet, våre data etablere veksthemmende og pro-apoptotiske effekten av simvastatin på RCC celler både i
vitro Hotell og i
vivo
. Samtidig finner vi også at simvastatin kan potente redusere migrasjon og invasjon av RCC celler. Videre undersøkelser av de underliggende mekanismene indikerer AKT /mTOR, ERK og JAK2 /SAT3 trasé spiller sentrale roller i disse handlingene. Våre funn tyder på kliniske implikasjoner av simvastatin i behandling av RCC pasienter.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Dyret forsøksprotokoll holdt Animal Ledelse Reglene kinesiske helsedepartementet (dokument nr 55, 2001) og ble godkjent av Animal Care og bruk komité Shandong University. Patogen-fri BALB /c hårløse mus (som veier 19 ± 2 g, SPF klasse, sertifikat SCXK2011-0012) på 4-5 uker gammel ble kjøpt fra Institutt for laboratorie Animal Science of Peking University (Beijing, Kina). Alle dyrene ble opprettholdt på nøkkelen Laboratory of Cardiovascular Ombygging og funksjon Forskning i Qilu Hospital of Shandong University.
Cellelinjer og reagenser
Menneskelig A498 og 786-O-cellelinjer ble hentet fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i DMEM høy glukose medium (HyClone) med 10% føtalt bovint serum (FBS) under betingelsene i 5% CO2 ved 37 ° C. Simvastatin (natriumsalt, C25H39O6 · Na) ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA), som ble aktivert i henhold til produsentens instruksjoner. Humant IL-6 ble kjøpt fra R . Corning Costar, Lowell, MA, USA) belagt med 2 mg /ml Matrigel (BD Biosciences) ble benyttet for in
vitro
invasjons analyser. En total av 5 x 10
5-celler ble suspendert i 100 ul serumfritt medium og ble tilsatt til de øvre kamre. DMEM inneholdende 20% FBS og simvastatin (8 og 16 uM) ble deretter tilsatt til det nedre kammer. Etter 24 timer ble cellene igjen på de øvre kamrene fjernes med en bomullsdott, mens cellene som knytter seg til den nedre overflate ble fiksert med metanol og farget med 0,1% krystallfiolett. Antall celler migrert til den nedre side ble tellet i fem tilfeldig felt under et lysmikroskop. Celletallet ble talt opp og analysert statistisk.
For migrasjon analysen ble cellene sådd i forkamrene uten belagt Matrigel. Resten av analysen ble utført som invasjonen analysen. Etter 18 timer ble cellene på undersiden også regnet med i fem tilfeldig felt, da celletallet ble analysert statistisk.
apoptose analysen
Denne analysen ble utført for å påvise celle apoptose med en Annexin V-FITC apoptose Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, California). I korte trekk, ble høstede cellene resuspendert i 100 ul av bindingsbuffer for å oppnå en konsentrasjon på 1 x 10
6 /ml. Deretter ble 5 ul Annexin V-FITC og 5 ul propidiumjodid (PI, 20 ug /ml) tilsatt, og rørene ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Til slutt ble bindingsbuffer (400 ul) tilsatt til hvert reaksjonsrør, og cellene ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Dataene ble analysert ved WinMDI V2.9 programvare (The Scripps Research Institute, San Diego, CA, USA).
RNA interferens og transient transfeksjon
Liten interfering RNA (siRNA) rettet mot menneskelig AKT , ERK1 /2 og STAT3 ble erholdt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). A498-celler (2 x 10
5-celler /brønn på 6-brønners plater) ble transfektert med AKT, ERK1 /2 og STAT3 ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner respektivt. Etter transfeksjon ble cellene inkubert i 24 timer og deretter behandlet med simvastatin (8 pM) for MTT, migrasjon, invasjon og Western blotting-analyser.
