Abstract
Gene
tilhører MAGEA1
til en gruppe mennesker germline-spesifikke gener som er avhengige av DNA metylering for undertrykkelse i somatiske vev. Mange av disse genene, betegnet kreft-kimlinje (CG) gener, blir demetylert og aktivert i en lang rekke svulster, hvor de koder for tumor-spesifikke antigener. Prosessen som fører til DNA demetylering av CG gener i tumorer er fortsatt uklart. Tidligere data antydet at histone acetylering kan være involvert. Her undersøkte vi den relative bidraget av DNA metylering og histon acetylering i epigenetisk regulering av gen
MAGEA1
. Vi viser at
MAGEA1
DNA hypometylering uttrykke melanomceller er faktisk korrelert med lokale økninger i histon H3 acetylering (H3ac). Imidlertid, når
MAGEA1
-negative cellene ble utsatt for en histondeacetylase-inhibitor (TSA), observerte vi bare kortvarig aktivering av genet og detekteres ikke demetylering av dets promoter. Som en mer sensitiv analyse, benyttet vi en celleklon huse et metylert
MAGEA1 /hph
konstruere, som gir resistens til hygromycin ved stabil re-aktivering. TSA indusert bare forbigående de-undertrykkelse av transgenet, og førte ikke til fremveksten av hygromycin-resistente celler. I slående kontrast, forbigående reduksjon av DNA-metyltransferase-en i reporter celleklon ga opphav til en hygromycin-resistente befolkningen, der re-aktivert
MAGEA1 /HPH
transgen vises ikke bare merket DNA hypometylering, men også betydelig reversering av histone merkene, inkludert gevinster i H3ac og H3K4me2, og tap av H3K9me2. Samlet våre resultater viser at DNA metylering har en dominerende rolle i epigenetisk hierarkiet styrende
MAGEA1
uttrykk
Citation. Cannuyer J, Loriot A, Parvizi GK, De Smet C (2013) epigenetiske hierarki i
MAGEA1
Cancer-kimcellelinje Gene: Arrangøren DNA Metylering tilsier Lokal histonmodifikasjonene. PLoS ONE 8 (3): e58743. doi: 10,1371 /journal.pone.0058743
Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, Kina
mottatt: 30 november 2012; Godkjent: 05.02.2013; Publisert: 05.03.2013
Copyright: © 2013 Cannuyer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. JC er mottakeren av en FSR-FNRS-Télévie stipend (https://www2.frs-fnrs.be/). GKP mottatt et fellesskap fra FSR-FNRS-FRIA (https://www2.frs-fnrs.be/). Dette arbeidet ble støttet av en FRSM stipend fra FSR-FNRS (ref. 3.4563.11, https://www2.frs-fnrs.be/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
DNA metylering, som forekommer for det meste ved CpG-dinukleotider, er en potent mekanisme av genet undertrykkelse i pattedyrceller [1]. Vevsspesifikke mønstre av CpG metylering, som er etablert i løpet av embryo utvikling, er generelt godt bevart i voksne celler, men blir fundamentalt endret i kreftceller [2]. Begge gevinster (hypermethylation) og tap (hypometylering) av DNA metylering kan oppdages innenfor samme tumorcelle. Aberrant hypermethylation i kreft ofte påvirker promoter av tumor-suppressor-gener, og er derfor forbundet med tap av tumorundertrykkende funksjoner [3]. DNA hypometylering, på den annen side, har blitt oppdaget på en rekke forskjellige sekvenser innenfor genomet kreft, inkludert repetitive sekvenser [4], og ble vist å bidra til forbedring av genomiske ustabilitet [5]. Overraskende har DNA hypometylering i tumorer vært forbundet med transkripsjonelle aktivering av bare et begrenset antall gener, hvorav de fleste har sitt normale område av ekspresjon begrenset til kjønnsceller [6]. Denne spesielle gruppen av gener ble betegnet kreftfrem kimcellelinje (CG) gener [7]. Hos menneske CG gener omfatter omtrent 50 gener eller genfamilier utøver en rekke forskjellige cellefunksjoner [8]. Aktivering av disse genene har blitt rapportert hos et bredt spekter av tumortyper, inkludert lungekreft, hode- og halskreft, blærekreft, og melanom. En viktig konsekvens av aktiveringen av CG gener i tumorer er produksjon av tumor-spesifikke antigener, som kan gjenkjennes av cytolytiske T-lymfocytter [9]. Kliniske studier av anti-kreft vaksinasjon rettet mot slike antigener er i gang [10]. Muligens forstå mekanismene som bidrar til CG genregulering kan tilrettelegge for utvikling av gen-induksjon strategier, noe som ville gjengi kreftceller mer utsatt for immunterapi.
