Abstract
Menneskelig telomerase revers transkriptase (hTERT) er nøkkelen enzym som er ansvarlig for å syntetisere og vedlikehold av telomerer på endene av kromosomer, og det er essensielt for celleformering. Dette har gjort hTERT et fokus for onkologi forskning og et attraktivt mål for kreft narkotika utvikling. I denne studien vi utviklet en liten interfererende RNA (siRNA) rettet mot den katalytiske subenhet av hTERT og testet dens virkninger på veksten av telomerase-positive humane kolon-karsinom SW480 celler in vitro, så vel som på den tumorigenisitet av disse cellene i nakne mus . Forbigående og stabil transfeksjon av hTERT siRNA inn i tykktarm kreft SW480 celler trykkes hTERT uttrykk, redusert telomerase aktivitet og hemmet cellevekst og spredning. Knocking ned hTERT uttrykk i SW480 svulster xenopodet inn i nakne mus redusert betydelig tumorvekst og fremmet tumor celle apoptose. Våre resultater tyder på at hTERT er involvert i kreftutvikling av menneskets tykktarm kreft, og de markere det terapeutiske potensialet i en hTERT knock-down tilnærming
Citation. Liu AQ, Ge LY, Lu XL, Luo XL, Cai YL Ye XQ, et al. (2014) stanse av den hTERT Gene av shRNA Hemmer Colon Cancer SW480 cellevekst
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE ni (9): e107019. doi: 10,1371 /journal.pone.0107019
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 10. oktober 2013, Godkjent: 14 april 2014; Publisert: 10.09.2014
Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av stiftelsen Natural Science of Guangxi (tilskudd 2010GXNSF013238, https://www.gxst.gov.cn/zwgk/kjxmgl/xmxdgg/600619_7.shtml) og programmer for Changjiang Forskere og innovativ forskning team ved universitetet (No. IRT1119). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Colorectal kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje vanligste kreftformen i verden og den fjerde vanligste dødsårsaken [1] – [2]. I 2008 alene, ble ca 1.23 million nye tilfeller av tykktarmskreft diagnostisert rundt om i verden, og 608,000 mennesker døde av sykdommen [3]. Standard behandling for denne kreftformen er kirurgisk, men resultatene er langt fra tilfredsstillende, med opp til 50% av pasienter som lider tilbakefall eller død innen 5 år etter operasjonen [4].
Målrette telomerase i colon carcinoma kan gi en effektivt alternativ eller supplement til kirurgisk behandling. Telomerase, en ribonucleoprotein kompleks inneholdende et internt RNA-templat (HTR) og en katalytisk protein med telomer-spesifikke revers transkriptaseaktivitet (hTERT), strekker telomerer på slutten av eukaryote kromosomer, og dermed hindrer celle alderdom og død. Telomerase ser ut til å spille en nøkkelrolle i tumorvekst og proliferasjon: ekspresjon og aktivitet av enzymet blir unormalt forhøyet i de fleste kreft [5] – [6], og nedregulering av enzymet hemmer vekst og proliferasjon [7]. Mens HTR er konstitutivt til stede i normale og tumorceller, er hTERT det hastighetsbegrensende komponent av telomerase-komplekset, og dets ekspresjon korrelerer med telomeraseaktivitet [8]. I normale somatiske vev, er hTERT aktiviteten undertrykt, men både hTERT ekspresjon og telomeraseaktivitet er forhøyet i de fleste humane tumorer [9] – [10]. Flere studier indikerer at telomerase kan være nøkkelen til å udødeliggjøre celler som et nødvendig skritt i onkogenese [11] -. [12], noe som gjør hTERT et potensielt nyttig klinisk biomarkør [13] og mål for kreft forskning [14]
i tykktarmskreft, opp til 85% av cellene inneholder aktiv telomerase, mens bare omtrent 5% av de normale kolorektal cellene inneholder aktivt enzym. Derfor er rettet mot ekspresjon eller aktivitet av telomerase kan tilveiebringe en ny terapi for kolorektal kreft. Gitt at det ikke svært selektive telomerase-hemmere er tilgjengelig for behandling av enhver kreft, fokuserte vi på genterapi tilnærminger. Genterapi er forventet å spille en nøkkelrolle i neste generasjon kreftbehandling i forbindelse med konvensjonelle behandlinger som kirurgi, cellegift og strålebehandling [15]. En genterapi er RNA interferens (RNAi), som kan nedregulerer ( «knock-down») ekspresjon av spesifikke gener, slik at funksjonene til de genene som skal analyseres eller sperret for terapeutiske formål [16] – [18].
i denne studien har vi utviklet en ny hTERT liten interfering RNA (siRNA) og uttrykte den tilsvarende kort hårnål RNA (shRNA) i humane kolorektal celler in vitro og i nakne mus. Vi fant ut at å slå ned hTERT uttrykk hemmet human colon carcinoma cellevekst, øke muligheten for genterapi tilnærminger som er rettet mot hTERT.