Western blot-analyse
Celler ble oppsamlet og lysert i RIPA-buffer i nærvær av proteasehemmere. Protein (50 pg) ble separert ved SDS-PAGE og overført på en PVDF-membran ved hjelp av en våt overføringsapparat (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig melk og inkubert over natten ved 4 ° C med de primære antistoffer, etterfulgt av inkubasjon med de sekundære antistoffer merket med pepperrot peroksydase. Proteinbånd ble visualisert med forbedret chemiluminescence (Millipore). Protein nivåer ble oppdaget ved hjelp chemiluminescence leser Imagequant LAS4000 (GE, USA). Proteinnivåer ble analysert ved ImageJ programvare.
tumor xenograft modell
I korte trekk, totalt 5 x 10
6 av A498-celler ble blandet med Matrigel og så injisert subkutant i flanken på nakne mus. Musene ble tilfeldig inndelt i to grupper (10 i hver gruppe). Deretter mus ble gitt av simvastatin ved dose på 5 mg /kg /dag ved oral føring i 5 uker. Kontrollmus ble gitt det samme volum av fysiologisk saltvann. Tumor volum og vekt mus ble målt hver uke. Alle musene ble drept 50 dager etter inokulering av kreftceller og svulster ble samlet.
Terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick slutten merking (TUNEL) assay
xenografttumorer ble formalinfiksert, parafin-embedded og deretter skiver i 6-mikrometer seksjon for TUNEL analyse for å identifisere de apoptotiske celler. TUNEL Apoptose Assay kit (Beoytime, Beijing, Kina) ble brukt til å farge apoptotiske celler. Disse cellene ble visualisert med rødt fluorescerende under et fluorescens mikroskop (Olympus).
Statistisk analyse
studentens to-halet t-test ble anvendt for å bestemme statistiske forskjeller mellom behandlings- og kontrollverdier. Forskjeller ble ansett statistisk signifikant når p 0,05. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
Resultater
Simvastatin hemmer celledeling av nyrekreftceller
For å studere effekten av simvastatin på spredning av RCC-celler, A498 og 786-O-cellene ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av simvastatin for 48, 72 og 96 timer i MTT-analyse. Følgelig, simvastatin vesentlig hemmet proliferasjonen av A498 og 786-O-celler i en tids- og doseavhengig måte (* P 0,05, ** P 0,01) (Fig. 1A og 1B). Levedyktigheten til A498 og 786-O-celler ble redusert til 52,6% og 38,8% etter behandling med simvastatin (16 uM) i 72 timer, med IC50 av 18.434 ± 1,26 uM og 16,311 ± 1.21 uM, respektivt.
effekten av simvastatin på cellelevedyktighet ble målt ved MTT-analyse. (A) A498-celler og (B) 786-O-celler ble behandlet med simvastatin for 48, 72 og 96 timer. Simvastatin signifikant inhiberte cellelevedyktigheten til begge cellelinjene i en dose-og tidsavhengig måte. Morfologiske endringer av A498 og 786-O-celler indusert av simvastatin ble vist. Bilder fra (C) A498 og (D) 786-O-celler før og etter tilsetning av simvastatin (16 um) ble tatt ved 48 timer. Etter behandling med simvastatin i 48 timer, kan apoptotiske legemer i (C) A498 og (D) 786-O-celler observeres ved hjelp av optisk mikroskop. (E) Hemmende effekt av simvastatin på kolonidannelse. (F) Kolonien tall ble tellet under mikroskop og kolonien er definert til å bestå av minst 50 celler. Resultatene er som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter og den tilsvarende standardfeil. * P 0,05; ** P. 0,01
Effekt av simvastatin på celle morfologi av nyrekreftceller
I samsvar med tidligere funn [32], har vi også observert en to-faset respons i tumor celler til simvastatin behandling. Den tidlige fasen var en dramatisk endring i celle-morfologi i løpet av de første 6 timer til 24 timer. Den senere fase av responsen skjedde mellom 24 timer til 72 timer, noe som er involvert tap av plasmamembranintegritet. Morfologi endring av A498 og 786-O-celler etter behandling med simvastatin (16 uM) i 48 timer som ble vist i fig. 1C og 1D. Som representert, simvastatin førte celler til å trekke tilbake sine prosesser og mister plasmamembran integritet. Krymping av den sentrale cellekroppen rundt kjernene ble observert på plasmamembranen, som indikerer apoptose foregikk i disse cellene. Den apoptotiske kroppen var godt synlig etter behandling med simvastatin (16 mm) i 48 timer.
