Abstract
Emerging bevis tyder på at tumor-initiering celler (tics) er den mest ondartede cellepopulasjon i svulster på grunn av sin motstand mot cellegift eller strålebehandling. Målrette tics kan være en viktig innovasjon for kreftbehandling. I denne studien, har vi funnet at PPARy-agonister inhiberer kreft stamcelle-lignende fenotype og svekket tumorvekst av humant leverkreft (HCC) celler. Reaktive oksygenforbindelser (ROS) initiert av NOX2 oppregulering var delvis ansvarlig for hemmende effekter mediert av PPARy-agonister. Imidlertid PPARy-agonist-mediert ROS produksjon aktivert AKT, som i sin tur fremmet TIC overlevelse ved begrensende ROS generasjon betydelig. Hemming av AKT, ved enten farmakologiske inhibitorer eller AKT siRNA, betydelig forbedret PPARy-agonist-mediert inhibering av celleproliferasjon og stamcelle-lignende egenskaper i HCC celler. Viktigere, i nakne mus inokulert med HCC Huh7-celler, viste vi en synergistisk inhiberende effekt av PPARy agonist rosiglitazon og AKT-inhibitor triciribine på tumorvekst. I konklusjonen, observerte vi en negativ feedback loop mellom oksidativt stress og AKT hyperaktive i PPARy agonist-mediert undertrykkende effekter på HCCs. Combinatory anvendelse av en AKT inhibitor og en PPARy agonist kan gi en ny strategi for hemming av stamcelleliknende egenskaper i HCCs og behandling av leverkreft
Citation. Liu L, Yang Z, Xu Y, Li J Xu D, Zhang L, et al. (2013) Hemming av oksidativt stress-fremkalte AKT Activation Forenkler PPARy agonist-mediert hemming av stamcelle Character og Tumor Vekst av leverkreftceller. PLoS ONE åtte (8): e73038. doi: 10,1371 /journal.pone.0073038
Redaktør: Yin Tintut, University of California, Los Angeles, USA
mottatt: 6 april 2013; Godkjent: 16 juli 2013; Publisert: 30 august 2013
Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av kinesiske National Key Project (2013ZX10002-011). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er rangert som den femte vanligste kreftformen i verden. Imidlertid har HCC en høy grad av kjemoterapi-motstand og en høy forekomst av tilbakefall og metastasering etter kirurgisk behandling, noe som gjør det til det tredje ledende årsaken til dødelighet kreft [1], [2]. Flere studier har vist at HCC kan stamme fra en subpopulasjon av stilk-lignende celler, kalt tumor-initiering celler (tics) eller kreft stamceller som er kjennetegnet ved ekspresjon av spesifikke overflatemarkører og display selvfornyelse, differensiering, startfasen og resistens [3] – [10]. Selv om stoffet sorafenib er nylig blitt godkjent for HCC behandling, har begrensede overlevelses fordeler for pasienter med sent stadium HCC og ingen sterk effekt på tumormetastase vist [11], [12]. Derfor kan alternative behandlingsformer for å eliminere eller begrense en undergruppe av tics være en effektiv strategi for HCC behandling.
peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor γ (PPARy) er en ligand-avhengig transkripsjonsfaktor som hører til kjernefysiske hormon receptor superfamily. Agonistene for aktiveringen av PPARy omfatter endogene lipofile ligander, slik som 15-deoksy-Δ
12,14-prostaglandin J
2 (15d-PGJ
2) og fettsyrer, så vel som det syntetiske tiazolidindioner (en klasse av antidiabetiske legemidler), inkludert rosiglitazon, troglitazone, ciglitazon, pioglitazon og englitazone [13]. Ligandaktivering av denne transkripsjonsfaktor fører til ekspresjon av målgener for å kontrollere mange viktige fysiologiske prosesser, slik som metabolisme, celledifferensiering, apoptose og inflammasjon vev [14]. PPARy-agonister er også blitt vist å arrestere celleproliferasjon, indusere apoptose, redusere celleadhesjon og migrering, og fremmer differensiering av kreftceller av forskjellig opprinnelse [15] – [22]. PPARy blokker karsinogenese og invasive og metastatiske potensial i HCC [23], [24], noe som indikerer at anvendelsen av PPARy agonister kan være et terapeutisk prospekt for HCC behandling. Interessant nok har PPARy-agonister nylig blitt implisert i å drive ET-743-mediert differensiering av myxoid rund celle liposarkom [15] og inhiberingen av tics i kreft i hjernen [25].
