Abstract
Denne studien ble utført for å vurdere den prognostiske betydningen av genomiske avvik på kromosom 4. kvartal i NSCLC pasienter. Vi har tidligere identifisert kopinummerendringer på 4q12-Q32 å bli signifikant assosiert med tidlig hematogenous spredning av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), og nå tar sikte på å begrense potensielle hot-spots i denne 107 Mb spenner regionen. Ved hjelp av åtte mikro markører i posisjon 4q12-35, analyser allel ubalanse (AI) ble utført på en forstudie kohort (
n =
86). Posisjoner som indikerer clinicopathological og prognostiske foreninger i AI-analyser ble ytterligere validert i en større studie kohort med fluorescens
in situ
hybridisering (FISH) i 209 NSCLC pasienter. Tap i posisjonene 4q21.23 og 4q22.1 ble vist å være assosiert med avanserte clinicopathological egenskaper samt med kortere sykdomsfrie (DFS) og total overlevelse (OS) (DFS:
P =
0,019; OS:
P =
0,002). Multivariate analysene identifiserte tap av 4q21.23-22.1 å være en uavhengig prognostisk markør for både DFS og OS i NSCLC (HR 1,64 til 2,20, alt
P
0,04), og spesielt i plateepitelkarsinom lungekreft (
P
0,05). En kasuistikk studie av en lungekreft pasienten videre avdekket et tap på 4q21.23 i disseminert tumorceller (DTC). Verken gevinster på sistnevnte stillinger, eller genomiske avvik på 4q12, 4q31.2 og 4q35.1, indikerte en prognostisk betydning. I konklusjonen, våre data indikerer at tap på 4q21.23-22.1 i NSCLC er av prognostisk betydning i NSCLC pasienter og dermed inkluderer eventuelle nye tumorsuppressorgener med klinisk relevans
Citation. Uzunoglu FG, Dethlefsen E, Hanssen A, Wrage M, Deutsch L, Harms-Effenberger K, et al. (2014) Tap av 4q21.23-22.1 Er en prognostisk markør for sykdom og total overlevelse i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 9 (12): e113315. doi: 10,1371 /journal.pone.0113315
Redaktør: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 24 mars 2014; Godkjent: 26 oktober 2014; Publisert: 11.12.2014
Copyright: © 2014 Uzunoglu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Hamburger Krebsgesellschaft E.V., Hamburg, Tyskland. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Genomisk ustabilitet er en av de viktigste kjennetegnene ved kreft [1]. Tallrike studier på genomisk ustabilitet i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) har markert spesifikke sletting mønstre for både metastatiske og primærsvulster [2] – [4]. Kopier nummer aberrasjoner i NSCLC kan finnes på flere områder, hvor noen er spesifikke for histologisk undertype, og noen er avhengig av alvorlighetsgraden av histopatologiske endringer (for eksempel tumorstadiet eller gradering) [5] – [11] Videre, forekomsten av kopien nummerendringer har vist seg å være et tidlig hendelse i lungekreft patogenesen. Dette kan bli funnet i kombinasjon med en sekvensiell mønster av tap av heterozygositet (LOH), som begynner med den alleliske tap på kromosom 8p, etterfulgt av 3p og 9p strykninger [7], [12], [13].
Vi har tidligere vist at tidlig hematogenous spredning av tumorceller er drevet av et bestemt mønster av genomiske forandringer. I tillegg til dette mønsteret, en stor delesjon av kromosom 4q12-Q32 ( 107 MBP) viser en sterk sammenheng med tilstedeværelse av disseminerte tumorceller (DTC) i benmarg, samt hjernemetastaser av lungekreftpasienter [14] . Men den prognostiske betydningen av denne regionen har ennå ikke blitt undersøkt. Målet med denne studien var å innskrenke de relevante hotspot regionene og for å undersøke deres prognostiske effekt i NSCLC. I tillegg søkte vi å analysere om dette tapet kan også påvises i DTC av en NSCLC pasient.
