Abstract
Effekten av forebyggende humant papillomavirus (HPV) vaksine på reduksjon av livmorhalskreft (CC) byrde vil ikke være kjent i 30 år. Derfor er det fortsatt nødvendig å forbedre prosedyrene for CC screening og behandling. Målet med denne studien var å identifisere og karakterisere cellulære mål som kan anses som potensielle markører for screening eller terapeutiske mål. Et pyramideformet strategi ble anvendt. I utgangspunktet uttrykk for 8,638 gener ble sammenlignet mellom 43 HPV16-positive CCs og 12 friske livmorhals epitheliums bruker mikromatriser. Totalt 997 gener ble deregulert, og 21 gener som viste størst deregulering ble validert ved hjelp QRT-PCR. De 6 mest oppregulert gener (
CCNB2, CDC20, PRC1, SYCP2, NUSAP1
,
CDKN3
) tilhører den mitose veien. De ble videre undersøkt i 29 lavgradig cervikal intraepitelial neoplasi (CIN1) og 21 høyverdig CIN (CIN2 /3) for å undersøke om de kunne skille CC og CIN2 /3 (CIN2 +) fra CIN1 og kontroller.
CCNB2
,
PRC1
, og
SYCP2
var for det meste i forbindelse med CC og
CDC20
,
NUSAP1
, og
CDKN3
var også forbundet med CIN2 /3. Sensitivitet og spesifisitet av
CDKN3 Hotell og
NUSAP1
å oppdage CIN2 + var ca 90%. Proteinene kodet av alle 6 gener ble vist oppregulert i CC av immunhistokjemi. Foreningen av disse markørene med overlevelse ble undersøkt hos 42 CC pasienter fulgt opp i minst 42 måneder. Bare
CDKN3
var assosiert med dårlig overlevelse, og det var uavhengig av klinisk stadium (HR = 5,9, 95% KI = 1,4 til 23,8, p = 0,01).
CDKN3 Hotell og
NUSAP1
kan være potensielle mål for utvikling av screeningmetoder. Ikke desto mindre er ytterligere studier med større prøver er nødvendig for å definere den optimale sensitivitet og spesifisitet. Hemming av mitose er en velkjent strategi for å bekjempe kreft. Derfor
CDKN3
kan være ikke bare en screening og overlevelse markør, men en potensiell terapeutisk mål i CC. Men om det er uunnværlig for tumorvekst gjenstår å bli demonstrert
Citation. Espinosa AM, Alfaro A, romersk-Basaure E, Guardado-Estrada M, Palma Í, Serralde C, et al. (2013) Mitose er en kilde til potensielle markører for screening og Survival og terapeutiske mål i livmorhalskreft. PLoS ONE 8 (2): e55975. doi: 10,1371 /journal.pone.0055975
Redaktør: Michael Scheurer, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 13 august 2012; Godkjent: 04.01.2013; Publisert: 06.02.2013
Copyright: © 2013 Espinosa et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Council of Science and Technology (CONACYT, www.conacyt.mx), gi tall 8135 /A1, 24341 (JB) og 80680 (til SK), og National University of Mexico (www.unam.mx ), gi nummer SDI.PTID.05.2 (til JB). AME, AA og IMM var mottakere av stipend fra CONACYT. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den menneskelige papilloma virus (HPV) er den viktigste årsaksfaktor for utvikling av invasiv livmorhalskreft (CC), og HPV er funnet i nesten 100% av disse svulstene [1], [2]. CC resultater fra utviklingen av preinvasive cervikal intraepitelial neoplasi (CIN), som er histologisk gradert i mild (CIN 1), moderat (CIN 2) eller alvorlig (CIN 3) dysplasi. CC oppstår hovedsakelig fra CIN3 og CIN2, men sjelden fra CIN1; estimerte progresjon av disse lesjonene til CC er 12%, 5% og 1% henholdsvis [3]. For tiden er det vaksiner på markedet som hindrer infeksjon med onkogene HPV type 16 og 18, som er forbundet med 65-70% av CCs hele verden [4]. Disse vaksinene har svært høy virkningsgrad for forebygging av smitte og utvikling av høygradig cervikal intraepitelial neoplasi (CIN2 /CIN3) [5], [6]. Imidlertid må vaksinert kvinner fortsatt delta programmer for tidlig påvisning av CC siden disse vaksinene beskytter kun mot enkelte virustyper, og det er ennå ikke kjent hvor lenge immun beskyttelse mot målet virus restene [7], [8]. I mange land forebyggende vaksiner for HPV 16 og 18 er innarbeidet i det nasjonale vaksinasjonsprogrammet for jenter fra 9 til 12 år [9], [10]. Imidlertid, fordi den høyeste forekomst av CC forekommer hos kvinner 45-50 år, er effekten av disse preventive vaksinasjonsprogrammer på å redusere forekomsten av CC vil ikke være kjent i 30 år. Derfor er det nødvendig å forbedre fremgangsmåten for screening CC og behandling. Fordi hvert år 530 000 nye tilfeller av CC og 275 000 CC dødsfall rapportert på verdensbasis, er forekomsten dødelighet forholdet er omtrent 50% [11], [12].