I denne studien viste vi at PPARy agonister (15d-PGJ
2 eller rosiglitazon) effektivt hemmet stamcellelignende egenskaper i menneskelige leveren kreftceller, og at NADPH oksidase-2 (NOX2) indusert reaktive oksygenforbindelser (ROS) generasjon fungert som en viktig nedstrøms hendelse. Som en negativ tilbakemelding svar, økt ROS fremkalte hyperaktive av AKT, som i betydelig grad motvirket PPARy agonist-mediert hemming av stamcelleliknende egenskaper i HCC celler.
In vivo
eksperimenter viste videre at forstyrrelse av negativ feedback loop av AKT inhibitor triciribine betydelig lettet PPARy agonist rosiglitazon-mediert hemming av tumorvekst. Disse funnene tyder på at kombinasjonen av en AKT inhibitor og en PPARy agonist kan gi en lovende potensiell behandling for leverkreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyr eksperimentell protokoller ble godkjent av Medical Experimental Animal Care komité Shanghai Cancer Institute (Godkjenning ID. ShCI-11-020).
Cell Kultur
SK-Hep1 og Hep3B cellelinjer ble hentet fra amerikansk Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Huh7 cellelinje var fra Riken Cell Bank (Tsukuba Science City, Japan). SMMC 7721 cellelinjen ble gitt av Institutt for patologi av Second Military Medical University (Shanghai, Kina) [26]. Alle cellelinjer ble dyrket i DMEM med høy glukose (GIBCO, Grand Island, NY) supplert med 10% føtalt bovint serum (GIBCO) og penicillin /streptomycin (1% [volum /volum]; GIBCO) ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. Etter at cellene ble først dyrket, flere aliquoter ble oppbevart og alle cellelinjer ble brukt i løpet av 6 måneder etter gjenoppliving.
For behandlings eksperimentene ble cellene sådd ut og dyrket over natten, ble mediet deretter erstattet med høy-glucose DMEM medium inneholdende 1% føtalt bovint serum, og inkubert med 15d-PGJ
2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), rosiglitazon (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), N-acetylatedcysteine (NAC) (Calbiochem, Darmstadt, Tyskland), triciribine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), og /eller LY294002 (Sigma-Aldrich), i de angitte tidsrom. Alle forsøk ble utført tre ganger.
fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyse
Etter inkubering i henhold angitte dyrkningsbetingelser, ble cellene dissosiert og vasket to ganger med PBS inneholdende 0,5% BSA ved 4 ° C. PE-konjugert anti-humant CD133 antistoff (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) ble tilsatt for inkubasjon ved 4 ° C i 30 minutter. Flowcytometri ble utført på FACSCalibur flowcytometeret (BD Biosciences, San Jose, California). Rotte IgG1 /κ antistoff konjugert til Phycoerythrin fungerte som en isotype kontroll. Døde celler ble utelukket ved farging med 7-AAD (Sigma-Aldrich) før analyse. For celle sortering, CD133
+ eller GFP
+ celler ble strengt inngjerdet og isolert ved hjelp av en MoFlo XDP (Beckman Coulter, Fullerton, CA).
celleviabilitet analysen
Cell Levedyktigheten ble bestemt ved 3- (4,5-dimetyl-2-tiazolyl) -2,5- difenyl-2H-tetrazolium-bromid (MTT) (Sigma-Aldrich) -metoden. I korte trekk, en total på 1000 celler /brønn ble sådd ut i 96-brønns plate i et sluttvolum på 200 ul. Etter inkubasjon med 15d-PGJ
2 i de angitte tidsrom, ble 20 ul MTT-løsning (5 mg /ml i PBS) tilsatt til mediet og dyrket i ytterligere 3 timer. Deretter ble MTT oppløsningen kastet og 150 ul dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma-Aldrich) ble tilsatt i hver brønn. Absorpsjonsevnen for hver brønn ble målt ved en bølgelengde på 540 nm.