For dette formålet, må vi først utført allel ubalanse (AI /LOH) analyserer i en forstudie kohort (
n =
86). For ytterligere bekreftelse, ble en fluorescens
in situ
hybridisering (FISH) analyse av 209 NSCLC pasienter utført. Et tap i en mindre enn 4 Mb-spenner regionen på 4q21.23-4q22.1 ble identifisert som en betydelig negativ prognostisk markør for sykdommen gratis samt total overlevelse i NSCLC. Videre utførte vi påfølgende immunfluorescens (IF) og FISH analyser på DTC av en enkelt NSCLC pasient, viser et underskudd på 4q21.23 i primærtumor. Det samme tapet kan også påvises i DTC.
Materialer og metoder
Prøver
Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av kammeret av leger, Hamburg, Tyskland . Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. All klinisk undersøkelse har blitt gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Alle tumorprøver ble oppnådd under kirurgiske reseksjoner ved University Medical Centre Hamburg-Eppendorf eller tilknyttet kirurgiske avdelinger. Clinicopathological data ble hentet fra en prospektiv database, og oppfølgingsdata ble innhentet ved intervjuer med fastlege eller pasienten ved poliklinikk.
For allel ubalanse (AI) analyser ved 4Q, 86 kirurgisk behandlet primære NSCLC pasienter med tilgjengelige matchet carcinoma og sunn genomisk DNA ble vurdert for inkludering. Median alder for studiekohorten var 65,9 år med en dominerende mannlig andel (65,1% versus 34,9%). Med hensyn til lungekreft celletyper, 37 pasienter (43,0%) hadde en plateepitelkarsinom (SqCC) og 49 (57,0%) en adenokarsinom (AC). Median oppfølgingstid var 21,4 måneder (2-60). Ytterligere detaljer er gitt i S1 tabell.
For DNA kopi nummer avvik (fisk) på 4Q, en vev microarray (TMA), som består av 209 evaluerbare primær lungekreft pasienter, ble brukt, med en median alder på 62,3 år på tidspunktet for kirurgi. Kjønnsfordeling var sammenlign AI studiekohorten, med en tilsvarende overvekt av (68,4%) mannlige pasienter. FISH studiekohorten omfattet 88 (42,1%) pasienter med SqCCs, 78 (37,1%) med ACs, 34 (16,3%) med stor celle lungekreft, og ni pasienter (4,5%) med nevroendokrin lungekreft. Median oppfølgingstid var 24,7 måneder (2.5-60). Ytterligere detaljer er gitt i S1 tabell.
Alle pasientene ble reklassifisert i henhold til den syvende utgaven av TNM klassifisering av ondartede svulster [15]. I forhold til forvaltningen av adjuvant behandling er følgende angitt kriterier blitt brukt siden 2004: ≥ Stage II pasienter fikk adjuvant kjemoterapi med cisplatin og Vinorelbin. Iscenesatte Ib pasienter ble evaluert for adjuvant behandling dersom svulsten var 4 cm eller hos pasienter med invasjonen i blodåre (V +) eller invasjonen i lymfekar (L +). Adjuvant kjemoterapi etterfulgt av stråling (50-60 Gy) ble diskutert for ≥ Stage III. Pasient egenskaper for begge studiekohorter er vist i S1 tabell.
DNA
Genomisk DNA matchet karsinom (fersk frosset) og patologisk-verifisert ikke-ondartet lungevevet eller perifert blod leukocytter, tatt før operasjonen ble ekstrahert og renset i henhold til produsentens protokoll bruker QIAamp vev kit (Qiagen, Hilden) eller InnuPREP DNA Microkit (AnalytikJena, Jena, Tyskland). Om nødvendig, ble manuell mikrodisseksjon utført, for å oppnå en tumorcelle-innhold på minst 70%. DNA-konsentrasjonen ble bestemt ved Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Wilmington, DE), og prøvene ble fortynnet til 10 ng /mL og lagret ved -20 ° C inntil bruk.