Prosessen fører til DNA hypometylering og påfølgende aktivering av CG gener i tumorer fortsatt uklart [11]. En mulighet er at DNA-demetylering ved CG-gener er en konsekvens av endringer på nivå av histon proteiner, de viktigste komponentene i kromatin. Spesifikke rester innenfor histone haler gjennomgå en rekke kjemiske endringer, inkludert acetylering og metylering, som har en innvirkning på kromatinstruktur og transkripsjon [12]. Flere histonmodifikasjonene synes også å regulere DNA metylering tilstander [13]. Undertrykkende histone merker, for eksempel metylering av histon H3 lysin 9 eller 27 (H3K9 eller H3K27), ble vist å diktere deponering av DNA metylering ved bestemte loci, ved å favorisere lokal rekruttering av DNA metyltransferaser [14], [15]. På den annen side, aktive histonmodifikasjonene som histon-acetylering eller metylering av histon H3 lysin 4 (H3K4) synes å utelukke DNA-metylering maskineri [16], [17]. Derfor var det fristende å foreslå at DNA demetylering på CG gener kan være en konsekvens av endringer på nivået av histonmodifikasjonene.
Tidligere studier viser at CG gen arrangører er ofte forbundet med H3K9 og H3K27 metylering i ikke- uttrykke celler. Disse undertrykkende modifikasjoner er vanligvis tapt ved aktivering av CG gener i tumorceller, og erstattes av aktive histon merker, slik som histon acetylering og H3K4 metylering [18], [19]. Et viktig spørsmål er om endringer på nivå av histonmodifikasjonene er en årsak eller en konsekvens av CG-genpromoteren DNA-demetylering i tumorceller. Studier med hemmere av H3K9 og H3K27 metyltransferaser viste at disse var på egen hånd klarer å indusere betydelig DNA demetylering og aktivering av CG gener [18], [19]. Lignende resultater ble oppnådd følgende inhibering av H3K4 demethylases [19]. I motsetning til dette, en rekke studier har rapportert at CG-genekspresjon kan bli indusert i celler behandlet med en inhibitor av histon deacetylases [20] – [22]. I en rapport [20], men ikke i de andre, var behandling er vist å indusere DNA-demetylering av en CG genpromoter. Disse observasjonene hevet derfor muligheten for at gevinster i histone acetylering kan være en tilstrekkelig trigger til å indusere DNA demetylering og aktivering av CG gener i kreftceller.
I denne studien, vurderte vi potensialet for histone acetylering å indusere DNA demetylering og aktivering av genet
MAGEA1
, en godt karakterisert medlem av CG gruppe av gener. Dette ble vurdert ved å teste effekten av trichostatin A (TSA), et histon deacetylase-inhibitor, hos ikke-uttrykkende melanomceller og i en celle klon huse et metylert
MAGEA1 /hph
konstruere, som tillater seleksjon (hygromycin resistens ) av celler, hvor aktivisering av transgenet oppstod. I tillegg ble dette sensitive reporter cellesystem som brukes i en omvendt eksperiment, der vi evaluert muligheten for en hemmer av DNA metylering å indusere endringer av histon merkene i
MAGEA1
promoter.