Materialer og metoder
Cell kultur
Menneskelig tykktarmen carcinoma cellelinjer SW480, DLD-en, og HT29 (Academia Sinica Cell Bank, Shanghai, Kina) ble dyrket i lav glukose Dulbeccos modifiserte Eagle medium (SW480) eller RPMI-1640 medium (DLD-en og HT29) (GibcoBRL Grand Island, NY, USA) supplementert med 10% (v /v) føtalt bovint serum, 100 IU /ml penicillin og 10 mg /ml streptomycin. Kulturer ble inkubert i 5% CO
2 ved 37 ° C.
Etikk erklæringen og dyr
Denne studien ble utført i henhold til Guide for omsorg og bruk av laboratorie dyr av det amerikanske National Institutes of Health, og studieprotokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Guangxi Medical University. Alle operasjoner ble utført under natrium-pentobarbital-anestesi, og lidelse ble minimaliseres så mye som mulig. Atymiske nakne mus (BALB /CA nu /nu) i alderen 4-5 uker (Guangxi Institute of Materia Medica, Nanning, Kina) ble plassert i sterile merdene under laminær luftstrøm hetter i en bestemt patogen fritt rom med en 12 h: 12 h lys-mørk planen. Dyrene ble foret autoklavert Chow og vann ad libitum.
RT-PCR for å måle hTERT mRNA ekspresjon i forskjellige cellelinjer
Total RNA ble ekstrahert fra SW480, DLD-1 og HT29-celler ved hjelp av Trizol ( Bio Basic Inc., Canada) i henhold til produsentens instruksjoner. Første-tråd cDNA-syntese ble utført med 2 ug RNA fra hver cellelinje og Moloney murin leukemivirus RT (MMLV-RT, MBI Fermentas, Amherst, NY, USA), så forsterket i en 50 pl reaksjonsblanding inneholdende 50 mM hver av de fire dNTP, 3 U av Taq DNA-polymerase (Promega), og 0,5 mM primere (Sangon Co, Shanghai, Kina). Primerne 5′-GCTGCTCAGGTCTTTCTTTTATG-3 «og 5′-CGACGTAGTCCATGTTCACAA-3′ ble anvendt til å amplifisere et 252 bp region i hTERT-gen. Som en intern kontroll, ble ekspresjon av glyceraldehyd fosfat dehydrogenase (GAPDH) analysert ved anvendelse av primerne 5»-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3 «og 5′-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3» for å forsterke et 450-bp regionen. Amplifikasjons-reaksjoner ble utført i 30 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 56 ° C i 45 s og 72 ° C i 45 sek. PCR-produktene ble separert på en 2,0% agarose-gel som ble farget med nukleinsyre flekk I (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), fotografert og analysert semikvantitativt ved hjelp GeneTools Analysis Software (Syngene, Cambridge, UK). Cellelinjen som viser den høyeste grad av hTERT mRNA ble valgt for videre studier.
Design av siRNAs rettet mot hTERT
Tre hTERT siRNA sekvenser ble utformet som beskrevet [19]. Sekvensene var som følger, med nucleotide startposisjoner basert på NCBI oppføringen for hTERT (tiltredelse NM_198253): hTERT-966, 5′-CGGUGUACGCCGAGACCAATT-3 «;
hTERT-2862, 5′-GAGCCAGUCUCACCUUCAATT-3 «; og hTERT-2985, 5»-CGGUGUGCACCAACAUCUATT-3 «. Parallelt, har vi utviklet en ikke-relatert sekvens som en negativ kontroll for spesifisitet siRNA: 5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «. Alle fire sekvenser ble sendt til en BLAST søk mot det menneskelige genom for å utelukke muligheten for betydelig homologi til andre gener. Sekvensene ble kjemisk syntetisert (GenePharma Co, Shanghai, Kina) og forbigående transfektert inn SW480 kulturer som hadde blitt dyrket over natten til 40-60% konfluens i fullstendig medium uten antibiotika. Transfections ble utført ved hjelp av Lipofectamine reagens (GenePharma Co, Shanghai, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 48-timers transfeksjon, revers transkriptase (RT) -PCR ble anvendt for å måle hTERT mRNA-ekspresjon. Den hTERT-2985 sekvens ble funnet å redusere nivået av hTERT mRNA i størst grad, og ble derfor valgt for videre studier.