Allelic ubalanse analyse
Basert på vår forrige undersøkelse, fire hotspot regioner representert i posisjonene 4q12, ble 4q21.23, 4q31.2 og 4q35.1 valgt for videre analyse [14]. For hver region, ble to mikro markører brukes til å vurdere frekvens og kliniske relevansen av AI (se S2 tabell, for detaljer om alle mikro markører). Termin primere ble merket med et fluorescerende fargestoff (6-FAM) for etterfølgende kapillær elektroforese. PCR ble utført i en 10 ul reaksjonsblanding som består av 10 ng DNA-templat, 2,5 mM deoksyribonukleotidtrifosfat blanding (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland), 2,5 pmol sense- og antisense-primer (MWG, Ebersberg, Tyskland), 0,25 U AmpliTaq Gold Polymerase ( Applied Biosystems) og 5 ul nuklease-fri vann. PCR-betingelsene besto av gjentatte sykluser ved 95 ° C, 60 ° C-62 ° C og 72 ° C i 30 sek. For AI bestemmelse, kapillær elektroforese med en ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Freiburg, Tyskland), ved bruk av en blanding av 40 ml formamid (Hi-Di), 0,2 pl Genescan-500-ROX standard, så vel som 0,1 pl av PCR produkt og denaturering ved 94 ° C i 2 minutter ble utført og lengden av allel-fragmenter og fluorescerende intensitet ble bestemt. Lene ble definert som de to høyeste toppene innenfor den forventede størrelsesområdet og et forhold mellom ≥1.5 mellom topphøyder av svulsten og normale alleler ble scoret som AI. For generell kvalitetssikring, ble 10% av brukte prøvene tilfeldig brukt for gjentatt analyse. Den konkordans av allel status var . 99%
Fluorescence
in situ
hybridisering (FISH) analyse
DNA kopiantall tap analyse av to hot-spot-regioner basert på AI-analyser ble vurdert i en større studiepopulasjonen ved fluorescens
in situ
hybridisering (FISH). Tre forskjellige BAC prober rettet mot regioner 2 (RP11-570L13: 4q21.23 og RP11-1053C2: 4q22.1) og 3 (RP11-634D8: 4q31.2) ble hybridisert på en TMA. De anvendte BAC-probene ble oppnådd fra kilde BioScience Lifesciences (Nottingham, UK). En mikrogram av hver BAC sonde ble merket ved tilfeldig priming (BioPrime Merking System, Invitrogen) med fluorescensmerkede dUTPs (RP11-570L13 og RP11-634D8: Spectrum Orange, RP11-1053C2: Spectrum grønne; Enzo Life Sciences, Abbott). Som en referanse, ble en cent probe (CEP 10, SpectrumAqua) ansatt (Enzo Life Sciences, Abbott). For å kontrollere spesifisiteten og kvaliteten av det fluorescens-merkede prober BAC, fisken først testet på metafase-kromosom sprer seg. Etterpå ble protokoller for parafin lysbildene etablert for hver BAC sonde for seg. Først, ble platene inkubert ved 60 ° C i en time før de ble deparaffinized i xylen og hydrert i en etanol-serien. Fikseringen ble oppnådd ved å plassere objektglassene i en løsning av 2% formaldehyd og metanol ved -20 ° C, etterfulgt av skylling dem i fosfat-bufret saltløsning (1 x PBS) og å forhåndsbehandle dem med en forhåndsbehandlingsløsning (Invitrogen) ved 90 ° C i 10 min. Etter PBS vasking ble platene behandlet med en forvarmet enzym-reagens (Invitrogen) ved 37 ° C i 10 min. Igjen, de ble vasket i PBS og deretter dehydratisert i en etanol-serien. Til slutt ble platene denaturert ved 85 ° C i 5 min, før de ble inkubert med sonde hybridiserings-blandinger ved 37 ° C over natten. Post-hybridisering Vaskingen ble så utført i 2 x SSC, 0,3% NP-40 buffer ved 70 ° C og romtemperatur, fulgt av en andre hydratisering i en etanol-serien. DAPI løsning ble påført for påvisning av morfologisk intakte ikke-overlappende tumorceller. I gjennomsnitt ble fluorescerende signaler av 32 kreftceller for hver sonde telles (range 11-57). For å evaluere den eksperimentelle skjevhet, så vel som for å definere cut-offs av signal-til-cent-forhold, ble hybridiseringssignaler på 10 normale kontrollprøver (også plassert på TMA) telles. Tilsvarende forholdet 1.5 ble definert som en celle bærer en DNA-gevinst, mens en ratio 0,75 ble definert som et tap
Fortløpende immunfluorescens farging og FISH analyse