For mange år, den Papanicolaou (PAP) testen har vært den viktigste screening prosedyre for tidlig deteksjon av CC, og dens massive søknad i utviklede land har redusert forekomsten av CC med mer enn 50% de siste 40 årene [13]. Kvinner med unormale Paps er referert for kolposkopi for å bekrefte eller forkaste eller avklare diagnosen med en histopatologisk undersøkelse. Men den gjennomsnittlige følsomhet av cytologi for påvisning av CIN lesjoner er 50-60%; Selv om spesifisiteten er meget høy, omtrent 90% [14]. Siden HPV er uunnværlig for utviklingen av CC, flere prosedyrer for å påvise HPV genomet er innarbeidet i CC screening. Sammenlignet med konvensjonelle cytologi, har HPV DNA-testing høyere sensitivitet, men lavere spesifisitet for påvisning av CIN2 lesjoner eller høyere (CIN2 +). Den høye følsomhet og høy negativ prediktiv verdi (NPV) av HPV DNA-tester for påvisning av CIN2 + lesjoner tyder på at det kan brukes til å forlenge screening intervaller. Imidlertid ville den lave spesifisitet av HPV DNA-tester øke antall oppfølgings tester og colposcopy henvisninger, noe som ville øke kostnadene for screening [15]. Derfor er det behov for å utvikle nye metoder for tidlig påvisning av CC med høy sensitivitet og spesifisitet er klar. Flere tumor markører assosiert med CIN2 + har blitt identifisert, spesielt
CDKN2A
,
TOP2A
, og
MCM2
. Imidlertid har disse markørene er foreslått ikke for screening, men for diagnose, prognose, eller klinisk ledelse [11], [16].
Invasiv livmorhalskreft er i dag behandles med kirurgi, cellegift, strålebehandling eller en kombinasjon av disse behandlinger, avhengig av den kliniske stadium av sykdommen. Suksessen til disse konvensjonell terapi og pasient overlevelse avtar etter hvert som sykdommen utvikler seg til mer avanserte stadier [17]. Faktisk har andelen av kvinner som overlever 5 år reduseres fra 93% for stadium IA til 15% for scene IVB (www.cancer.org). I motsetning til andre typer kreft, som flere konkrete molekylære stoffer har blitt utviklet [18], er det ingen spesifikke molekylære målrettede terapier for CC. Flertallet av medikamenter mot spesifikke mål i kreft er rettet mot muterte proteiner, spesielt protein kinaser [19]; imidlertid noen stoffer rettet mot normale proteiner som blir overuttrykt, slik som HER2 /neu i brystkreft [20], [21]. Det første trinnet i å utvikle en spesifikk molekylær stoffet er å identifisere universelle molekylære mål som finnes i pasienter med CC og fraværende hos friske kvinner.
Formålet med denne studien var å identifisere og karakterisere cellulære mål til stede i de fleste CCs og fraværende fra normalt vev i livmor som skiller seg tilstrekkelig mellom de 2 gruppene som skal behandles enten som mulige markører for screening, med en sensitivitet og spesifisitet nær 100%, eller som potensielle terapeutiske mål.