Bygging av en hTERT-shRNA eukaryote uttrykk plasmid
RNA oligonukleotider 5′-CGGUGUGCACCAACAUCUATT-3 «(fornuft) og 5′-UAGAUGUUGGUGCACACCGTC-3» (anti) ble kjemisk syntetisert (GenePharma Co, Shanghai, Kina) og glødet for å danne en duplex med en symmetrisk overheng av to deoxythymidines på 3 « enden (hTERT-siRNA). Et siRNA-dupleks inneholdende urelaterte sekvensen 5»-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3 «(NC-siRNA) ble også syntetisert som en negativ kontroll for siRNA spesifisitet. For å konstruere et plasmid som uttrykker NC- eller hTERT-siRNA for stabil transfeksjon ble glødet oligonukleotider 5»-caccgTTCTCCGAACGTGTCACGTcaagagattACGTGACACGTTCGGAGAAtttttt-3 «og 5′-caccgCGGTGTGCACCAACATCTAttcaagagaTAGATGTTGGTGCACACCGttttttg-3» (mål sekvenser i store bokstaver) subklonet inn i PGPU6 /GFP /Neo vektor (GenePharma). Denne vektoren uttrykker korall grønt fluorescerende protein (cGFP) under kontroll av CMV-promoteren for å tillate overvåking av transfeksjonseffektivitet. Plasmider uttrykker NC- og hTERT-siRNA ble betegnet henholdsvis PGPU6 /GFP /Neo-NC-shRNA (heretter: NC-shRNA) og PGPU6 /GFP /Neo-hTERT-shRNA. (Heretter: hTERT-shRNA)
Transient transfeksjon av SW480 celler
kulturer av 2 x 10
5 celler per brønn ble dyrket i 6-brønners plater til 90% samløpet og transfektert med 100 nM NC-shRNA eller hTERT-shRNA hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Parallelt ble celler transfektert med den samme mengde av Lipofectamine 2000 uten at shRNA-plasmid som en kontroll. Kulturer ble høstet i triplikat etter transfeksjon for 24, 48 og 72 timer.
RT-PCR for å måle hTERT mRNA-ekspresjon etter transfeksjon
På hvert tidspunkt som er angitt ovenfor, ble total RNA ekstrahert fra transfektert SW480 celler ved anvendelse av Trizol og utsatt for RT-PCR som beskrevet ovenfor.
Immunocytochemistry for å måle hTERT-proteinet uttrykket
SW480-celler ble sådd ut på 2,5 cm dekkglass ved en tetthet på 5 x 10
5-celler /brønn på 6-brønners plater. Etter transfeksjon i 24, 48 eller 72 timer, ble Dekk fjernet og immunostained med kanin polyklonale anti-hTERT antistoff (1:300, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) og Maxvision kit (Maixin, Fuzhou, Kina). På hver dekkglass ble fem visninger tilfeldig valgt og tatt med bildeanalyse programvare (Leica, Tyskland). I hver visning, ble gråtoner intensitet målt til 10 tilfeldig utvalgte punkter og i gjennomsnitt. Den gjennomsnittlige gråtone intensitet var omvendt proporsjonal med proteinnivået.
TRAP analyse av telomeraseaktivitet
Telomerase-aktivitet ble undersøkt ved anvendelse av en kommersiell Telomerase PCR ELISA-sett (Roche Diagnostics Scandinavia AB, Stockholm, Sverige) i henhold til produsentens instruksjoner. Denne analyse er basert på den telomeric gjenta amplifikasjonsprotokoll [20]. Etter SW480 celler hadde blitt transfektert i 48 timer med Lipofectamine 2000 alene, NC-shRNA eller hTERT-shRNA eller venstre utransfekterte i dyrkingsmedium som en blank kontroll ble total cellulære proteiner hentet ved hjelp av CHAPS lysebuffer, og en 0,5-mikrogram delmengde var analysert. Analysen besto av en telomerase-primer forlengelsesreaksjon, etterfulgt av 26 PCR-sykluser. PCR-produktene ble detektert ved anvendelse av en ELISA-basert farge reaksjon [20].