resultater
histone endringer knyttet til
MAGEA1
aktivering i melanomcellelinjer
for å identifisere histone modifisering endringer knyttet til
MAGEA1
aktivering, gjennomførte vi kromatin immunoutfellingsstudier (chip) eksperimenter i ikke-uttrykke og uttrykker cellelinjer. Eksperimenter ble utført på immortalisert human forhud fibroblaster (HFF2-hTERT) og to melanomcellelinjer som ikke uttrykker
MAGEA1 plakater (SK-MEL-23 og EB16-MEL), så vel som på tre melanom cellelinjer som uttrykker
MAGEA1 plakater (MZ2-MEL3.1, BB74-MEL og Mi13443-MEL). Som forventet, evaluering av
MAGEA1
promoter DNA metylering nivåer ved kvantitativ MS-PCR i disse cellelinjer, demonstrerte høye metylering nivåer i ikke-uttrykke celler, og lav metylering i å uttrykke celler (Fig. 1a). Chip eksperimenter, undersøke
MAGEA1
5′-regionen, avslørte fortrinnsrett berikelse av dimethylated H3K9 (H3K9me2) i
MAGEA1
-negativ versus
MAGEA1
-positive cellelinjer (Fig . 1B). I slående kontrast, acetylering av histon H3 (H3ac) og dimetylering av H3K4 (H3K4me2) i
MAGEA1
5′-regionen viste en markant økning i de tre uttrykker cellelinjer, sammenlignet med ikke-uttrykke celler (fig. 1B). Betydelig anrikning av trimetylert H3K27 (H3K27me3) i
MAGEA1
5′-regionen ble observert i HFF2-hTERT celler, men ikke i noen av de andre cellelinjer. Sammen våre resultater antydet at DNA demetylering og aktivering av
MAGEA1
i melanomceller er forbundet med tap av H3K9me2, og gevinster H3ac og H3K4me2 i 5′-regionen av genet. Dette var i tråd med en potensiell rolle histone acetylering i epigenetisk aktivering av
MAGEA1
i tumorceller.
En
,
MAGEA1
mRNA uttrykk nivåer (øvre panel) og 5′-region DNA-metylering nivåer (nedre panel) ble undersøkt i tre ikke-uttrykkende cellelinjer (HFF2-hTERT, SK-MEL-23 og EB16-MEL), så vel som i tre uttrykkende cellelinjer (MZ2 -MEL3.1, BB74-MEL og Mi13443-MEL). Verdier representerer gjennomsnitt (± SEM) fra to uavhengige QRT-PCR eller qms-PCR eksperimenter, hver i duplikat.
B
Chip-kvantitativ PCR ble brukt til de samme cellelinjer for å vurdere berikelse av de angitte histonmodifikasjonene innenfor enten
MAGEA1
5′-regionen eller
GAPDH
promoter (som representerer en overalt aktiv pådriver). Data stammer fra minst to uavhengige Chip eksperimenter, med to like qPCR tiltak i hvert enkelt tilfelle.
TSA induserer forbigående aktivering av
MAGEA1
i melanomceller
I for å evaluere bidraget av histon acetylering i epigenetisk regulering av
MAGEA1
, eksponert vi SK-MEL-23 og EB16-MEL-cellelinjer til histon-deacetylase (HDAC) inhibitor TSA, og undersøkt dens effekt på transkripsjon og DNA-metylering nivåer av genet. I SK-MEL-23-celler ble eksponert for TSA forbundet med en 3,3 ganger økning i
MAGEA1
mRNA-nivå, da vurderes en dag etter behandlingen. Men denne effekten var tapt på dager 4 og 7 etter behandling (Fig. 2A). I EB16-MEL, var vi ikke i stand til å oppdage noen betydelig aktivering av
MAGEA1
etter TSA (Fig. 2A), som var i samsvar med tidligere data som viser at effekten av TSA på
MAGEA1
aktivering er celletype avhengig [22]. For sammenligning ble begge cellelinjer behandlet med DNA-metylering inhibitoren 5-aza-2′-deoksycytidin (5-azadC). Fordi dette stoffet induserer replika-avhengig DNA-demetylering, ble behandlingen opprettholdt i løpet av fire dager før analyse. Kvantitative RT-PCR eksperimenter viste at 5-azadC (1 mm) induserte betydelig
MAGEA1
uttrykk i begge cellelinjer. I SK-MEL-23-celler, observerte nivå av
MAGEA1
mRNA etter 4 dager med 5-azadC behandling var 135 ganger høyere enn det som ble observert etter en dag med TSA behandling. Videre, i begge cellelinjer, 5-azadC-indusert aktivering av
MAGEA1
ble fortsatt registrert på dag 3 og 6 etter fjerning av stoffet (Fig. 2B).