For den. isolering av feilkoder, ble mononukleære celler fra benmarg aspirates av NSCLC pasienter isolert ved Ficoll gradient sentrifugering. Cellene ble deretter CYTO-sentrifugert på glassplater. For å detektere feilkoder, ble en farging immunocytokjemi utført i henhold til den APAAP-metoden (alkalisk fosfatase-anti alkalisk fosfatase), ved bruk av et antistoff mot cytokeratins (A45-B /B3, Micromet, Martinsried, Tyskland) [16]. En isotype-matchet, monoklonalt antistoff (MOPC 21, IgG1, Sigma- Aldrich) tjente som negativ kontroll. DTC-positive pasienter ble anvendt for å analysere tap av 4q22.1 av FISH-analyse. FISH ble utført på kreftcellene som ble oppdaget på forhånd av IF farging med en Cy3 merket anti-cytokeratin antistoff (A45-Cy3, Micromet). For cellefiksering, ble oppløsning B (Micromet) anvendt. Etter en PBS-vasketrinn, ble uspesifikke bindingsseter blokkert med 10% AB serum (Biotest AG, Dreieich, Tyskland). En annen PBS vasking ble etterfulgt av 45 min A54-Cy3 antistoffbehandling (1:300). Celler ble igjen vasket og DAPI (CellSearch) ble søkt om atom farging. DTC ble identifisert i en automatisert måte (ARIOL Scan, Leica Biosystems, Nussloch, Tyskland) og lokalisert med England Finder for re-identifisering. For påfølgende FISH-analyse, ble cellene vasket med PBS og inkubert i 7 minutter i en forvarmet proteinase K (0,1 ug /ml) oppløsning (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,2% CaCl2xH2O ad 50 ml Aqua dest.). Deretter ble cellene dehydrert i en etanol serie og denaturert i 5 min ved 75 ° C (70% formamid, 0,6 x SSC, pH 7,4). Cellene ble igjen dehydrert og sonde hybridiserings-blandinger ble denaturert i 5 minutter ved 75 ° C. Hybridisering ble utført over natten ved 37 ° C. Post-hybridisering vask ble utført i 50% formamid /2 x SSC i 2 x SSC og i 0,1X SSC ved 45 ° C. Etter påføring DAPI ble DTCs flyttet og fluorescerende signaler om cent 3 og RP11-1053C2 prober ble talt opp. Et forhold på 0,75 ble definert som et tap
Statistisk analyse
For statistisk analyse, SPSS 21.0 for MAC (SPSS Inc., Chicago, IL) ble brukt.. Sammenheng mellom AI /kopinummerendringer og clinicopathological parametre ble vurdert av chi-kvadrat test. Den total overlevelse (OS) ble beregnet som perioden fra datoen for kirurgi for å enten dødsdato eller siste oppfølging, avhengig av hva som skjedde først i løpet av 60 måneder. Den sykdomsfri overlevelse (DFS) ble definert som perioden fra datoen for operasjonen til dato for tilbakefall eller tumorrelaterte dødsfall, avhengig av hva som skjedde først i løpet av 60 måneder. Pasienter i live uten tilbakefall ved siste oppfølging dato eller etter 60 måneder ble sensurert. In-sykehuset dødelighet (innen 60 dager) førte til utestengelse fra overlevelsesanalyse. Overlevelse ble analysert ved hjelp av log-rank test og plottet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden. Hvis ikke annet er angitt, blir resultatene presentert som median overlevelse i måneder med 95% konfidensintervall (95% KI). For en multivariat analyse ble cox regresjon fare modellen brukes til å vurdere den prognostiske verdien av AI /kopiere nummerendringer. Resultatene er presentert som hazard ratio (HR) og 95% CI. Vesentlige uttalelser viser til P-verdier for to-tailed tester. 0,05
Resultater
mikroanalyse
studiekohorten brukes til mikro analyse besto av til sammen 86-matchet karsinom og prøver av lungekreftpasienter som gjennomgikk kirurgi normalt vev. En mikroanalyse ble utført i et totalt fire områder på kromosom 4q, ved hjelp av to polymorfe markører for hver region. Allele markører nær hverandre avslørt svært like frekvenser av sletting fører til endelig tap av heterozygositet frekvenser på 18,6% (
n =
16) i region 1; 23,3% (
n =
20) i region 2; 25,6% (
n =
22) i region 3 og 34,9% (
n =
30) i region 4. Satsen for ikke-informative tilfeller varierte fra 16,3% til 36,0%, avhengig på markør. Ved å bruke to markører for deteksjon AI i hver region, kan de ikke-informative tilfeller bli redusert til området fra 2,3% til 15,1%. Regioner 1 og 3 hadde samstemmige resultater (normal /tap), mens region 2 inneholdt tre disconcordant resultater og region 4 inneholdt en av hver. Alle disconcordant resultater ble gjentatt, og resultatene forble identiske, noe som indikerer en mulig stoppunkt mellom markørene. Totalt 45,3% (
n =
39) avslørt minst ett allel tap innen de analyserte regionene. Innenfor disse pasientene, 17,9% (
n =
7) viste et tap i alle regioner. Detaljerte numeriske Resultatene er gitt i tabell 1 og S1 figur, støtte informasjon.