Telomerase-aktivitet ble uttrykt som en justert absorbans, gitt av absorbansen i vilkårlige enheter ved 450 nm minus absorbansen ved referansebølgelengde på 690 nm . Ifølge produsentens instruksjoner, bør den maksimale justerte absorbans for den negative kontrollen være 0,25, mens justert absorbans for den positive kontrollen reaksjon følger med i settet skal være 1,5 etter 20 min reaksjon. Prøver ble definert som telomerase-positive hvis justert absorbans var . 0,2
Flowcytometri å måle cellevekst og spredning
SW480 celler transfektert i 48 timer med Lipofectamine 2000 alene, NC-shRNA eller hTERT-shRNA eller venstre utransfekterte i dyrkningsmediet som en blank kontroll ble høstet, vasket med fosfatbuffret saltvann (PBS), og fiksert over natten med 66% etanol. Cellene ble sentrifugert og vasket med PBS og deretter inkubert med 50 ug /ml propidiumjodid og 2,5 mikrogram /ml RNase i PBS i 30 minutter ved romtemperatur. DNA-innholdet ble analysert ved hjelp av strømningscytometri ved en emisjonsbølgelengde på 488 nm ved bruk av Multicycle programvare (BD Biosciences, USA) [21]. Utbredelsen indeks (PI) ble beregnet i henhold til formelen:
PI = [S + (G2 /M)] /{(G0 /G1) + [S + (G2 /M)]} x 100 %.
Flow-cytometri for å måle apoptose
apoptose ble målt ved dobbel-farging av celler for annexin V og DNA (propidiumjodid), og analysere dem ved strømningscytometri. SW480-celler transfektert i 48 timer med Lipofectamine 2000 alene, NC-shRNA eller hTERT-shRNA ble dyrket i nærvær av de angitte konsentrasjoner av pristimerin, høstet, vasket med PBS, og inkubert i Annexin V bindingsbuffer (BD Pharmingen) inneholdende 0,3% FITC-konjugert Annexin V i 15 minutter ved romtemperatur. Cellene ble vasket og resuspendert i Annexin V bindingsbuffer. Propidiumjodid ble tilsatt like før flowcytometri [21] – [22]. Data ble analysert ved hjelp FACSDiva programvare (BD Biosciences).
TUNEL analyse for å måle apoptose
The Dead End Colorimetric TUNEL System (Kaiji, Nanjing, Kina) ble brukt til å måle apoptose i SW480 kulturer transfektert med Lipofectamine 2000 alene, NC-shRNA eller hTERT-shRNA, så vel som i nakne mus injisert med saltvann, NC-shRNA eller hTERT-shRNA plasmider (se nedenfor). For in vitro forsøk ble SW480 celler sådd ut på 2,5 cm Dekk og transfektert i 48 timer, hvoretter Dekk ble fjernet og faste for Tunel analysen i henhold til produsentens protokoll. For in vivo-forsøk, tumorvev skiver (5 um tykt) ble fremstilt. Lysbilder ble fiksert i 10% PBS-bufret formalin (Kaiji, Nanjing, Kina) og permeabilized med proteinase K (Kaiji). Deretter lysbilder ble behandlet som beskrevet av produsenten.
Slides ble analysert for apoptotiske celler etter produsentens protokoll. I korthet, ble rekombinant terminal deoksynukleotidyltransferase brukes til å legge biotinylerte nukleotider i DNA, natriumklorid og natriumcitrat ble tilsatt for å stoppe reaksjonen, og deretter ble objekt inkubert med pepperrot-peroksidase-merket streptavidin. Til slutt ble platene inkubert med en blanding av hydrogenperoksyd, diaminobenzidin kromogen, og peroksidase-substrat for å farge kjerner mørk brun. Fargede objektglass ble deretter analysert ved lysmikroskopi ved hjelp av en bildesystem (Leica, Tyskland). Minst 3 høy forstørrelse felt ble undersøkt på hvert lysbilde ( 500 celler helt)., Og apoptotisk indeks (AI) ble beregnet som prosentandelen av observerte celler flekker TUNEL-positive
Transmission elektronmikroskopi ( TEM) for å vurdere apoptotisk morfologi
SW480 celler ble transfektert i 48 timer med Lipofectamine 2000 alene, NC-shRNA eller hTERT-shRNA og deretter høstet. Celler ble pelletert, umiddelbart fiksert i 3% (v /v) glutaraldehyd, postfiksert i 1% (v /v) osmium-tetroksyd og farget med 4,8% uranylacetat. Etter dehydrering gjennom en gradert serie av alkoholløsninger, ble prøvene skylt i propylenoksyd og impregnert med epoksyharpiks. De supertynne seksjoner ble behandlet med uranylacetat og føre citrate å gi kontrast for TEM, som ble utført ved hjelp av en JEM-1230 mikroskop (JEOL, Japan).