Methods
Etikk Uttalelse
studien protokollen ble godkjent av vitenskaps og etiske komiteer av Hospital General de Mexico (godkjenningsnummer DIC /03/311/04/051) og ble utført i samsvar med de etiske prinsipper som er beskrevet i 1964 Helsinkideklarasjonen. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle deltakerne før inklusjon i studien.
Fag, Samples, og eksperimentell design
Forsøkspersonene inkludert 69 pasienter med invasiv livmorhalskreft (CC) diagnostisert i Institutt for Oncology, 29 pasienter med lavgradig CIN (CIN1), 21 pasienter med høygradig CIN (CIN2 og CIN3), og 25 kvinner med normal cervical epitel evaluert i avdelingen for obstetrikk og gynekologi ved Hospital General de México i Mexico City. CC prøvene var en undergruppe valgt fra totalt 462 pasienter med CC som ble rekruttert sekvensielt fra november 2003 til juli 2007, noe som utgjorde ca 80% av pasientene nydiagnostiserte med CC i denne perioden på grunn av den restriktive inklusjonskriteriene (ingen tidligere behandling, hendelsen tilfelle, født i Mexico med meksikansk herkomst for 2 generasjoner). Utvalgskriteriene for CC delsett var basert på tilgjengeligheten av en frisk tumor biopsi for RNA-ekstraksjon med mer enn 70% tumorceller i morfologisk analyse (se nedenfor), for det meste FIGO stadier I /II, og virustype. Dette undergruppe inkluderte 47 prøver positive for HPV16 og 22 prøver positive for andre virustyper, inkludert HPV18, 31, 33, 45, 51, 58 og 59. Blant dem, 54 prøvene var av plateepitelkarsinom, 14 prøver var av adenokarsinomer, og en prøve var av en adenosquamous karsinom. Gjennomsnittsalderen for pasienter med kreft var 48 år (range, 23-78 år, Tabell S1). Alle pasientene fikk fullstendige kliniske evalueringer. Svulstene av CC pasienter ble iscenesatt i henhold til den siste internasjonale revidert protokoll for gynekologisk kreft [22]. En eller to biopsier, utført under kolposkopi eksamen, ble tatt fra svulster. En biopsi ble delt i 2 like deler, ble en del fiksert i bufret formol for morfologisk analyse og den andre delen, sammen med den andre biopsi, ble hurtigfrosset på tørris og lagret ved -80 ° C inntil analyse. Alle CC pasienter ble henvist til kirurgi, stråling, kjemoterapi, eller en kombinasjon av disse behandlingene i henhold til retningslinjene fra American Cancer Society (se nedenfor). Kontrolllivmorhalsprøver ble innhentet fra pasienter som gjennomgår hysterektomi grunn myomatosis på gynekologi Service av Hospital General de Mexico. De ble tidligere diagnostisert med en normal cervix ved cytologi og kolposkopi. Umiddelbart etter å ha mottatt en cervix fragment fra operasjonsstuen, ble exocervical og endocervikale epitheliums dissekert under et stereoskopisk mikroskop for å unngå stromale celler. Vevene ble deretter hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil bruk. For HPV deteksjon og skrive, ble en skrape fra endocervix og ectocervix oppsamlet med en cytobrush fra pasienter og kontroller ble cellene suspendert i en ampulle med utvinning buffer, og deretter lagret ved -20 ° C inntil analyse. Analyse av global genekspresjon (8,638 gener) ble utført i RNA ekstrahert fra 43 friske tumor biopsier positive for HPV16 og fra 12 prøver av normal cervical epitel ved hjelp av HG-Focus microarray. Global genekspresjon ble validert i 24 prøver, inkludert 19 CCs og 5 cervical epitel kontroller, av en annen høy gjennomstrømning microarray (HG-ST1.0). De 23 gener som viste størst deregulering ble validert av real time PCR (QRT-PCR) i 44 HPV16-positive CC og 25 kontrollprøver. De 6 mest differensielt uttrykte gener (
CCNB2
,
CDC20
,
PRC1
,
SYCP2
,
NUSAP1
, og
CDKN3
) ble videre undersøkt i 29 lavgradig cervikal intraepitelial neoplasi (CIN1) og 21 høyverdig CIN (CIN2 /3) for å undersøke om de kunne skille CC og CIN2 /3 (CIN2 +) fra CIN1 og kontroller. Immunhistokjemi (IH) ble utført for 10 utvalgte proteiner i 26 CC prøver og 10 kontrollprøver. Foreningen av 9 markører med overlevelse ble undersøkt ved overlevelsesanalyse av 42 pasienter med HPV16-positive CC som ble fulgt opp i minst 42 måneder.