SK-MEL -23 og EB16-MEL cellelinjer ble utsatt for enten 300 nM TSA under 24 timer (
A
), eller 1fiM 5-azadC under 96h (
B
), og RNA ble ekstrahert fra cellene på dag 1, 4 og 7 etter TSA behandling eller på dager 4, 7, 10 etter 5-azadC behandling.
MAGEA1
uttrykk nivåer ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Verdier, som stammer fra tre uavhengige forsøk, ble normalisert ved
ACTINB
uttrykk nivå, og er uttrykt i forhold til nivåene funnet i ikke-behandlede celler (Ctrl). *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001.
C
, Effekten av TSA og 5-azadC på
MAGEA1
5′-regionen DNA demetylering ble vurdert ved å bruke MS-PCR til DNA-prøver hentet 10 dager etter begynnelsen av behandlingene. Data (fold demetylering) tilsvarer den relative mengde av unmethylated sekvenser i behandlede celler rapportert med den i ubehandlede celler (Ctrl). Verdier representerer gjennomsnitt (± SEM) fra tre uavhengige qms-PCR eksperimenter. *
P
0,05, **
P
. 0,01
I tråd med våre uttrykk studier, kvantitative MS-PCR resultater viste at TSA indusert ingen betydelig reduksjon i
MAGEA1
promoter metylering nivå, i enten SK-MEL-23 eller EB16-MEL-cellelinjer (fig. 2C). Betydelig demetylering av
MAGEA1
promoter ble i stedet observert i begge cellelinjene etter 5-azadC behandling (Fig. 2C).
Til sammen disse resultatene antydet at mens TSA kan indusere forbigående de-undertrykkelse av
MAGEA1
i utgangspunktet ikke-uttrykke celler, betyr det ikke føre til DNA demetylering og langsiktig transcriptional aktivering av genet.
histonmodifikasjonene forbundet med en
in vitro
metylert
MAGEA1
transgen
Vår manglende evne til å gjenkjenne TSA-indusert demetylering og langsiktig aktivering av genet
MAGEA1
, som rapportert her ovenfor, kan skyldes eksperimentelle begrensninger . Det er mulig, ja, at epigenetisk virkningen av TSA på
MAGEA1
forekom hos bare en liten andel av cellene, noe som gjør det meget vanskelig å detektere signifikante genaktivering og DNA-metylering forandringer i den behandlede cellepopulasjon. Videre overt epigenetisk aktivering av
MAGEA1
av TSA kan kreve tilstedeværelse av passende transkripsjonsfaktorer, som kanskje ikke er til stede i SK-MEL-23 eller EB16-MEL cellelinjer. Vi har vist, ja, at langvarig aktivering av
MAGEA1
krever ikke bare en DNA-demetylering prosess, men også tilstedeværelsen av transkripsjonsaktivatorer for å forhindre etterfølgende remetylering av promoteren [23].
Vi har derfor besluttet å re-vurdere effekten av TSA på en tidligere etablert cellesystem (MZ2-MEL.TrHM) som inneholder en valgbar
MAGEA1
konstruere [24]. MZ2-MEL.TrHM celler inneholder et transgen (
MAGEA1 /hph
) som omfatter en stor del av
MAGEA1
locus (inkludert promoter-regionen), fulgt av sekvensen som koder for motstand mot hygromycin (
HPH
fig. 3A). Transgenet ble metylert
in vitro
før transfeksjon, og forblir metylert og stille i MZ2-MEL.TrHM celler, som er derfor følsomme for hygromycin. Men vi viste at hygromycin-resistente (hygro
r) celle kloner synlig når
MAGEA1 /HPH
transgenet blir stabilt aktivert, for eksempel etter forbigående behandling med 5-azadC [24]. Viktigere, ble MZ2-MEL.TrHM celler avledet fra en
MAGEA1
-expressing melanoma cellelinje. Disse cellene inneholder derfor alle nødvendige transkripsjonsfaktorer for å sikre langsiktig aktivering av genet promoter, noe som gjenspeiles av tilstedeværelsen av en aktiv og unmethylated endogen
MAGEA1
genet.