Måling av mitokondriemembranen potensial (MMP) for å vurdere apoptose
MMP ble målt ved hjelp av rhodamine 123 fluorescerende fargestoff som en indikator (CAS 83702, Sigma, Shanghai, Kina) som tidligere beskrevet [23]. Dette fargestoff har en eksitasjon maksimum ved 488 nm og en emisjonsmaksimum ved 526 nm. I denne tilnærmingen er MMP antas å variere omvendt med rhodamin 123 fluorescens. SW480-celler ble transfektert i 48 timer med Lipofectamine 2000 alene, NC-shRNA eller hTERT-shRNA, deretter vasket to ganger med PBS for å fjerne døde celler og inkubert med rhodamin 123 (0,1 ug /ml) ved 37 ° C i 30 minutter. Rhodamine 123 fluorescensintensiteten ble målt ved hjelp av konfokal scanning mikroskopi (NIKON-AE, Japan). For hver eksperimentell tilstand, ble bety fluorescens intensitet bestemmes for 500 celler.
hTERT knock-down i en naken mus tumor modell
SW480 celler ble subkutant injisert i høyre flanke av hårløse mus på en dose på 5 x 10
7-celler per mus i 200 pl DMEM fortynnet 1:02 i PBS [24]. Når tumorknuter hadde vokst til 7 mm, ble musene tilfeldig delt i tre grupper på 8 dyr, med hver gruppe mottok en total på 6 intratumor injeksjoner av fysiologisk saltvann, 20 pg NC-shRNA eller 20 ug hTERT-shRNA hver 2 dager . Dyrene ble observert i 6 dager etter den siste injeksjonen shRNA [25]. Tumorlengde (L), bredde (W) og diameter ble målt to ganger i uken; tumorvolum (cm
3) ble beregnet ved bruk av formelen W
2 x (L /2) [26]. Musene ble drept og nøytrale formalinfiksert tumorprøver ble farget med hematoksylin-eosin og undersøkt ved lysmikroskopi.
Nivåer av hTERT mRNA og protein i de tre gruppene av nakne mus ble bestemt, henholdsvis ved RT- PCR og immunhistokjemi, som beskrevet ovenfor. Telomeraseaktivitet og omfang av apoptose ved hjelp av TUNEL-analyse ble også målt som beskrevet ovenfor.
Statistisk analyse
Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Alle statistiske analyser ble utført ved anvendelse av SPSS 16,0 (IBM, USA). Forskjeller mellom behandlingsbetingelser ble undersøkt for statistisk signifikans ved hjelp av en-veis ANOVA, etterfulgt av LSD eller Dunnetts t-test metode. Terskelen for signifikans ble definert som
P
. 0,05
Resultater
Endogen hTERT uttrykk i tykktarm kreft cellelinjer
Først vi vist den SW480 , DLD-1, og HT29 linjer for å identifisere som hadde tilstrekkelig høy hTERT mRNA uttrykk for å lette RNA interferens og analyse av effekter på cellevekst. RT-PCR viste at hTERT mRNA nivåer var knapt synlig i DLD-1 celler og betydelig høyere i SW480 celler enn i HT29 celler (0,827 ± 0,037
vs
0,705 ± 0,051,
P .
0,05 fig. 1A). Derfor SW480 celler ble valgt for videre studier.
(A) Endogene hTERT mRNA uttrykk i SW480, DLD-1 og HT29 cellelinjer. Det var signifikante forskjeller mellom SW480, HT29 og DLD-1 celler (
#
P
0,01), og mellom SW480 og HT29 celler (*
P
0,05). (B) Styrken av hTERT siRNAs i SW480 celler. Nivåene av hTERT mRNA var betydelig lavere i cellene transfektert med hTERT sirnas enn i celler transfektert med negativ kontroll (NC) shRNA eller Lipofectamine alene (Lipo). *
P
0,05,
#
P
0,01, sammenlignet med NC-shRNA og Lipo grupper. Resultatene er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter.