DNA og RNA Isolation
DNA ble renset fra cervical skraper og noen biopsiprøver ved hjelp av PureLink Genomisk DNA Kit (Invitrogen, Grand Island, NY) og holdt ved -20 ° C inntil analyse. Total RNA ble isolert fra en halvdel av den delte biopsi ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Kvaliteten på RNA ble bekreftet ved agarosegelelektroforese, som demonstrert ved tilstedeværelsen av intakt ribosomalt RNA, med 28s bandet dobbelt så intens som den 18s band.
Detection og HPV Typing
HPV testing ble utført ved PCR ved bruk universelle primere som ligger i HPV
L1
genet
MY09 Twitter /
MY11
,
GP5
+ /
6 +
, og
L1C1
som beskrevet tidligere [23] – [25].
HBB
genet ble brukt som en intern kontroll for å vurdere kvaliteten på DNA. De HPV-typer ble identifisert ved sekvensering av forsterkede bandene i positive prøver ved hjelp av et fluorescerende syklus-sekvenseringsmetode (BigDye Terminator Klar Reaction Kit, Applied Biosystems, Foster City, California). Sekvensanalyse ble utført ved hjelp av en ABI PRISM 3130xl genetisk analysator (Applied Biosystems). Hver sekvens fra HPV-positive prøvene ble analysert ved FASTA sekvenslikhet verktøy [26]. Den gjennomsnittlige prosent identiteten til disse sekvensene til HPV-typer var 98,7% (range, 91-100%).
Gene Expression Profilering og dataanalyse
genuttrykket profilen til 43 CCs positive for HPV16 og 12 friske kontrolllivmorhals epitheliums ble undersøkt ved hjelp av human Gene Focus (HG Focus) oligonukleotid Microarray (MA) (Affymetrix, Santa Clara, CA). Denne rekken inneholder 8,794 probe sett tilsvarer 8,638 preget menneskelige gener i Gene Referansedatabase. Total RNA forberedelse (10 mikrogram), merket cRNA syntese, hybridisering, skanning og bildeanalyse ble utført i henhold til produsentens protokoller (Affymetrix Genechip Expression analysen manuell). For å vurdere kvaliteten av forsøkene ble de følgende parametere benyttet: økt ekspresjon av eksogene poly-A-kontroller (Lys Phe Thr Dap), nærværet av oligonukleotidet B2 brukt til å lage nett linjer, bakgrunn med et akseptabelt område fra 20 til 100, lik støyen på tvers av alle prøvene, i prosent av foreliggende anrop større enn 50%, et 3 «/5» forholdet til et konstitutivt genet (GAPDH eller β-aktin) på mindre enn 3, og økt ekspresjon av hybridiserings-kontrollene (BioB BioC Biod cre). Bare de MAs med optimale kvalitetskontroller ble analysert. Videre ble noen prøver utført i duplikat for å evaluere reproduserbarheten av eksperimentet, som var høyere enn 99%.
MA intensitetsverdier ble normalisert ved hjelp av Robust multichip gjennomsnitt (RMA) algoritmen ved bruk av FlexArray programvare [27]. De normaliserte intensitetsverdier ble referert til som enheter av intensitet (UI). Gener uttrykkes forskjellig mellom svulster og kontrollene ble identifisert ved hjelp av algoritmen Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM versjon 3.0, https://www.stat.stanford.edu/~tibs/SAM) ved hjelp av cut-off verdiene av en fold endring ( FC) av ≥1.5, en generell falsk oppdagelse hastighet (FDR) på 1%, og en lokal FDR av 10% [28]. Unsupervised hierarkisk clustering og prinsipal komponent analyse (PCA) ble utført ved hjelp dChip programvare (versjon 1.6, www.dCHIP.org) og R språk i Java-plattformen, henholdsvis.