Apoptose-analysen
Graden av apoptose ble evaluert ved Pharmingen ™ FITC Annexin V Apoptose Detection Kit (BD Biosciences) ifølge gitt produsentens anvisninger. Deretter ble fluorescens-aktivert cellesortering analyse utført på den FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences). Enkelfarging ved hjelp av Annexin V-FITC eller 7-AAD alene ble utført som kontroller.
BrdU-analysen
Pharmingen ™ APC BrdU Flow Kit (BD Biosciences) ble anvendt for bromdeoksyuridin (BrdU) inkorporering assay i henhold til produsentens instruksjoner.
RNA Utvinning og real-time PCR
Total RNA ble isolert fra celler med RNAiso Reagens (Takara, Dalian, Kina). Revers transkripsjon (RT) ble utført ved anvendelse av 500 ng av total RNA for cDNA-syntese i et 10 ul reaksjonsvolum, ved hjelp av PrimeScript ™ RT reagenssett (Takara) i henhold til produsentens instruksjoner. Bruke Premix Ex Taq ™ (Takara), ble kvantitativ PCR utført for
Nanog
,
OCT4
, og
AFP
. For påvisning av
Notch1
,
SMO
,
NOX2, NOX4, P22
phox, P47
phox, P67
phox Hotell og
Rac
uttrykk, kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av SYBR grønn mix fra Takara på en 7300 real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, California).
GAPDH
ble brukt som en intern kontroll. Primerne er oppført i tabell S1.
Små interfering RNA (siRNA) Transfeksjon
sirnas bestemt til
NOX2
,
PPARy
,
akt1 Hotell og
akt2
ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. SiRNA sekvenser er oppført i tabell S2. En dag før transfeksjon ble cellene sådd ut i seks-brønns plater uten antibiotika. De sirnas (60 nm) ble transfektert inn i celler med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carisbad, CA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Western blotting analyse
Celler ble lysert i en RIPA lysebuffer ( Beyotime, Nantong, Kina) som inneholder proteasehemmer Cocktail og PhosSTOP fosfatase inhibitor (Roche, Monza, IT). Proteiner ble analysert ved hjelp av angitte antistoffer: anti-CD133, anti-PPARy, anti-AKT, anti-fosfor-AKT (Ser473) (alle fra Cell Signaling Technology, Beverly, MA); anti-GAPDH, anti-α-tubulin (alt fra Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); og anti-NOX2 (Abcam, Cambridge, UK). Den ChemiDoc ™ XRS system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ble brukt for å få bilder.
spheroid dannende analysen
Enkeltceller ble sådd på ultralave vedlegg kultur retter (Costar , Coring, New York) ved en tetthet på 500 celler /ml i et serumfritt DMEM 01:01: F12 (Gibco), supplert med B27 (01:50; GIBCO), 20 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF) og 20 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) (R 0,05; **
P
0,01, versus kontrollceller. B, Huh7-celler ble behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ
2 i de angitte tidsrom og farget med CD133-PE. Før analyse ble 7-AAD benyttes for å ekskludere døde celler. Representative FACS profiler blir vist (venstre panel). Prosentvise CD133
+ celler er vist som et middel verdier ± S.E.M. (n = 3) (høyre panel). *,
P
0,05; **
P
0,01. C, Huh7-celler ble behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ
2 til 24 timer, og totalt protein ble ekstrahert for analyse av CD133 uttrykk. Alle prøver ble normalisert til GAPDH uttrykk. D, Huh7-celler ble behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ
2 i 24 timer. Cellene ble høstet for BrdU-inkorporering og CD133 farging. Kvantitative stolpediagrammer som er presentert som middel verdier ± S.E.M. (n = 3). *,
P
0,05; **
P
0,01; ***,
P
0,001, versus kontrollceller. E, Huh7-celler ble dyrket i sfæroide dannende medium innehold 15d-PGJ