Screening for den mest potente hTERT siRNA i SW480 kulturer
Tre hTERT-sirnas (hTERT-966, hTERT-2862, hTERT- 2985) og en ikke-relaterte siRNA som en negativ kontroll (NC-siRNA) ble transient transfektert inn i SW480 celler for å identifisere den siRNA det mest potente trykkes hTERT mRNA nivå, samt for å bekrefte spesifisiteten til hTERT vår siRNA tilnærming. Kontroll celler transfektert med Lipofectamine reagens alene ( «Lipo») eller med NC-siRNA viste tilsvarende nivåer av hTERT mRNA (0,823 ± 0,025 og 0,815 ± 0,043, henholdsvis;
P
0,05). Transfeksjon med noen av de tre hTERT-sirnas ført til betydelig lavere hTERT mRNA nivåer enn transfeksjon med NC-siRNA eller Lipo alene (figur 1B.): HTERT-966, 0,395 ± 0,075; hTERT-2862, 0,650 ± 0,064; hTERT-2985, 0,270 ± 0,056 (alle
P
0,05). Av de tre hTERT siRNA sekvenser som ble testet, ble hTERT-2985 identifisert som den mest potente og ble derfor brukt til å konstruere en hTERT-shRNA eukaryote uttrykk plasmid for ytterligere in vitro og in vivo studier.
Uttrykk for hTERT-shRNA i SW480 celler ned-regulerer mRNA og protein uttrykk
Vi transfektert SW480 celler med hTERT-shRNA eller NC-shRNA for 24, 48 og 72 timer, deretter målt uttrykk for hTERT mRNA og protein. Ved 48-h transfeksjon, kontrollkulturer viste lignende mRNA nivåer: dyrkingsmedium alene (blank), 0,530 ± 0,032; Lipofectamine alene (Lipo), 0,483 ± 0,075; NC-shRNA, 0,447 ± 0,058. Nivåene av mRNA var signifikant lavere etter 48-h transfeksjon med hTERT-shRNA (0,322 ± 0,030;
P
0,05 eller
P
0,01; Fig. 2A). Faktisk vil reduksjonen i hTERT mRNA var allerede observeres etter 24 timers transfeksjon. Det ble imidlertid ingen forskjeller i hTERT mRNA uttrykk funnet mellom gruppene etter 72-h transfeksjon (Fig. 2A).
(A) RT-PCR analyse av hTERT mRNA uttrykk i SW480 kulturer etter mock-transfeksjon med kultur medium alene (blank), Lipofectamine alene (Lipo), negativ kontroll siRNA (NC-shRNA), eller hTERT-shRNA. Nivåene av mRNA nivåene var signifikant lavere etter 48-h transfeksjon med hTERT-shRNA enn etter kontrolltrans.
▴
P
0,05,
#
P
0,01, sammenlignet med Blank; *
P
0,05, sammenlignet med Lipo og NC-shRNA. (B) Immunocytochemistry av hTERT protein uttrykk. (A) Blank-celler, (b) Lipo-celler, (c) NC-shRNA celler, og (d) hTERT-shRNA celler. Alle visninger, × 400. Høyere gråtoner verdien indikerer lavere proteinnivå. Protein nivåene var signifikant lavere etter 48-h transfeksjon med hTERT-shRNA enn etter kontrolltrans.
#
P
0,01, sammenlignet med de andre gruppene; *
P
0,05, sammenlignet med Blank. (C) HTERT nedregulering inhiberer telomerase-aktivitet. Telomerase aktivitet [justerte absorbans (450 nm-630 nm)] var betydelig lavere i celler transfektert med hTERT-shRNA enn i kontrollceller. *
P
0,05, sammenlignet med Lipo og Blank kontroller. Resultatene er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter.
Lignende resultater ble oppnådd da vi undersøkte hTERT protein uttrykk. Mens de tre kontrolltrans førte til sterk gul nukleær membranfarging med rikelig brune partikler i kjernene, transfeksjon med hTERT-shRNA resulterte i mye svakere farging (fig. 2B, a-d). Kvantifisering av gråtoner intensiteter, som varierte omvendt med nivået på hTERT protein, viste at 48-h transfeksjon med hTERT-shRNA ført til mye lavere proteinnivå (209.600 ± 17,101) enn transfeksjon med kulturmedium alene (146,500 ± 22,325), Lipofectamine alene (151,800 ± 24,478) eller NC-shRNA (167,350 ± 37,754) (
P
0,01; fig. 2B). Etter 72-h transfeksjon, selv om en betydelig forskjell vedvarte mellom hTERT-shRNA og blank kontroll (239,500 ± 9,546 vs. 223,950 ± 10,259,
P
0,05, Fig. 2B), var det ingen signifikant forskjell mellom hTERT-shRNA og NC-shRNA. Disse resultatene trolig gjenspeiler det faktum at vår ekspresjonsvektor er beregnet for korttids uttrykk studier fordi den ikke integreres i vertsgenomet. Derfor utførte vi all videre in vitro eksperimenter ut til 48 timer.