Validering av Global Gene Expression av en Second høy gjennomstrømning microarray (HG-ST1.0)
genuttrykket profilen til 24 prøver utforskes med HG-Focus microarray, inkludert 19 CCs og 5 livmorhals epitel kontroller, ble også undersøkt ved hjelp av human Gene 1,0 ST oligonukleotid mikromatriser ( Affymetrix, Santa Clara, CA). Denne rekken inneholder 33,297 probe sett som tilsvarer ca 20 741 gener av det menneskelige genet referansedatabasen i henhold til UCSC Genome Browser Assembly mars 2006 NCBI 36 /hg18, tilgjengelig på https://genome.ucsc.edu/. Total RNA forberedelse (300 ng), merket DNA-syntese, hybridisering, skanning og bildeanalyse ble utført i henhold til produsentens protokoller (Affymetrix Genechip Expression analysen manuell). For å vurdere kvaliteten av forsøkene ble de følgende parametere benyttet: ekspresjon av eksogene poly-A-kontroller, tilstedeværelse av oligonukleotidet B2 brukt til å lage nett justeringer, og arealet under kurven (AUC) verdier over 0,8. Bare de mikromatriser med optimale kvalitetskontroller ble analysert. Mikromatriser ble normalisert ved hjelp av RMA algoritmen i Affymetrix uttrykk konsollen. De normaliserte intensitetsverdier ble referert til som enheter av intensitet (UI). De normaliserte intensiteter (log
2 verdier) av 8,370 gener som ble undersøkt på begge mikromatriser (HG ST1 og HG Focus) ble sammenlignet, og samvariasjon ble vurdert med Pearsons korrelasjonskoeffisient.
Validation Global Gene Expression av real-time Kvantitativ Retrotranscription PCR (QRT-PCR)
Revers transkripsjon av total RNA ble utført ved hjelp av High-Capacity cDNA Arkiv kit (Applied Biosystems) i et totalt volum på 20 mL. Blandingen inkludert 2 ug av RNA, 2 ul av 10 x RT-buffer, 0,8 ul av 100 mM dNTP, 2 ul av 10 x RT Random Primers, 1 pl MultiScribe ™ revers transkriptase (5 U /ul), og en pl RNase inhibitor (2 U /mL). Reaksjoner ble inkubert ved 37 ° C i 120 minutter, og deretter lagret ved -20 ° C. Et sett med 23 gener ble brukt til å validere genuttrykk i 44 HPV16-positive CC og 25 friske cervical Epitel kontrollprøver med QRT-PCR bruker TaqMan prober. Genene er inkludert er
CCNB2, CDC2, CDC20, CDKN2A, CDKN3, CKS2, MCM2, MKI67, NUSAP1, PCNA, PRC1, RFC4, RRM2, SMC4, SYCP2, TOP2A, TYMS, ZWINT, CFD, EDN3, NDN, SLC18A2 , etter og
WISP2
.
GAPDH
ble brukt som intern kontroll. TAQMAN genekspresjon analysene ble brukt (tabell S2, Applied Biosystems). Syv gener ble også undersøkt i 22 CC positive for andre HPV (
CCNB2
,
CDC20
,
CDKN3
,
PRC1
,
SYCP2
,
NUSAP1
,
TYMS
), og den første seks av dem, sammen med
CDKN2A
,
PCNA
,
MKI67
gener, ble videre undersøkt i 29 lavgradige CINS og 21 høyverdig CINS. Forsøkene ble utført i duplikat i et sluttvolum på 20 ul, inkludert 200 ng av cDNA-templat, 10 ul av 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1 ul 20 x TaqMan Gene Expression Assay, og 7 ul RNase-fritt vann. Den sykkel program ble kjørt i en Rotor-Gene (Corbett Research, Sydney, Australia), som ble satt som følger: en innledende PCR aktiveringstrinn ved 50 ° C i 2 minutter etterfulgt av 95 ° C i 10 minutter, og deretter 40 sykluser som smelter ved 95 ° C i 15 s og gløding /forlengelse ved 60 ° C i 1 min. Medianen av CT standardavvik i duplikater varierte 0,09 til 0,24 (gjennomsnitt = 0,16) blant de 23 gener, noe som tyder på at variasjonene mellom duplikatene var svært liten [29]. Måling av genekspresjon var basert på relative standardkurver konstruert av et 10-ganger seriefortynnet pool av CC eller normale cervikal epitelium cDNA som strekker seg 500 til 0,05 ng. Den første kurve ble anvendt for å beregne verdiene av oppregulert gener og den andre kurve verdiene av downregulated gener. Kurver for hvert gen ble testet i tre forskjellige forsøk løp i duplikat og gjennomsnitt av korrelasjons coeficients (r) var høyere enn 0,98. Ekspresjon av målgener ble normalisert i hver tumor og kontrollprøve til intensiteten av det indre referanse (
GADPH
) ved anvendelse av en tidligere beskrevet metode [30]. De normaliserte intensitetsverdier ble målt i ng /mL. En normalitet test (Shapiro-Wilk) ble utført for å teste for en normalfordeling av genuttrykk data. Fold-change-ekspresjon ble beregnet ved å dividere den midlere normaliserte intensiteten av tumorprøver ved median normaliserte intensiteten til kontrollprøvene. Den statistiske signifikans mellom medianer av svulster og kontroller ble beregnet med Mann-Whitney (MW) ikke-parametrisk test. Sammenhenger mellom MA resultater og QRT-PCR data ble utført ved hjelp av log
2 verdier og målt ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient.