A
, Skjematisk fremstilling av strukturen og DNA metylering status for de aktive unmethylated (tomme sirkler)
MAGEA1
genet og de inaktive metylert (fylte sirkler)
MAGEA1 /HPH
transgen i MZ2-MEL .TrHM celler. Svarte bokser tilsvarer de
MAGEA1
eksoner, den mørke grå boksen i
MAGEA1 /HPH
transgenet representerer
HPH
transkripsjonsenhet, og stjerne (*) er stedet der en 12-bp tag sekvens (bærer en
Xba
restriksjonssete) ble satt inn. Den nederste panel er en forstørrelse av amplikonet som ble amplifisert i Chip eksperimenter, og viser de forventede fragmentstørrelsene følgende
Xba
-fordøyelse.
B
, chip eksperimenter ble brukt til MZ2-MEL.TrHM. Det resulterende
MAGEA1
amplikonene ble fordøyd med
Xba
jeg og separert på agarosegel, og dermed avsløre relative berikelse av de angitte histonmodifikasjonene innenfor enten
MAGEA1
genet (øvre bånd ) eller
MAGEA1 /HPH
transgen (lavere band).
C
, relativ berikelse av histone merker på transgenet ble utledet ved å tallfeste bandet intensiteter i gel elektroforese bilder (ImageJ programvare), og beregning av nedre /øvre ratio. Data, som ble normalisert ved den nedre /øvre forholdet i inngangsprøver, avledet fra i det minste to uavhengige eksperimenter brikke, med to PCR /XbaI /elektroforese analyser i hvert enkelt tilfelle. *
P
0,05, ***
P
. 0,001
Vi først gjennomført chip eksperimenter for å identifisere histonmodifikasjonene forbundet med den tause
MAGEA1 /HPH
transgen i MZ2-MEL.TrHM celler. Tilstedeværelsen av en tag sekvens i
MAGEA1 /HPH
transgen, satt i posisjon 158 i forhold til transkripsjon start stedet og inneholder en
Xba
-Jeg restriksjonssete, tillot oss å skille
MAGEA1
amplikonene stammer fra enten eksogene transgenet eller endogene genet. Dermed MZ2-MEL.TrHM kromatin-avledet
MAGEA1
amplikonene ble fordøyd med
Xba
-I, for derved å gi et øvre bånd (330 bp) som stammer fra det endogene
MAGEA1
genet og et nedre bånd (269 bp) som stammer fra
MAGEA1 /HPH
transgen følgende elektroforese i agarose (fig. 3A, B). Ved å bruke denne fremgangsmåten til analyse av chip-avledet kromatin prøvene, fant vi at H3ac og H3K4me2 histone merkene var sterkt utarmet i
MAGEA1 /HPH
transgen, sammenlignet med den endogene
MAGEA1
genet. I kontrast, dukket det undertrykkende H3K9me2 mark hovedsakelig beriket innenfor transgenet (fig. 3B, C). Disse resultatene indikerer at etter integrering i MZ2-MEL.TrHM genom,
in vitro
metylert
MAGEA1 /HPH
transgen vedtatt histone merkene vanligvis er knyttet til den undertrykte tilstand av
MAGEA1
gener hos ikke-uttrykkende celler.
Mangel på langsiktig aktivering av
MAGEA1 /HPH
følgende TSA behandling
Som vi fant lav histone acetylering innenfor taus
MAGEA1 /hph
transgenet, testet vi muligheten for TSA å indusere stabile aktivering av transgenet, og følgelig fremveksten av hygro
r kloner blant de behandlede MZ2-MEL.TrHM cellepopulasjon. I tillegg til den konvensjonelle 24 TSA behandling, ble en 72 h-TSA lang eksponering påført MZ2-MEL.TrHM celler, som det ble rapportert at langvarig behandling med HDAC-inhibitorer kan i noen tilfeller være nødvendig for å indusere lokal DNA demetylering [25]. Konsentrasjonen av TSA i 72h behandlingen ble redusert til 80 nM, fordi høyere doser ble funnet å drepe de fleste celler i løpet av denne tidsperioden. Foruten TSA-behandlede celler, vi også analysert celler behandlet med en suboptimal dose av 5-azadC (20 nM; Fig. 4A). 5-azadC ved denne dose ble funnet å indusere
MAGEA1 /hph
mRNA-ekspresjon på et nivå sammenlignbart med det som ble observert ved dag 1 etter 24 h TSA behandling (Fig. 4B). Derfor behandling med suboptimal dose av 5-azadC tillatt oss å kontrollere om våre hygromycin utvelgelsesprosessen var fortsatt effektiv i forhold der bare lavt nivå aktivering av transgenet skjedde.