AI på kromosom 4. kvartal og clinicopathological egenskaper
Det var ingen bevis for en betydelig statistisk sammenheng mellom AI med clinicopathological egenskaper i de fire undersøkte regioner. Men 83,3% (
n =
15) av pasienter med AI i region 2 utviklet et tilbakefall i motsetning til 16,7% (
n =
3) uten AI (P = 0,073).
AI på kromosom 4. kvartal som en prognostisk markør for overlevelse
i univariat overlevelse analyser, en trend mot kortere median sykdomsfri (DFS) og total overlevelse (OS) hos pasienter med AI i region 1 og 2 var tydelig (median overlevelse forskjell fra 11,9 måneder til 14 måneder, detaljer er gitt i S3 tabell). Men forskjellene var ikke statistisk signifikant (P 0,05). Siden studiekohorten for overlevelse analyser ble begrenset til 68-77 tilfeller, inkludert UICC stadium IV pasienter samt pasienter med positiv reseksjonskanten, konfunderende effekter på overlevelse analyse var å forvente. Dette var tydelig for region 2. Derfor følgende lagdeling av alder, kjønn, tumorstadium, og reseksjonskanten parametere, tilstedeværelse av AI i region 2 ble vist seg å være en uavhengig prognostisk markør for DFS (HR 3,82,
P =
0,044). En tilsvarende ikke-signifikant trend ble også sett for OS (HR 3,56,
P =
0,072). En UICC tumor stadium ≥ III var den sterkeste og eneste ekstra negativ prognostisk markør for DFS og OS, med HR 4,22 (
P =
0,007) og HR 2,87 (P = 0,047) henholdsvis (S4 tabell).
FISH kopi nummer analyse
Basert på de rapporterte allelotyping resultater, forsøkte vi å bekrefte disse resultatene i større studiepopulasjonen ved FISH analyse. To forskjellige BAC sonder, en hybridiserer til region 2 og en hybridiserer til region 3 ble etablert (S5 tabell).
For regionen 4q21.23 oppdaget av RP11-570L13, ble en DNA-tap sett i 24,9% (
n =
52) og en DNA-gevinst på 4,3% (
n =
9) av de analyserte prøvene. Et tap oppdages på denne posisjonen viste en signifikant histologisk typeavhengig sammenheng, med 38,0% (
n =
30) tap i SqCC i motsetning til 22,7% (
n =
15,
P =
0,049) i AC. Analysen med sonde RP11-1053C2 avdekket tap på 30,6% og gevinst i 7,2% (
n =
15), igjen avslører en betydelig hyppigere tapsraten i SqCC (44,6%,
n =
33) sammenlignet med AC (23,3%,
n =
17,
P =
0,022).
Ved hjelp av sonde RP11-634D8 (region 3), frekvensen av vellykket analysen var 71,6% (
n =
204). En DNA-kopitallet tap ble funnet i 36,8% (
n =
77) og en gevinst på 7,7% (
n =
16) av de analyserbare prøvene.