Immunohistochemistry
protein uttrykk på 10 gener ble bestemt i 26 CC og 10 kontrollprøver med IH. To hjemmelagde microarray (TMA) ble bygget, en som inneholder 14 HPV16-positive CCs og 5 kontroller og den andre 12 CC positive for andre HPV og 5 kontroller. NUSAP1 ble utforsket bare i prøver av den første TMA. Sylindriske prøver fra representative områder av parafin innleiret vevsblokker, som tidligere er valgt av H E fargede objektglass, ble tatt med en punch-biopsi nål (2 mm diameter), overført til mottakerparafinblokker i definerte matrise stillinger og nylig innstøpt i parafin. Alle vev blokker matchet pasienter ble hentet fra patologi avdeling av sykehuset. Seriesnitt (4 mikrometer tykke) av TMA ble kuttet og den 10. lysbildet ble farget med H E for å bekrefte histopatologisk diagnose. Snittene ble nedsenket i xylen for å fjerne parafin og deretter rehydrert med gradert alkohol (100%, 95%, 90%, 80% og 70% volum /volum i vann). Epitop gjenfinning ble utført ved oppvarming av lysbildene, og innføring av dem i Target Retrieval løsning, pH 6,0 (Dako, Carpinteria, CA) ved 121 ° C i 5 minutter i en trykkoker. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved inkubering av lysbilder med 1% hydrogenperoksid i PBS i 10 min. Deretter ble en ikke-spesifikk bakgrunn blokker tilsatt og inkubert i 10 min. Primære antistoffer mot PCNA (sc-53407); p16 for CDKN2A (sc-71804); SCP-2 for SYCP2 (sc-20048), PRC1 (sc-56345); cyclin B2 for CCNB2 (sc-81241); CDKN3 (sc-475); og CDC2 for p34 (sc-70822), ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California). Antistoffene mot CDC20 (kat. 34-1900), ble Ki-67 for MKI67 (kat. M7187) og NUSAP1 (kat. H00051203-B01) oppnådd fra Invitrogen, Dako (Glostrup, Danmark), og Nova Biological (Littleton, CO ), respektivt. Fortynningen som benyttes for alle antistoffer ble 1:100, med unntak av CDC2, (01:50) og NUSAP1 (1:250), og det antistoff-fortynningsmiddel som ble anvendt var fra Dako. Et totalt volum på 300 ul ble tilsatt til hver seksjon, og objektglassene ble inkubert over natten ved 4 ° C i et fuktig kammer. Antigen-antistoff-kompleksene ble detektert av avidin-biotin-peroksidase-metoden, ved bruk av 3,3′-diaminobenzidin-tetrahydrocloride som et kromogent substrat (type KO679 LSAB + Sys /HRP;. Dako-Cytomation Carpinteria, CA), og seksjonene ble kontra med hematoksylin. Analyser ble utført in triplo. Antistoffene for SYCP2, PRC1, CCNB2, CDKN3, CDC2, og CDC20 ble testet i vev som er kjent for å gi uttrykk for disse antigener. SYCP2 ble testet i nyfødte testikkel; PRC1, CDC2, og CCNB2 ble testet i tykktarm kreft; og CDKN3 ble testet i lungekreft biopsier. Alle vev ble hentet fra arkivene til patologi avdeling. Prosentandelen av fargede celler ble beregnet ut fra en analyse av 10 suksessive kraftige felt av neoplastiske celler. Den cellulære lokalisering av immunoreaksjonen ble identifisert, og intensiteten av immunoreaksjon ble skåret fra 0 til 4, hvor 0 indikerte ingen farging. Immunreaksjon signaler ble funnet sjelden i stroma med alle antistoffer og ble ikke scoret for analysen. Immunostained lysbilder ble analysert og scoret av 2 patologer, som var blindet for utfallet. Sjeldne tilfeller med uharmoniske skår ble revurdert og scoret basert på konsensus mening.