Simvastatin hemmer kolonidannelse i nyrekreftceller
Vi undersøkte også effekten av simvastatin på celle koloni dannelsen av de RCC celler. Vår undersøkelse viste at simvastatin inhiberte kolonidannelse av A498 og 786-O-celler på en doseavhengig måte (fig. 1E). Kolonien tall ble signifikant redusert etter RCC-celler behandlet med simvastatin (8 og 16 uM), sammenlignet med kontrollceller (* P 0,05, ** P 0,01). (Fig. 1F)
Simvastatin induserer apoptose i nyrekreftceller
for å verifisere og kvantifisere apoptotiske celler indusert av simvastatin, brukte vi Annexin V-konjugert Alexa Fluor 488 og propidiumjodidfarging å analysere andelen av apoptotiske celler. Prosenter av tidlige og senere apoptotiske celler ble vist i nedre høyre (LR) og øvre høyre (UR) kvadrant av histogrammene henholdsvis (Fig. 2A og 2B). Den totale andelen av apoptotiske celler (UR + LR) økte fra 2,64% i ikke-simvastatin behandlede A498-celler til 7,82% og 10,15% i simvastatin-behandlede celler (8 og 16 uM, henholdsvis) etter 48 timer (* P 0,05, ** P 0,01) (figur 2C).. Vi fant lignende fenomen i 786-O-celler, og den totale andelen av apoptotiske celler ble øket fra 6,32% til 9,68% og 17,6% (* P 0,05, ** P 0,01) (figur 2D.). Behandling av A498 og 786-O-celler med 8 og 16 uM simvastatin i 48 timer indusert apoptose i begge cellelinjer, og det var i en doseavhengig måte. Den betydelige induksjon av apoptose etter behandling med simvastatin antydet sin anti-kreft effekt på RCC-celler.
(A) A498 og (B) 786-O-celler ble behandlet med simvastatin (0, 8 og 16 uM) i 48 timer og farget med FITC-annexinV og PI. Prosentandelen av overlevende celler ble vist i nedre venstre kvadrant; prosentandelen av tidlig stadium av apoptose og sent stadium av apoptose-celler er vist i nedre høyre og øvre høyre kvadrant, respektivt. (C, D) Kvantifiseringen av apoptose fremkalt av simvastatin ble beregnet. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P. 0,01
Migrasjon og invasjon blir hemmet av simvastatin i nyrekreftceller
scratch Analysen ble gjennomført for å påvise effekten av simvastatin på migrering av nyrekreftcellen. Som vist på fig. 3A og 3B, migrering av A498-celler ble hemmet av simvastatin på en doseavhengig måte. Og den tilsvarende effekt ble også observert i 786-O-celler (Fig. 3C og 3D). For ytterligere å teste innvirkningen av simvastatin på cellemigrering og invasjon, ble A498-celler behandlet med den økende konsentrasjon av simvastatin påført transwell migrasjon og Matrigel-underliggende transwell invasjons analyser. Vår Resultatet viste at simvastatin kunne signifikant hemmer nyrecancercellemigrering og invasjon (* P 0,05, ** P 0,01) (Fig. 4A og 4B) på en doseavhengig måte. Vi fant den samme effekten av simvastatin i 786-O-celler (* P 0,05, ** P 0,01). (Fig. 4C og 4D)
(A) Scratch analyse av A498 celler behandlet med 0, 8 og 16 um av simvastatin. (B) Den migrasjon inhibering ble omdannet til prosent av det opprinnelige avstand mellom de to kanter. De simvastatin behandlet A498 celler viste en lavere rate for sårheling enn kontrollcellene. (C) Skrap analyse av 786-O-celler behandlet med 0, 8 og 16 mikrometer av simvastatin. (D) De simvastatin-behandlet 786-O-celler viste en lavere pris for sårheling enn kontrollcellene.