2 (1 pg /ml) i 7 dager. Representative mikroskopiske bilder vises (venstre panel). Scale bar = 100 mikrometer. Kvantitative søylediagram er vist som gjennomsnitt ± SEM (N = 3) (høyre panel). *,
P
. 0,05
For å underbygge våre observasjoner med
in vivo
eksperimenter, vi behandlet mus med GFP
+ Huh7 svulster med en PPARy agonist. Fordi den biologiske aktivitet av 15d-PGJ
2 er vanligvis begrenset
in vivo product: [30], [31], rosiglitazon, en syntetisk PPARy-agonist, ble anvendt i
in vivo eksperimenter
ved en dose på 100 mg /kg /dag (i behandlingsskjemaet vist i figur 2A). En antitumor vekst effekten av rosiglitazon ble observert (figur 2B). Tumorvekst ble hemmet med ca 60% (
P
0,001). Vi vurderte den sfæroide dannende potensial på tumorceller avledet fra kontroll og rosiglitazon-behandlede mus ytterligere. Bemerkelsesverdig, GFP
+ tumorceller isolert fra primære svulster i rosiglitazon-behandlede mus som dannes mindre og mindre kuler enn de fra kontrollgruppen (figur 2C). Administrering av 100 mg /kg /dag rosiglitazon også betydelig redusert andel av GFP
+ CD133
+ tumorceller (figur 2D). Disse resultatene tyder på en fremtredende hemmende effekt av PPARy agonist på tumorvekst og stamcellelignende egenskaper HCC Huh7 celler
in vivo
.
GFP
+ Huh7 celler (2 × 10
6) var sc inokulert i nakne mus. Etter 4 dager ble mus med svulster behandlet daglig med bærer eller rosiglitazon (100 mg /kg /dag) ved å ig i 12 dager (n = 7 per gruppe). A, Skjematisk skisse av det eksperimentelle oppsettet. B, blir originalbilder av xenografttumorer vist (venstre panel). Tumorvekt ble målt ved slutten av behandlingen (høyre panel). Hvert punkt representerer vekten av en person xenograft tumor. Horisontale stenger representerer gjennomsnitt ± SD (n = 7). ***,
P
0,001. C, tumorvev fra kontroll og behandlede grupper ble enzymatisk dissosiert til enkeltcellesuspensjoner og GFP
+ tumorceller ble høstet ved strømning sortering og dyrket i sfæroide dannende medium i 7 dager. En representant bilde vises (venstre panel). Scale bar = 100 mikrometer. Et sammendrag søylediagram (gjennomsnitt ± SD) vises i panelet til høyre. *,
P
0,05. D, De dissosierte enkeltkreftceller fra hver mus ble farget med CD133-PE. Prosentandelen av GFP
+ CD133
+ celler ble bestemt ved flow-cytometri. Representant flowcytometri analyse profiler blir vist (venstre panel). Andelen av CD133
+ -celler i GFP
+ tumorceller er presentert som gjennomsnitt ± (høyre panel) SD. ***,
P
. 0,001
PPARy agonister hemme kreft stamcelleliknende fenotyper via NOX2 avhengig ROS Generation
Det har blitt rapportert at PPARy-agonister indusere ROS-produksjon i flere typer kreftceller [32], [33]. Ettersom reguleringen av celledifferensiering er blitt observert til å være en kritisk funksjon av ROS [34], [35], undersøkte vi muligheten for at ROS-produksjon bidro til PPARy agonist-indusert undertrykkelse av stamcelle-lignende egenskaper i HCC celler. Vi testet først ROS-nivåer i HCC celler etter eksponering for 15d-PGJ
2. Resultatene viste at nivåene av intracellulær ROS ble dramatisk økt både i Huh7 og SK-Hep1-celler etter behandling med 15d-PGJ
2 i 72 timer (Figur S2A). Vi har videre isolerte CD133
+ subpopulasjoner fra Huh7 celler ved FACS sortering og dyrket dem i nærvær eller fravær av 15d-PGJ
2 og antioksidanten NAC, en forløper for intracellulær glutation som hemmer produksjon ROS. Etter 3 dager i kultur, ble prosentandelen av CD133
+ celler i kontrollcellene redusert til 74,84%, mens 15d-PGJ
2 behandling forårsaket signifikant større reduksjon i andelen av CD133
+ -celler i en doseavhengig måte (figur 3A). Påfallende, hyppigheten av CD133
+ celler ble redusert til 20,39% når konsentrasjonen av 15d-PGJ
2 var 1,0 ug /ml. Men NAC behandling robust dempes dette 15d-PGJ
2-mediert hemming og bevart CD133