Kopier antall tap på kromosom 4. kvartal og clinicopathological egenskaper
Kopier nummer tap i posisjon 4q21.23 (RP11-570L13) viste en signifikant korrelasjon med avansert tumorstørrelse (
P =
0.005), men uten andre patologiske egenskaper. Kopitallet tap i posisjon 4q22.1 (RP11-1053C2) viste en signifikant sammenheng med tilstedeværelse av lymfeknutemetastaser (tap pN0: 25,2%,
n =
26 versus tap ≥pN1: 44,0%,
n =
37;
P =
0.005) samt avansert UICC stadium (tap UICC I: 25,3%,
n =
23 versus tap UICC ≥II: 41,4%,
n =
41;
P =
0,032). Kopier nummer tap i posisjon 4q31.2 (RP11-634D8) viste en signifikant korrelasjon med avansert tumorstørrelse (
P =
0,019). Men ingen ytterligere korrelasjoner med clinicopathological egenskaper var tydelig (S5 tabell).
Kopier nummer tap på kromosom 4. kvartal som en prognostisk markør for overlevelse
I forbindelse med en univariat analyse, kopiere nummer tap i posisjon 4q21.23 (RP11-570L13) viste en ikke-signifikant trend mot kortere median DFS (12,5 måneder versus 28,0 måneder,
P =
0,056). Subgruppeanalyser viste imidlertid en sterk sammenheng med DFS i SqCC undergruppe (11,2 måneder versus 39,1 måneder, p = 0,031, Fig. 1, S6 tabell). En lignende effekt på OS ble rapportert for hele studien kohorten (23,9 måneder versus 42,6 måneder,
P =
0,033) og SqCC undergruppe (12,5 måneder versus 41 måneder,
P =
0.031, fig . 2, S6 tabell)
A:. Kopier nummer tap i posisjon 4q21.23 (RP11-570L13) viste en trend mot kortere median sykdomsfri overlevelse (DFS) i univariat analyse (12,5 måneder versus 28,0 måneder,
P =
0,056). B: Kopier nummer tap i posisjon 4q21.23 (RP11-570L13) i plateepitelkarsinom (SqCC) undergruppe viste sterke korrelasjoner med kortere DFS (11,2 måneder versus 39,1 måneder)
P =
0.031. C: Kopier nummer tap i posisjon 4q22.1 (RP11-1053C2) viste signifikante sammenhenger med kortere DFS (12,5 måneder versus 32,7 måneder),
P =
0.010. D: Kopier nummer tap i posisjon 4q22.1 (RP11-1053C2) viste signifikante sammenhenger med kortere DFS i SqCC gruppen (11,7 måneder versus 35,5 måneder),
P =
0,027. Overlevelses tomter for gevinst avvik var bleknet ut for ordens skyld
A:. Kopier nummer tap i posisjon 4q21.23 (RP11-570L13) viste sterke korrelasjoner med kortere median total overlevelse (OS) i univariat analyse (23,9 måneder versus 42,6 måneder),
P =
0,033. B: Kopier nummer tap i posisjon 4q21.23 (RP11-570L13) i plateepitelkarsinom (SqCC) undergruppe viste sterke korrelasjoner med kortere OS (12,5 måneder versus 41 måneder),
P =
0.031 C: Copy antall tap i posisjon 4q22.1 (RP11-1053C2) viste signifikante sammenhenger med kortere DFS (25,8 måneder versus 40,3 måneder),
P =
0,012. D: Kopier nummer tap i posisjon 4q22.1 (RP11-1053C2) viste signifikante sammenhenger med kortere DFS i adenokarsinom gruppen (10,0 måneder versus 43,1 måneder),
P =
0,035. Overlevelses tomter for gevinst avvik var bleknet ut for oversiktens skyld.
Kopier nummer tap i posisjon 4q22.1 (RP11-1053C2) viste signifikante sammenhenger med kortere median DFS i hele studiekohorten samt som innenfor SqCC gruppen (12,5 måneder versus 32,7 måneder,
P =
0.010 og 11,7 måneder versus 35,5 måneder,
P =
0,027 fig. 1, S6 tabell). Videre ble et tap på 4q22.1 forbundet med kortere OS i hele studiekohorten og AC gruppen, mens ingen korrelasjon ble sett i SqCC undergruppe (hele studiekohorten: 25,8 måneder versus 40,3 måneder,
P =
0,012, AC undergruppe: 10,0 måneder versus 43,1 måneder,
P =
0,035, fig 2, S6 tabell)
I kontrast, gjorde eksemplar nummer gevinster ikke avsløre en sammenheng med overlevelse.. hvilken som helst av de analyserte posisjoner. I tråd med resultatene av AI studiekohorten, kopiere antall tap på region 3 (RP11-634D8, posisjon 4q31.2) hadde ingen effekt på overlevelse (S6 tabell).