Survival Analyse av kreftpasienter
Ifølge FIGO staging pasienter med livmorhalskreft fått individuell behandling basert på retningslinjer for behandling for livmorhalskreft av American Cancer Society (se tabell 1). Etter at behandlingen var ferdig, ble hver pasient klinisk evaluert for hver 3 eller 6 måneder ved en erfaren onkolog. Kliniske data fra oppfølgingsstudie ble hentet fra pasientenes medisinske posten. Også en sosialarbeider utføres telefonsamtaler og hjemmebesøk til pasienter hver 6. måned i løpet av studien. Pasienter registrert som lever i studien var vellykket fulgt opp i minst 42 måneder etter behandling. Sensurert og avdøde pasienter ble fulgt opp for antall måneder som er angitt i tabell 1. Sakene er utpekt som sensurert henvist til de pasientene som ble tapt til studiet i oppfølgingsperioden eller avdøde fra andre enn livmorhalskreft årsaker. Pasienter ble ansett som tapt når ikke delta på medisinsk avtaler for sykdomskontroll, ikke ble funnet på hjemmebesøk eller ikke svare på telefonsamtaler. I denne gruppen pasienter registrert som avdøde var bare de kvinnene som døde av livmorhalskreft primære svulsten som en hovedårsak. Årsaken til dødsfallet til alt, men en pasient som døde under oppfølgingen ble bekreftet av den medisinske posten og dødsattesten. Bare 42 av 44 pasienter med HPV16-positive CC utforsket med QRT-PCR ble inkludert i fulgt opp studien. Fire saker ble vurdert riktig sensurert og åtte dødsfall ble registrert. Den midlere følgende tids av de 42 pasientene var 50,5 måneder. Foreningen av FIGO og genekspresjon (
PRC1, CCNB2, CDC20, CDKN3, NUSAP1, SYCP-2, CDKN2A, PCNA, MKI67
) med overlevelse ble undersøkt av overlevelsesanalyse. Med hele prøvesett, ble 500 opplærings sett med 21 prøver tilfeldig opprettet for hvert gen utforsket. Å kategorisere genuttrykk data kvantifiseres ved QRT-PCR ble utført ROC analyse i hvert treningssett. Denne analysen ble gjort for å sette en cut-off for genekspresjon som representerte disse verdiene med høyest sensitivitet og spesifisitet for å differensiere mellom døde og overlevende pasienter. Hele Prøvesettet ble deretter analysert med gjennomsnittlig cut-off, beregnet fra verdiene for de 500 treningssett. Prøver med genuttrykk-verdier over cut-off ble satt til 1 og de med verdier under cut-off ble satt til 0. Den kumulative total overlevelse tid ble beregnet ved Kaplan-Meier metoden og analysert av log-rank test. FIGO iscenesettelse og genuttrykk ble inkludert som kovariater i en Cox proporsjonal risikomodell.
Gene ontologi Klassifisering Analyse
Database for kommentering, visualisering, og integrert Discovery (DAVID) funksjonell merknad verktøyet (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [31], [32] og oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA, Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) ble brukt til å klassifisere de deregulerte gener. Gener ble klassifisert ved hjelp av funksjonell annotering clustering vurderer genet ontologi biologiske prosesser. Klassifisering stringens ble satt på medium og maksimum nivå.