+ rommet (figur 3A). I samsvar med denne observasjonen, den hemmende effekten av 15d-PGJ
2 på sfæroide dannelsen ble dramatisk redusert når Huh7-celler ble forbehandlet med NAC (figur S2B). Videre NAC også dempet nedgangen i uttrykket av stemness relaterte gener i både Huh7 og SK-Hep1 celler (Figur S2C). Disse observasjonene tyder på at PPARy agonister hemmet kreft stamcelleliknende fenotyper gjennom positiv regulering av ROS produksjon. I tillegg uttømming av PPARy av siRNA hadde bare subtile effekter på ROS generasjon indusert av 15d-PGJ
2 (figur S3), noe som indikerer at PPARy behandlingsresultater i ROS induksjon hovedsakelig gjennom en PPARy uavhengig veien.
A, Isolated CD133
+ Huh7-celler ble behandlet med 15d-PGJ
2 (0,5, 0,75 eller 1,0 ug /ml) og NAC (10 mM), enten alene eller i kombinasjon, og prosentandelen av CD133
+ -celler ble detektert ved strømningscytometri etter 72 timer. B, Huh7-celler ble behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ
2 i de angitte tidsrom. Uttrykket av mRNA av NADPH oksidase gener (
NOX2 Hotell og
NOX4
) ble målt ved kvantitativ RT-PCR. Dataene er midler ± SEM (N = 3). ***,
P
0,001. C, Huh7-celler ble behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ
2 til 24 timer. Uttrykket
P22
phox, P47
phox, P67
phox Hotell og
Rac
mRNA ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR. *,
P
0,05; **
P
0,01. D, Huh7 og SK-Hep1-celler ble behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ
2 i de angitte tidsrom, og totalt protein ble ekstrahert for analyse av NOX2 uttrykk. E, Huh7-celler ble transient transfektert med negativ kontroll siRNA eller NOX2 siRNA-3, hvoretter cellene ble sådd ut på ultralave feste kulturskåler og dyrket i sfæroide dannende medium innehold 15d-PGJ
2 i 7 dager. Antall sfæroider som dannes er vist som gjennomsnitt ± S.E.M. (N = 3). *,
P
0,05. F, Huh7 celler ble transient transfektert med negativ kontroll siRNA eller NOX2 siRNA-1. Celler ble behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ
2 i 72 timer og farget med CD133-PE. Dataene er midler ± SEM (N = 3). *,
P
0,05; **
P
. 0,01
NADPH oksidase (NOX) familie av proteiner er ansvarlig for ROS produksjon [36]. For å avgjøre om NADPH oksidase er oppregulert og contributable til økt ROS generasjon ved stimulering av PPARy-agonister, analyserte vi overflod av ulike
NOX
mRNA, inkludert
NOX2 Hotell og
NOX4
, i celler behandlet med 15d-PGJ
2. Uttrykket av
NOX2 Hotell og
NOX4
straks ble oppregulert, som starter ca 3 timer etter behandling med 15d-PGJ
2 (figur 3B). Videre fant vi at transfeksjon av siRNAs spesifikk for
NOX4
svekket ikke 15d-PGJ
2-indusert ROS generasjon (data ikke vist), mens mRNA nivåene av flere store NOX2 komponenter, for eksempel
P22
,
P47
,
P67 Hotell og
Rac
, ble betydelig økt i 15d-PGJ
2-behandlede Huh7 celler (figur 3C) . I tillegg proteinnivået av NOX2 ble spesielt forhøyet i begge Huh7 og SK-Hep1-celler etter behandling med 15d-PGJ
2 (figur 3D). Vi ytterligere utarmet NOX2 uttrykk med bestemte sirnas i begge Huh7 og SK-Hep1 celler, og fant at NOX2-utarmet celler utviste en svakere induksjon av ROS i respons til 15d-PGJ
2-behandling, sammenlignet med celler transfektert med kontroll siRNA (figur S4A). Effektiviteten av
NOX2
sirnas ved inhibering av NOX2 ekspresjon ble bekreftet ved Western blotting og kvantitativ RT-PCR-analyse (figur S4B og C). Faktisk, nedregulering av NOX2 betydelig motvirket 15d-PGJ
2-mediert hemming av celleklump dannelse og basseng størrelsen på CD133
+ undergruppe i Huh7 celler (Figur 3E og F). Sammen utgjør disse resultatene indikerer at oppregulering av NOX2 var ansvarlig for PPARy agonist-mediert hemming av stamcelleliknende egenskaper i HCC celler.