hTERT nedregule hemmer telomerase aktivitet i SW480 celler
Det ble ikke observert tilsvarende nivåer av telomerase aktivitet i SW480 celler transfektert for 48-h med kultur medium alene (2,756 ± 0,089), Lipofectamine alene (2,693 ± 0,225) eller NC-shRNA (2,691 ± 0,119). I motsetning til 48-h transfeksjon med hTERT-shRNA ført til betydelig lavere telomerase aktivitet (2,242 ± 0,284;
P
0,05 Fig. 2C).
hTERT nedregule reduserer vekst og spredning av SW480 celler
andelen av celler i G0 /G1 fase var signifikant høyere etter 48-h transfeksjon med hTERT-shRNA (49,37 ± 1,63%) enn etter transfeksjon med kulturmedium alene (42.27 ± 2.76%) , Lipofectamine alene (42.43 ± 4.67%) eller NC-shRNA (37,07 ± 1,53%, P 0,05). På samme tid, spredning indeksen var mye lavere etter transfeksjon med hTERT-shRNA (50,6 ± 1,57%) enn etter transfeksjon med NC-shRNA (59,03 ± 5,86%, P 0,05); indeksen var lik for alle tre kontrollgruppene (fig. 3A).
(A) hTERT-shRNA reduserer vekst og proliferasjon av SW480-celler. Andelen av celler i G0 /G1 fase var betydelig høyere og spredning indeksen var mye lavere etter transfeksjon med hTERT-shRNA enn etter kontrolltransfeksjoner. *
P
0,05, sammenlignet med de tre andre grupper;
#
P
0,05, sammenlignet med NC-shRNA. (B) hTERT-shRNA øker apoptose av SW480 celler. Celler ble transfektert med (a) hTERT-shRNA eller (b) NC-shRNA, farget med diaminobenzidin (brunt) og mot-farget med hematoksylin (blå) å merke kjerner. Bildene er representative resultater fra tre uavhengige eksperimenter. Forstørrelse, × 400. Den apoptotiske indeks (AI) var signifikant høyere i celler transfektert med hTERT-shRNA.
#
P
0,01, sammenlignet med de tre andre gruppene. (C) Transmisjonselektronmikroskopi-analyse av SW480-celler transfektert med (a-c) hTERT-shRNA eller (d) NC-shRNA. Apoptotisk morfologi var synlig i celler transfektert med hTERT-shRNA. Forstørrelse, × 3800. (D) rhodamin 123 fluorescensintensiteten analyse av SW480-celler transfektert med (a) dyrkningsmedium alene (blank), (b) Lipofectamine alene (Lipo), (c) NC-shRNA eller (d) hTERT-shRNA. Fargede celler ble analysert ved konfokal mikroskopi scanning; høyere fluorescens intensitet indikerer lavere mitokondriemembranen potensial. Forstørrelse, × 400. Celler transfektert med hTERT-shRNA viste signifikant høyere rhodamin 123 fluorescens enn gjorde kontrollceller. *
P
0,05, sammenlignet med NC-shRNA eller Lipo;
#
P
0,01, sammenlignet med Blank. Resultatene er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter.
hTERT nedregulering øker apoptose av SW480 celler
I motsetning til kontroll-transfekterte celler, celler transfektert med hTERT-shRNA var krympet i utseende; de viste dypt brun farging i cellemembranen, cytoplasma eller kjernen; og de av og inneholdt apoptotiske legemer (fig. 3B, a-b). TUNEL-farging viste at andelen av apoptotiske celler var mye høyere etter transfeksjon med hTERT-shRNA [Apoptose indeks (AI) = 22,2 ± 4,25%] enn etter transfeksjon med kulturmedium alene (1,98 ± 1,05%), Lipofectamine alene (2,2 ± 1,20 %) eller NC-shRNA (2,4 ± 1,25%, alt
P
0,01; fig. 3B). TEM-analyse viser også at en stor andel av celler transfektert med hTERT-shRNA hadde apoptotisk morfologi, herunder redusert volum, redusert antall fremspring og mikrovilli, og ujevn kromatin akkumulering under kjernemembranen (fig. 3C, a). Noen cellekjerner var halvmåneformet, sirkulær eller tykk, og mange celler inneholdt mange vakuoler (Fig. 3C, b-c). I motsetning til dette, kontroll-transfekterte celler viste normal indre struktur (fig. 3C, d).