(A) Behandling med 0, 8 og 16 mikrometer av simvastatin viste hemmet migrasjon og invasjon av A498 celler. (B) Antallet av A498-celler som vellykket overført og invaderte ble tellet. (C) Migrasjon og invasjon av 786-O-celler ble hemmet etter behandling med ulike konsentrasjoner av simvastatin. (D) redusert antall 786-O celler indikerte stor hemmende effekt av simvastatin på celle mobilitet. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
. 0,01
Simvastatin hemmer tumorvekst og indusere tumorceller apoptose i en xenograft modell
for å finne ut om simvastatin hemmer tumorvekst i
vivo
, A498 celler (5 × 10
6) ble injisert subkutant i hver flanke av nakne mus. Tumorvekstinhibitering var tydelig i mus behandlet med simvastatin ved 5 mg /kg /dag, sammenlignet med mus som var behandlet med PBS (* P 0,05) (Fig. 5A, 5B og 5C). Videre var det ingen signifikant toksisitet for mus behandlet med simvastatin (5 mg /kg /d) ved å vurdere mus vekt på 2 grupper (fig. 5D). For å få innsikt om simvastatin kan indusere apoptose av RCC celler i
vivo
, parafinsnitt av A498 tumorxenotransplantater fra nakne mus ble brukt til terminalen deoksynukleotidyltransferase dUTP nick slutten merking (TUNEL) analyse. Det økte antallet TUNEL-positive celler viste tydelig at simvastatin kan indusere apoptose av RCC i
vivo plakater (* p 0,05). (Fig. 5E og 5F)
Bilder av det utskårede tumorer (A) og de nakne mus (C) ble tatt fra kontroll- og behandlingsgruppe. Pilene peker til xenografter. (B) grafer som representerer den gjennomsnittlige tumorvolumer av A498-xenografter ble behandlet med eller uten simvastatin. (D) Kroppsvekt kurve av nakne mus med A498 tumorer behandlet med simvastatin. (E) Representant TUNEL farging (rød fluorescens) av A498 nyrekreft xenografter. (F) Bar graf som viser kvantifisering av tunel positive A498 celler i kreft xenogafts. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD, * p. 0,05
Effekter av simvastatin på uttrykk for celle apoptose relaterte proteiner
uttrykk for pro-apoptotiske proteiner Bax har vært ofte assosiert med økt apoptose, mens de anti-apoptotiske protein Bcl-2 er blitt assosiert med inhibering av apoptose i målceller [33], [34]. Etter å ha behandlet med økt konsentrasjon av simvastatin i 48 timer, vi har oppdaget at ekspresjonen av Bax og Bcl-2 i RCC-celler. I samsvar med den økte apoptose i A498 og 786-O, ble forhøyet nivå av Bax mens nivået av Bcl-2 ble redusert (fig. 6A). Forholdet Bax /Bcl-2-protein-nivå er den avgjørende faktor for å overføre den apoptose-signal. Ved å sammenligne intensiteten av deres bånd, har vi funnet at forholdet mellom Bax /Bcl-2 ble øket på en doseavhengig måte (* P 0,05, ** P 0,01) (figur 6B.). Med den forhøyede forholdet mellom Bax /Bcl-2, nedstrøms casepase-3 for apoptose ble aktivert. Som vist, var ekspresjonen av Survivin og pro-kaspase-3 redusert, mens ekspresjonen av spaltede caspase-3 og spaltning av PARP ble forhøyet.
(A) A498 og 786-O-cellene ble analysert for Bcl-2, Bax, full lengde caspase 3 og spaltet caspase 3, full lengde PARP og spaltet PARP ved western-blotting-analyse med GAPDH som en kontroll. (B) Bax /BCL-2 forholdstall på A498 og 786-O celler. Den densitometry verdien av hvert bånd ble bestemt med ImageJ. Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0,01. (C-H) Nivåene av mTOR, AKT, ERK og deres fosforylerte formene ble analysert ved western blotting. Kvantitering av p-mTOR /mTOR, p-AKT /AKT og p-ERK /ERK-forholdet ble bestemt ved densitometri analyse.