Gjensidig regulering av ROS Generation og AKT Activation i PPARy agonist-behandlede HCC Cells
Neste, vi utforsket mulige endringer i signalveier som regulerer effekten mediert av PPARy agonister. Forbløffende nok fant vi at både 15d-PGJ
2 og rosiglitazon dramatisk forbedret fosforylering av AKT, og dette PPARy agonist-indusert aktivering av AKT ble svekket av NAC i Huh7 celler (figur 4A). Et lignende fenomen også forekommet i SK-Hep1-celler (data ikke vist). Disse dataene indikerer at PPARy agonist-indusert ROS forårsaket AKT hyperaktive. For å undersøke potensialet forholdet mellom AKT aktivering og ROS produksjon, brukte vi AKT inhibitor triciribine og PI3K inhibitor LY294002 å undertrykke AKT aktivitet, og vi fant ut at en dose eller tidsavhengig undertrykkelse av AKT fosforylering Parallelt med en gradvis inkrementell endring i NOX2 uttrykket (figur 4B og C). Videre kombinatorisk behandling av Huh7-celler med både 15d-PGJ
2 og triciribine førte til et høyere nivå av intracellulær ROS enn hver behandling alene (figur 4D). Denne synergistiske effekt ble også observert i celler ko-behandlet med 15d-PGJ
2 og LY294002 (figur 4E). Vi ytterligere bekreftet våre observasjoner med bestemte sirnas mot akt1 og akt2. SiRNA mot akt1 ytterligere øket ROS induksjon i nærvær av 15d-PGJ
2 (figur 4F). Effektiviteten av akt1 og akt2 sirnas ved å hemme totalt og fosforylert AKT uttrykk ble validert ved Western blotting-analyse (figur 4F). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at PPARy agonist-indusert AKT aktivering modulert NOX2-mediert ROS generasjon gjennom negative tilbakemeldinger.