A
, skjematisk fremstilling av forsøket. MZ2-MEL.TrHM-cellene ble behandlet eller ikke (kontroll) med 300 nM av TSA i 24 timer, 80 nM av TSA i 72 timer, eller med 20 nM av 5-azadC i 72 timer. Etter tre dager ble 10
6-celler fra hver gruppe overføres i to kolber (75 cm
2), og ble valgt i et medium inneholdende hygromycin (180 ug /ml) i løpet av 13 dager.
B
, Nivået uttrykk for
MAGEA1 /HPH
transgen ble kvantifisert ved QRT-PCR på angitt tidspunkt (d1 eller d3) i hver gruppe av celler. Data representerer gjennomsnittet (± SEM) fra al minst tre uavhengige eksperimenter. ***
P
0,001.
C
, Nivået av DNA demetylering av
MAGEA1 /HPH
5′-regionen i de ulike grupper av celler ble vurdert ved kvantitativ MS-PCR, ved hjelp av primere som spesifikt forsterke merket transgen sekvens. Dataene (fold DNA demetylering) ble beregnet som i figur 2C, og tilsvarer den midlere (± SEM) fra minst tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05.
D
, Antall kloner som overlevde hygromycin utvalg ble talt på dag 16 i de tre grupper av celler. Data stammer fra minst to uavhengige forsøk, hver i to eksemplarer.
Kvantitativ RT-PCR eksperimenter viste at mens lav, men signifikant
MAGEA1 /HPH
mRNA induksjon ble observert på dag 1 etter 24 h TSA behandling, dette induksjon var allerede mistet to dager senere (fig. 4B). MZ2-MEL.TrHM celler som hadde vært utsatt for den 72h TSA behandling viste en svært beskjeden økning i
MAGEA1 /HPH
mRNA uttrykk (ikke signifikant,
p = 0,1428
), sammenlignet med kontrollceller (fig. 4B). Dette lave nivået av induksjons var sannsynligvis tilskrives den reduserte konsentrasjonen av TSA i denne tilstand. Videre kvantitativ MS-PCR rettet spesifikt mot den transgene
MAGEA1
5′-region, viste ingen demetylering av denne DNA-sekvens i en av de TSA-behandlede cellepopulasjoner, sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 4C) . I motsetning til celler behandlet med suboptimal dose av 5-azadC vises moderat, om enn betydelig, DNA demetylering av
MAGEA1 /HPH
transgenet.
For å oppdage sjeldne celler der
MAGEA1 /HPH
transgen aktivering kan ha skjedd, og som kan ha forblitt usynlig i vår RT-PCR og MS-PCR-analyser, vi leverte de annerledes behandlet MZ2-MEL.TrHM cellepopulasjoner til valg i hygromycin. Etter 13 dager med utvalget, ble hygroskopisk
R kolonier telles. Den midlere frekvens av hygro
r-kloner oppnådd ved å følge enten den 24 timer eller 72 timer TSA behandling (6 x 10
-6 og 5,5 x 10
-6, henholdsvis) var ikke høyere enn det som ble observert for ubehandlet kontrollgruppe celler (9,5 × 10
-6), og samsvarer derfor til bakgrunnsnivået av spontant hygroskopisk
r revertante celler (fig. 4D). Til sammenligning behandling med suboptimal dose av 5-azadC resulterte i fremveksten av et mye høyere antall hygroskopisk
r kloner ( 3 × 10
-4). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at TSA ikke induserer DNA demetylering og stabil aktivering av
MAGEA1 /HPH
transgen, selv ikke i en liten andel av de behandlede MZ2-MEL.TrHM celler.