Simvastatin hemmer spredning og metastasering av RCC celler via AKT /mTOR og ERK pathway
Western blotting ble brukt til å påvise den underliggende mekanismen som simvastatin utøves sine handlinger. mTOR er ofte dysregulerte i kreftceller, som er under forskning som et potensielt mål for RCC pasienter [35]. AKT, som oppstrøms av mTOR, spiller en avgjørende rolle i spredning, overlevelse og bevegelighet av kreftceller, og det kan direkte phosphorylate mTOR [36]. Derfor undersøker vi effekten av simvastatin på regulering av AKT /mTOR veien. Etter at A498 og 786-O-celler ble behandlet med simvastatin (8 og 16 uM) i 24 og 48 timer ble de fosforylering nivåer av AKT og mTOR effektivt undertrykkes. Forholdene p-AKT /AKT samt p-mTOR /mTOR ble også redusert i en tids- og doseavhengig måte (Fig. 6C, 6D, 6E og 6F). ERK, som er frekvensavvikende aktivert i kreftceller, fremmer kreftcelle proliferasjon og metastase [37]. Da vi testet effekten av simvastatin på ERK-aktivering, og fant simvastatin hemmet fosforylering av ERK i et tids- og doseavhengig måte i både A498 og 786-O-celler (fig. 6G og 6H).
Å undersøke hvilken rolle AKT og ERK i spredning og mobilitet av RCC celler, brukte vi siRNA til knockdown AKT og ERK1 /2 genuttrykk i A498 celler. Som vist på fig. 7A og 7B viste western blotting-analyse en betydelig reduksjon i protein nivåer av AKT og ERK1 /2 i cellene transfektert med AKT og ERK1 /2 campared til cellene transfektert med mock siRNA. Deretter evalueres vi simvastatin-indusert apoptose og sin anti-metastaser aktivitet i A498 celler som ble transfekterte med AKT eller ERK1 /2 siRNA. Resultatene viste at knockdown av AKT eller ERK1 /2 undertrykte betydelig celle proliferasjon, migrering og invasjon (fig. 7C, 7D, 7E og 7F), noe som indikerer at AKT og ERK1 /2 spille viktige roller i proliferasjon, migrering og invasjon i RCC-cellene . I tillegg, simvastatin vesentlig hemmet proliferasjonen og motilitet i AKT eller ERK1 /2 knockdown-celler, noe som tyder på at inhibering av AKT eller ERK-signalveien kunne øke den anti-kreft effekt av simvastatin.
(A, B ) A498-celler ble transfektert og behandlet med simvastatin (8 pM), og nivåene av AKT og ERK ble analysert ved western blotting med GAPDH som en kontroll. Etter transfektert med AKT eller ERK siRNA, ble A498-celler inkubert i fravær eller nærvær av simvastatin (8 pM) i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse (C, D), og cellevandring, og invasjon ble målt ved å transwell assay (E, F). * P 0,05 og ** p 0,01, sammenlignet med ubehandlede celler (Mock). # P 0,05 eller ## p 0,01, sammenlignet med cellene transfektert med AKT eller ERK siRNA
Simvastatin hemmer spredning og metastasering av RCC celler via IL-6 indusert JAK2 /STAT3 vei
Tidligere statiner har blitt rapportert å utøve pleiotropiske virkninger på celle signalings og funksjoner som er involvert i inflammasjon [38]. Således spekulere på om vi simvastatin utøver tumorundertrykkende effekt via modulering av tumorfremmende betennelse. Samle bevis har rapportert den pro-inflammatorisk JAK2 /STAT3 pathway spiller en avgjørende rolle i kreftmetastaser, apoptose og angiogenese [39]. Spesielt, IL-6 er et cytokin som kan aktivere JAK2 /STAT3 signalisering i kreftceller, som har en viktig effekt på onkogenese [40]. For å evaluere hvorvidt IL-6 kan indusere proliferasjon og metastase av RCC-kreftceller, vi serum-sultet A498-celler i 12 timer og deretter dyrket dem i fravær eller nærvær av IL-6 i 48 timer. Deretter cellenes levedyktighet ble målt ved MTT-analyse, mens cellemetastase-evne ble målt ved hjelp av transwell-analyse. Vi fant ut at IL-6 kunne gi en betydelig indusere spredning og metastasering av A498 celler. I tillegg har IL-6 indusert proliferasjon og metastase i A498-celler kunne bli undertrykket ved simvastatin (8 pM) (Fig. 8A og 8B).