Multivariate analyser identifisert kopiantall tap på posisjon 4q21.23 (RP11-570L13) som en negativ prognostisk markør for DFS og OS for hele studiekohorten (cox proporsjonal risikomodell, stratifisert etter alder, kjønn, margin clearance, sortering og UICC scenen, DFS: HR 1,77 (1.10- 2,84 95% KI),
P =
0,019; OS: HR 2,20 (1,33 til 3,64 95% KI),
P =
0,002, tabell 2) samt for SqCC undergruppe ( DFS: HR 2,85 (1,35 til 6,04 95% KI),
P =
0,006; OS: HR 2,77 (1.26 til 6.13 95% CI),
P =
0,012, S7 tabell). Lignende resultater ble sett for kopiantall tap i posisjon 4q22.1 om hele studiegruppen (RP11-1053C2, DFS: HR 1,64 (1,03 til 2,61 95% KI),
P =
0,038; OS: 1.84 ( 01.12 til 03.01 95% CI),
P =
0,015, tabell 3), mens subgruppeanalyse nådde ikke statistisk signifikans (S8 tabell). En annen modell av multivariate analyser inkludert administrasjon av adjuvant kjemoterapi ble utført (informasjon tilgjengelig i 116 pasienter). Resultatene bodde betydelig når administrasjonen av adjuvant kjemoterapi ble inkludert (data ikke vist).
I sammendraget, begge stillinger i region 2, nemlig 4q21.23 (RP11-570L13) og 4q22 0,1 (RP11-1053C2), ble identifisert som en negativ prognostisk markør for DFS samt OS i hele studiekohorten. Det er imidlertid bare tap i stilling 4q21.23 nådd betydning også i SqCC undergruppen. Et flytskjema som oppsummerer overlevelse analyser av studiekohorten, er studien fremdrift og resultater gitt i S2 og S3 Tall.
Case rapport av 4q21.23 tap i DTC
Basert på vår tidligere opplever at 4q12-32 tap korrelerer med positiv DTC status, ønsket vi å undersøke om et tap i denne regionen er også til stede i DTC fra en pasient med 4Q tap i primærtumor [14]. Et tap av 4q22.1 ble påvist hos 77% (17/22) av pasientene DTC. Utvalget av RP11-1053C2 sonde og cent 3 signalene var heterogene, varierende fra 1 til 5 signaler (bety 1,7 og 2,7 henholdsvis). FISH-analyse ble også utført på parafin-innleiret primærtumor og lunge tilbakefall materiale fra den samme pasient (fig. 3). Resultatene viste igjen et tap av 4q22.1 og høy grad av heterogenitet i de individuelle celler som strekker seg fra 0-4 signaler i primær tumor og 0-5 i tumor tilbakefall materiale.
benmarg-celler til pasienten ble immunocytochemically farget mot cytokeratin bruker APAAP metoden. En positiv DTC (rød) og en negativ leukocytt (brun) er vist. B: benmargsceller hos pasienten, var farget fluorescens mot cytokeratin (rødt signal) etterfulgt av FISH-analyse i C) med RP11-1053C2 probe og Cen3 probe (RP11-1053C2 probe: en grønn signal; Cen3 probe: 3 spektrum oransje signalene ; kjernefysiske farging i DAPI). Cen7 probe (Cen7 probe: spekteret aqua vises i pseudo-farge magenta) var i tillegg brukes for FISH analyse på D) primærtumor (2-5 oransje signaler /celle, 2-4 magenta signaler /celle og 0-2 grønne signaler /celle) og E) svulst tilbakefall FFPE materiale (3-6 orange, 4-5 magenta og 1-3 grønne signaler /celle).