DNA demetylering induserer reversering av histone karakterer i
MAGEA1 /HPH
Vurderer tidligere studier av andre [18], [19] og de observasjoner vi beskrevet her ovenfor, synes det lite sannsynlig at endringer på nivå med histonmodifikasjonene kan på egen hånd være et tilstrekkelig trigger til å forårsake DNA demetylering og langsiktig aktivering av
MAGEA1
genet. Det var derfor rimelig å foreslå at reversering av histone merkene forbundet med
MAGEA1
aktivering er i stedet en konsekvens av DNA demetylering. For å teste denne hypotesen, vi tydde til en tidligere etablert hygroskopisk
r sub-populasjon av MZ2-MEL.TrHM celler (H
r befolknings, Fig. 5A og [24]), som hadde blitt oppnådd etter transient eksponering av cellene til antisensoligonukleotider rettet mot
DNMT1
, den dominerende DNA-metyltransferase i disse celler [24]. Vi besluttet å gjennomføre chip eksperimenter på H
r befolkningen for å fastslå effekten av DNA demetylering på H3ac, H3K4me2 og H3K9me2 histone merkene i
MAGEA1 /HPH
transgenet. Analyser ble også utført på en celleklon (H
r klon 1), som var blitt isolert fra H
r populasjonen (Fig. 5A). Kvantitativ RT-PCR og natriumbisulfitt sekvense bekreftet robust transkripsjonen aktivering og DNA demetylering av
MAGEA1 /HPH
transgenet i H
r befolkningen og H
r klone 1 (fig. 5B).
En
, Skjematisk skisse av avledning av H
r befolkningen og H
r klone en fra MZ2-MEL.TrHM celler (se referanse [24] for detaljer) . MZ2-MEL.TrHM celler ble gjentatte ganger transfekterte med antisensoligonukleotider rettet mot
DNMT1 product: (
DNMT1-AS:) under 7 dager, og ble deretter overført til medium som inneholder hygromycin. Etter 9 dager med hygromycin valg, en resistent populasjon fremkom (H
r populasjon), og en klon (H
r klon 1) ble isolert fra denne populasjonen ved begrensende fortynning. H
r befolkningen og H
r klone en ble deretter dyrket uten hygromycin utvalg.
B
, mRNA uttrykk nivå (forholdet til 10
4
ACTINB
) og 5′-regionen DNA metylering status (% denaturert CPGs) av
MAGEA1 /HPH
transgen ble bestemt i MZ2-MEL.TrHM celler, H
r befolkningen og H
r klone en av henholdsvis QRT-PCR og bisulfite sekvensering,.
C
Chip-qPCR ble brukt til å evaluere anriking av H3K9me2 i
MAGEA1 /HPH
transgenet i de tre grupper av celler (se tekst for detaljer). Fold berikelse nivåer ble oppnådd ved å rapportere på
MAGEA1
5′-regionen berikelse verdier til den av
GAPDH
5′-regionen i samme prøve. Data representerer gjennomsnittet (± SEM) på to til tre Chip eksperimenter, med to like qPCR målinger i hvert tilfelle. ***
P
0,001.
D
, chip /PCR /
Xba
jeg prosedyre (se Fig. 3A, B) ble brukt for å evaluere anrikning av H3ac og H3K4me2 i 5′-regionen av
MAGEA1 /HPH
transgenet i tre gruppe av celler.