(A, B) A498-celler ble behandlet med IL-6 ( 10 ng /ml) i 48 timer, og celle vitalitet og motilitet ble beregnet ved anvendelse av MTT-analysen og transwell respektivt. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 og ** p 0,01, sammenlignet med celler behandlet uten IL-6. (C-H) Simvastatin hemmet fosforylering av JAK2, STAT3 (Tyr705) og STAT3 (Ser727) i nyrekreftceller i en dose- og tidsavhengig måte. Kvantitativ analyse av p-JAK2 /JAK2, p-STAT3 (Tyr705) /STAT3 og p-STAT3 (Ser727) /STAT3 ratio ble vist i hvert nedre panel.
Deretter undersøker vi om simvastatin hemmer fosforylering av JAK2 og STAT3 indusert av IL-6 i RCC-celler. A498 og 786-O-cellene ble forbehandlet med simvastatin (8 og 16 uM) i 12, 24 og 48 timer, og da disse celler ble inkubert med IL-6 (10 ng /ml) i 10 minutter. Western blotting analyser viste at simvastatin betydelig hemmet IL-6 indusert fosforylering av JAK2 og STAT3 både Tyr705 og Ser727 området (Fig. 8C-8H).
For å vurdere om STAT3 er involvert i simvastatin-indusert apoptose og anti -metastasis av RCC celler. Vi søkte siRNA til knockdown STAT3 genuttrykk i A498 celler. Etter transfektert med STAT3 siRNA eller kontroll oligonukleotider ble A498 cellene behandlet med simvastatin (8 mm) eller kontroll. Som vist på fig. 9A, knockdown av STAT3 undertrykte betydelig proliferasjon, migrering og invasjon av A498-celler (fig. 9B og 9C), noe som indikerer at STAT3 spiller en viktig rolle i spredning og motilitet i A498-celler. I tillegg er kombinert behandling med simvastatin (8 pM) og STAT3 siRNA redusert cellelevedyktighet og motilitet av A498-celler, sammenlignet med celler behandlet med STAT3 siRNA alene. Derfor er disse resultatene antydet at IL-6 indusert JAK2 /STAT3 sti var forbundet med overlevelse og metastasering i RCC-celler, og inhibering av IL-6 indusert JAK2 /STAT3 signalveien kan sensibilisere RCC-celler til simvastatin behandling.
(A) A498-celler ble transfektert med STAT3 siRNA og behandlet med simvastatin (8 pM), og nivåene av STAT3 ble analysert ved western blotting med GAPDH som en kontroll. (B, C) Etter transfektert med STAT3 siRNA, ble A498-celler inkubert i fravær eller nærvær av simvastatin (8 pM) i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse, (B), og cellevandring, og invasjon ble målt ved å transwell-analyse (C). * P 0,05 og ** p 0,01, sammenlignet med ubehandlede celler (Mock). # P 0,05 eller ## p. 0,01, sammenlignet med cellene transfektert med STAT3 siRNA
Simvastatin hemmer fosforylering av AKT, ERK og STAT3 i xenografttumorer
For å avgjøre om virkningen av simvastatin på veksten av A498-tumor xenograft involverer hemming av AKT, ERK1 /2 og STAT3 aktivitet. Western blotting-analyse av AKT, ERK1 /2 og STAT3 aktivisering indikerte at fosforyleringen nivåer av AKT, ERK1 /2 og STAT3 ble effektivt undertrykkes i A498 xenograft etter behandling med simvastatin i
vivo plakater (fig. 10). Samlet vår studie viste at simvastatin kan hemme renal tumorvekst i
vivo
involverer hemming av AKT, ERK1 /2 og STAT3 aktivitet.
Western blotting-analyse for fosforylert AKT, ERK og STAT3 nivåene i tumor xenograft oppsamlet fra nakne mus behandlet med eller uten simvastatin. Kvantifisering av p-AKT /AKT, p-ERK /ERK og p-STAT3 /STAT3-forholdet ble bestemt ved densitometri-analyse. * P. 0,05 sammenlignet med kontroll
Diskusjoner
Flekker er hemmere av HMG-CoA reduktase, som er mye brukt i behandlingen av lipid lidelser, spesielt hyperkolesterolemi [41]. Nylig har en rekke eksperimentelle data viser at statiner utviser antitumoreffekter mot forskjellige kreftceller av forskjellig opprinnelse [42].