Gene Stempler og dataanalyse
Den fysiske plasseringen av gener ble kartlagt i henhold til UCSC Genome Browser Assembly mars 2006 NCBI 36 /hg18, tilgjengelig på https://genome.ucsc.edu/. Dataanalyse ble utført ved hjelp av Access 2010 (Microsoft Inc.). Den rå MA data er MIAME kompatibel og har blitt deponert i en MIAME kompatibel database (GEO, https://www.ncbi.nih.gov/geo/) under aksesjonsnummer GSE39001. Mottaker operatør karakteristisk (ROC) kurve analyse ble utført og Youden indeksen ble brukt [33] for å velge de beste loddepunkter for å skille svulster fra kontroller og CIN2 + fra CIN1- bruker uttrykket verdiene av utvalgte gener oppnådd ved QRT-PCR. For hver markør, sensitivitet, spesifisitet, positiv prediktiv verdi (PPV) og negativ prediktiv verdi (NPV) ble beregnet i henhold til tidligere beskrevne formler [34]. Alle testene var 2-sidig, og p-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Dataanalyse ble utført ved hjelp av Sigma Stat og SPSS ver. 17 programvare.
Resultater
Expression Analyse av 8,638 Gener i Livmorhalskreft
Den mengden av mRNA transkribert fra 8,638 gener ble sammenlignet mellom 43 CC prøvene positive for HPV16 og 12 normal cervical epithelial prøver ved bruk av HG-Focus microarray. Totalt 997 genene ble uttrykt forskjellig mellom kreft og kontroll-grupper; 600 ble oppregulert og 397 ble nedregulert (tabell S3). Nesten halvparten av de oppregulert og downregulated genene hadde FCS i området 1,5-2,0, og det antall gener i begge grupper ble redusert lineært (r = -0,8, p = 0,002) som FC verdien øket (figur 1). Den hovedkomponentanalyse (PCA; data ikke vist), og den ikke-overvåket hierarkisk clustering (panel A i figur 2) utføres med alle 997 genekspresjon verdier klart adskilt kreftprøvene fra kontrollgruppen. Imidlertid ekspresjonen av mange gener var ikke helt ensartet blant kreftprøvene, særlig i gruppen av oppregulert gener (signaler som er vist i rødt på figur 2A). Mange av disse gener ble oppregulert i noen tumorer og nedregulert i andre tumorer. Dette var i kontrast til ensartetheten av uttrykket signaler i kontrollgruppen prøvene. Gener som skulle testes, som markører for screening eller som potensielle terapeutiske mål ble valgt i henhold til Δ-stillingen verdi (en modifisert t-test, som brukes i SAM), FC eller om de tidligere ble anvendt som markører for livmorhalskreft. Fra 997 gener assosiert med kreftprøver, har 163 tidligere blitt rapportert som markører for ulike typer kreft (IPA, Oppfinnsomhet Systems), inkludert
MCM2
,
TOP2A
, og
CDKN2A
, som har blitt brukt som markører for diagnose i livmorhalskreft [35]. De 997 gener ble oppført i synkende bestilt av Δ-score (tabell S3). I alt 23 gener (18 oppregulert og 5 nedregulert) ble valgt for validering av QRT-PCR (uthevet i tabell S3 og tabell 2, sirkler farget i blått og oransje i figur 1). Alle downregulated gener (
CFD
,
NDN
,
WISP2
,
End3
, og
SLC18A2
) og 10 av 18 oppregulert gener (
PRC1
,
CKS2
,
TYMS
,
RFC4
,
RRM2
,
NUSAP1
MCM2
,
CCNB2
,
SMC4
, og
CDC2
) ble valgt i henhold til Δ-poengsum rang. Syv av de gjenværende oppregulert genene er på listen over de 50 beste rangert gener, to av dem er gener som tidligere har blitt foreslått som markører i CC (
CDKN2A Hotell og
TOP2A
), 4 (
CDC20
,
CDKN3
,
ZWINT
, og
SYCP2
) ble valgt basert på FC verdi, og
PCNA
(tabell S3), sammen med
MKI67
, som rangert på 139. plass, ble inkludert fordi disse markørene blir ofte brukt til å måle celleproliferasjon. en. en. b. c. b.