E
, analyser ImageJ av gel elektroforese bilder ble brukt for å kvantifisere
MAGEA1
5′-regionen transgen /gen-forhold. Data representerer gjennomsnittet (± SEM) fra to uavhengige eksperimenter brikke, med to PCR /XbaI /elektroforese analyser i hvert enkelt tilfelle. **
P
0,01, ***
P
. 0,001
For analyse av H3K9me2 ble chip prøver innsendt til kvantitative PCR med primere ikke skille mellom endogene og transgene
MAGEA1
sekvenser. Mangel på H3K9me2 innenfor den endogene aktive
MAGEA1
genet i MZ2-MEL.TrHM celler (se fig. 3B, C) underforstått, men at de fleste chip-avledet amplikonene ville stammer fra
MAGEA1 /HPH
transgenet. Resultatene, som er avbildet i figur 5C, var i samsvar med en redusert berikelse av H3K9me2 innenfor 5 «regionen
MAGEA1 /HPH
i H
r befolkningen og i H
r klone en , sammenlignet med kontroll MZ2-MEL.TrHM celler. For analyse av H3ac og H3K4me2, vi tydde til chip-PCR
Xba
jeg prosedyren som er beskrevet ovenfor (fig. 3A). Resultatene viste at mens
MAGEA /HPH
transgenet ble ikke forbundet med H3ac og H3K4me2 i MZ2-MEL.TrHM kontrollceller, det vises betydelig berikelse av disse to oppstarts merkene i H
r befolkningen og i H
r klone 1 (fig. 5D, E). Til sammen disse resultatene tyder på at forbigående utarming av DNMT1 i MZ2-MEL.TrHM celler, resulterte i fremveksten av hygroskopisk
r celler, der re-aktivert
MAGEA1 /HPH
locus vises ikke bare merket DNA hypometylering, men også betydelig tilbakeføring av sin histone modifikasjon profil mot en aktiv konfigurasjon.
Diskusjoner
Genome hypometylering er hyppig observert i tumorceller, og har vært assosiert med malign progresjon. Men mekanismene bak dette epigenetisk endring er fortsatt ukjent. Tatt i betraktning den stramme koblingen som eksisterer mellom DNA metylering og histonmodifikasjonene, var det rimelig å foreslå at DNA hypometylering i svulster kan være en konsekvens av endringene som skjer på nivå med histone merker. Endringer av histone modifikasjon profiler har faktisk blitt observert i ulike krefttyper, og har i noen tilfeller vært assosiert med mutasjoner i histone modifisering enzymer [26].
I denne studien analyserte vi forholdet mellom DNA metylering og histonmodifikasjonene innen
MAGEA1
gen, da det hører til den unike gruppen av CG gener, som promoter hypometylering ble hyppig observert i en rekke av tumorer og er konsistent assosiert med transkripsjonen aktivering [11]. Det er tidligere blitt rapportert at demetylering og aktivering av CG gener i svulster er vanligvis forbundet med et tap på undertrykkende histon merker, og gevinster i aktivering av histon merker [18], [19]. En slik forening ble bekreftet i vår nåværende studie, som vi fant at
MAGEA1
demetylering og aktivering i melanom celler korrelerte med tap av H3K9me2 og gevinster i H3ac og H3K4me2. Tidligere studier viste imidlertid at uttrykket av
MAGEA1
kunne ikke aktiveres bare ved å modulere H3K9me2 eller H3K4me2 nivåer, noe som tyder på at disse to histonmodifikasjonene bare spiller en sekundær rolle i epigenetisk regulering av dette genet [18], [19]. Hemmere av histon deacetylases, inkludert TSA, ble i stedet funnet å indusere aktivering av
MAGEA1
, noe som tyder på at histon acetylering kan bidra mer aktivt til epigenetisk regulering av dette genet [22], [27]. Vår nåværende data tyder imidlertid på at TSA behandling fører til bare forbigående aktivering av
MAGEA1 Hotell og induserer ikke DNA demetylering innenfor genet arrangøren.
Vår studie gir en grundig analyse av effekten av TSA på
MAGEA1
aktivering, siden vi testet dens innvirkning ikke bare i ikke-uttrykke cellelinjer, men også i MZ2-MEL.TrHM celle-klone, som inneholder en
in vitro
metylert transgen omfattende det 5′-delen av
MAGEA1
fulgt av sekvensen som koder for motstand mot hygromycin. Denne cellesystem gir høy følsomhet, da det tillater valg av celler (selv om de er sjeldne), hvor aktivering av
MAGEA1
promoter oppstått. I tillegg, fordi cellene uttrykker endogen
MAGEA1
genet, de åpenbart inneholder alle nødvendige faktorer for å sikre transkripsjonen aktivering av transgene
MAGEA1
promoter, når den er sluppet løs fra kromatin begrensninger. Viktigere, viste vi at, i motsetning til den endogene
MAGEA1
genet promoter, den eksogene
MAGEA1
transgen promoter i MZ2-MEL.TrHM celler var assosiert med høye nivåer av H3K9me2 og lave nivåer av H3ac og H3K4me2.