Som et ytterligere mål for apoptose, brukte vi rhodamin 123 som en indeks av MMP (Fig. 3D, a-d) ; i denne analysen, indikerer høyere fargestoff intensitet lavere MMP, som er assosiert med apoptose. Celler transfektert med hTERT-shRNA viste signifikant høyere rhodamine 123 fluorescens (719,998 ± 17,083) enn celler transfektert med kulturmedium alene (545,833 ± 6,811,
P
0,01), NC-shRNA (585,361 ± 51,781,
P
0,05) eller Lipofectamine alene (632,169 ± 65,635,
P
. . 0,05) (figur 3D)
hTERT-shRNA hemmer tumorcellevekst
in vivo
En xenograft tumor modellen ble etablert ved å injisere hårløse mus med SW480 celler og deretter injisere de resulterende svulster med NC-shRNA eller hTERT-shRNA. Periodisk måling av tumorstørrelse viste at 31 dager, svulster behandlet med hTERT-shRNA (0,248 ± 0,102 cm
3) var betydelig mindre enn svulster behandlet med saltvann (0,543 ± 0,230 cm
3
P
0,05) eller NC-shRNA (0,580 ± 0,293 cm
3
P
0,01;. fig. 4A)
(A) hTERT-shRNA hemmer tumor cellevekst. Tumorvekst på 31 dager var betydelig tregere i svulster behandlet med hTERT-shRNA enn i tumorer behandlet med saltvannsoppløsning (*
P
0,05) eller NC-shRNA (
#
P
0,01). (B) Histopatologisk undersøkelse av SW480 svulstvev podet på nakne mus og behandlet med hTERT-shRNA. Svulstvev ble biopsied på 31 dager og farget med hematoksylin-eosin. Pilen i (a) indikerer ark nekrose; pilen i (b) indikerer inversjon av nukleoplasma til cytoplasma volum, sammen med mitotisk patologi. Forstørrelse, × 200. (C) RT-PCR-analyse for å måle hTERT mRNA uttrykk i svulstvev behandlet med saltvann (baner 1-8), NC-shRNA (kolonnene 9-16), eller hTERT-shRNA (sporene 17-24). M, 100 bp stige DNA. Den relative uttrykk for hTERT mRNA var betydelig lavere i hTERT-shRNA mus. *
P
0,05, sammenlignet med saltvann og NC-shRNA grupper. (D) Immunocytochemistry av hTERT-proteinet (farget brun) i tumorvevet behandlet med (a) saltløsning, (b) NC-shRNA, eller (c) hTERT-shRNA. Forstørrelse, × 200. Høyere gråtoner verdier indikerer lavere protein nivåer. Den relative uttrykk for hTERT protein var betydelig lavere i hTERT-shRNA mus. # P 0,01, sammenlignet med saltvann og NC-shRNA grupper. (E) Effekt av hTERT-shRNA på telomeraseaktivitet in vivo. Den justerte absorbans (450 nm – 630 nm) var betydelig lavere i svulster behandlet med hTERT-shRNA enn i tumorer behandlet med saltvannsoppløsning (*
P
0,05) eller NC-shRNA (
#
P
0,01). (F) Effekter av hTERT-shRNA på apoptose. Tumorer ble injisert regelmessig med (a) saltløsning, (b) NC-shRNA eller (c) hTERT-shRNA, deretter vevsprøve og farget med diaminobenzidin (brun); kjerner var kontra farget med hematoksylin (blå). Bildene er representative resultatene av tre uavhengige forsøk. Forstørrelse, × 200. Den apoptotiske indeks (AI) var signifikant høyere i svulster behandlet med hTERT-shRNA enn i tumorer behandlet med saltvannsoppløsning eller NC-shRNA.
#
P
. 0,01, sammenlignet med de to kontrollgruppene
hTERT-shRNA hemmer hTERT uttrykk og telomerase aktivitet
in vivo
Etter 31 dagers behandling med saltvann, NC-shRNA eller hTERT-shRNA, relative uttrykk for hTERT mRNA var betydelig lavere i hTERT-shRNA mus (0,388 ± 0,093) enn i saltvann (0,809 ± 0,335) eller