Diskusjoner
I en tidligere studie var vi i stand til å identifisere fem kromosomale regioner differensierende pasienter med eller uten tidlig tumor spredning. Tap av 4q12-Q32 viste den sterkeste korrelasjonen med den positive DTC status. Sytti-tre gener i denne regionen ble funnet ned regulert blant bein NSCLC marg-positiv, noe som indikerer en sannsynlig tilstedeværelse av tumorsuppressorgener innenfor dette området [14]. I denne studien, var vi i stand til å innskrenke målområdet og identifisere eksemplar nummer tap med en mindre enn 4 Mb spennende region på kromosom 4q21.23-22.1 som uavhengige prognostiske markører for DFS, samt OS i NSCLC. Tilstedeværelsen av eksemplar nummer tap i denne regionen var assosiert med minst 18 måneders kortere median overlevelse, sammenlignet med pasienter med normal kopiantall. Videre tilstedeværelse av kopinummer tap forårsaket en økt risiko for tilbakefall av sykdom og død som strekker seg fra 1,6 til 2,9 i løpet av 60 måneder med oppfølging, uavhengig av etablerte prognostiske markører for NSCLC (avhengig av histologisk subtype og plasseringen av kopiantall tap) . Videre, i vårt tilfelle rapport studie, var vi i stand til å demonstrere at tapet av kromosom region 4q21.23 er ikke bare til stede i både det primære lunge svulst og i tumor tilbakefall vev, men også i en stor andel av svært heterogene DTC. Dette understreker betydningen av dette kromosomal region for tumor spredning. Uniparental disomy er en mekanisme for hvordan et tap av heterozygositet i celler kan stamme [17]. I NSCLC er vi ikke klar over studier som indikerer uniparental disomy på 4Q. Dessverre kunne vi ikke gjennomføre noen spesifikk forskning på hvorvidt AI i våre prøver skyldtes uniparental disomy, som prøvene for AI og fisk analysene ikke var overlappende. Vi var ikke i stand til å komme med uttalelser om en 4Q tap oppstår oftere i en polysomic tilfelle av kromosom 4 som vi brukte cent 10 som referanse. I vår opprinnelige artikkel som beskriver sammenhengen mellom tap av 4. kvartal og positiv DTC status undersøkte vi 30 NSCLC pasienter ved matrise CGH. I denne ganske lite antall tilfeller, kunne vi ikke finne noen sammenheng mellom tap av 4. kvartal og totalt antall kromosomavvik [14], noe som indikerer at tap av 4Q er spesielt assosiert med metastatisk oppførsel, uavhengig av nivået på kromosom ustabilitet i svulsten .
Tap av ulike størrelser regionene på kromosom 4. kvartal har vært forbundet med lavere overlevelse i mange typer epitel kreft, inkludert tykktarmskreft, ductal bukspyttkjertelen adenokarsinom, hepatoblastoma og muntlig plateepitelkarsinom [3], [18] – [22]. Videre, i NSCLC, tap av 4Q har vært assosiert med metastatisk lunge adenokarsinomer. Men størrelsen og plasseringen av 4Q strykninger varierer mellom de ulike studiene [3], [18] – [22]
I tillegg til identifisering av 4Q målområdet i NSCLC og dets potensial klinisk relevans, vår. data indikerer histologiske subtype spesifikke avvik i form av allele tap frekvenser og prognostisk betydning. Subgruppeanalyse viste en betydelig høyere rate av allel tap i SqCC sonder i motsetning til AC sonder. I tråd med disse forskjellene, tap på 4q21.23 (med markør RP11-570L13) i region 2 ble identifisert som en negativ prognostisk markør for DFS og OS i hele NSCLC studiekohorten og spesielt SqCC gruppen. Denne regionen ble ikke funnet å være en uavhengig prognostisk markør i AC gruppen. De observerte histologiske undertypespesifikke allelisk tap frekvenser med variabel effekt på overlevelse er i overensstemmelse med tidligere studier som rapporterer flere kromosomale regioner differensierende SqCC fra AC, blant de mer vanlige tap av 4q i SqCC [5], [8] – [10], [23], [24]. Dessuten har mange studier antydet at disse ulike genomiske endringer av AC og SqCC kan gi lovende muligheter for potensielle målrettet terapi av lungekreftpasienter [11]. Som LCLC og nevroendokrin lungekreft undergruppene var for liten til subgruppeanalyser er videre studier er nødvendig for å kunne vurdere den potensielt avvik virkningen av allele ubalanser på 4Q på følgende histologiske subtyper.
Vår studie kohort inkluderte ikke forstadier lesjoner. Som en konsekvens, er det fortsatt uklart når disse viktige allele ubalansene skje innenfor tidslinjen for lungekreft patogenesen.