A, Huh7 celler ble forbehandlet med NAC (10 mm) i 30 min, etterfulgt av 15d-PGJ
2 (0,5 mikrogram /ml) for ytterligere indikert ganger (øverste panel). Huh7-celler ble behandlet med rosiglitazon (5, 20 eller 50 uM) og NAC (10 mM), enten alene eller i kombinasjon i 6 timer (nederste panel). Totalt protein ble ekstrahert for analyse av P-AKT, AKT, og GAPDH uttrykk. B, Huh7-celler ble behandlet med en AKT-inhibitor triciribine i 3 timer, og totalt protein ble ekstrahert for analyse av NOX2, P-AKT, AKT, og GAPDH uttrykk. C, Huh7-celler ble behandlet med LY294002 (10 uM) i de angitte tidsrom, og proteinnivået av NOX2 ble undersøkt ved Western blotting-analyse. D, Huh7-celler ble behandlet med 15d-PGJ
2 og triciribine enten alene eller i kombinasjon i 48 timer, hvoretter de ble merket med DHE og analysert ved strømningscytometri. Dataene er midler ± SEM (N = 3). *,
P
0,05; **
P
0,01. E, Huh7-celler ble behandlet med 15d-PGJ
2 og LY294002, enten alene eller i kombinasjon i 72 timer, hvoretter de ble merket med DHE og analysert ved strømningscytometri. Dataene er midler ± SEM (N = 3). *,
P
0,05; **
P
0,01. F, Huh7-celler ble transient transfektert med akt1 siRNA og akt2 siRNA, enten alene eller i kombinasjon, hvoretter cellene ble behandlet med 0,5 ug /ml 15d-PGJ
2 i ytterligere 3 timer (venstre panel). Nivåene av P-AKT og AKT proteiner ble målt ved Western blotting-analyse. Huh7 celler ble transient transfektert med negativ kontroll siRNA eller akt1 siRNA, etter hvilke celler ble behandlet med 0,5 mg /ml 15d-PGJ 2 i ytterligere 72 timer (høyre panel)
. Intracellulær ROS-produksjon ble analysert ved flow-cytometri (betyr verdier ± S.E.M., n = 3). *,
P
. 0,05
Den AKT Inhibitor Triciribine Samarbeider med PPARy agonister å hemme kreft Stem Cell-lignende fenotyper og tumorvekst
De nevnte resultater bedt oss å spekulere i at den kombinerte behandlingen av en PPARy agonist og en AKT inhibitor kan hemme tumorvekst mer effektivt enn enten reagens alene. Vi evaluerte først hvorvidt triciribine øket følsomheten av HCC celler til PPARy agonist-indusert apoptose. Faktisk, i begge Huh7 og SK-Hep1 celler, er kombinasjonen av triciribine med 15d-PGJ
2 eller rosiglitazon markert forbedret induksjon av apoptose sammenlignet med enten alene (figur 5A). Interessant, fant vi at kombinasjonsbehandling av Huh7 celler med både 15d-PGJ
2 og triciribine ikke føre til en ytterligere nedgang i andelen CD133
+ celler sammenlignet med behandling av 15d-PGJ
2 alene. Imidlertid kombinasjonsbehandlingen var mer effektiv ved inhibering av celleproliferasjon i Huh7-celler, sammenlignet med behandling av hver individuelle middel alene (figur 5B), noe som indikerer at kombinasjonsbehandling reduserer videre det absolutte antall CD133
+ Huh7 celler. I cellene behandlet med både 15d-PGJ
2 og triciribine, fant vi at antall CD133
+ celler ble redusert med 70,9%, noe som var høyere enn 46,1% i 15d-PGJ
2 behandlede celler (figur 5C). Tilsvarende ble antall CD133
+ celler redusert med 89,6% med kombinasjonsbehandling av rosiglitazon og triciribine, høyere enn 37,5% med rosiglitazon behandling alene (figur 5C). I tillegg kombinasjonsbehandling trykkes spheroid dannelsen av Huh7 cellene mer vesentlig enn både 15d-PGJ
2 eller AKT-hemmer alene (figur 5D). Disse data indikerer at AKT inhibering av triciribine kan ha forverret de inhiberende virkninger av PPARy agonister på befolkningen av CD133
+ -celler ved direkte indusere celledød.
A, Huh7 og SK-Hep1 celler ble behandlet med 15d-PGJ
2, rosiglitazon og triciribine enten alene eller i kombinasjon. Prosentandelen av apoptotiske celler ble evaluert 48 timer senere av Annexin V-FITC /7-AAD farging. Dataene er midler ± SEM (N = 3). *,
P
0,05; **
P
0,01; ***,
P
0,001. B, Huh7-celler ble behandlet med 15d-PGJ
2 og triciribine enten alene eller i kombinasjon. Prosentandelene av CD133
+ celler og BrdU positive celler ble analysert 48 timer senere. (N = 3). ***,
P
0,001. (N = 3). *,
P
0,05; **
P
0,01. Scale bar = 100 mikrometer. *,
P
0,05. Dataene er gjennomsnitt ± SD. *,
P
0,05; **
P
0,01. (N = 3). *,
P
0,05; Scale bar = 100 mikrometer. *,
P
0,05; *,
P
0,05; **
P
0,01.
