Abstract
uttrykkene for forskjellige vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) isoformer er forbundet med graden av tumor invasivitet og pasientens prognose i humane kreftformer. Vi antok at ulike VEGF-isoformer kan utøve ulike effekter på de funksjonelle og strukturelle karakteristika for tumor angiogenese. Vi brukte dynamisk kontrastforsterket MRI (DCE-MRI) og steady-state kontrastforsterket MRI (SSCE-MRI) for å evaluere
in vivo
vaskulære funksjoner (f.eks perfusjon og permeabilitet) og strukturelle egenskaper (f.eks vaskulær størrelse og fartøy tetthet) av tumor angiogenese indusert av VEGF forskjellige isoformer (VEGF121, VEGF165, og VEGF189) i en murin xenograft modell av human lungekreft. Tumorer som overuttrykker VEGF189 var større enn de som overuttrykker de to andre VEGF-isoformer.
K
trans kart hentet fra DCE-MRI viste at perfusjon og permeabilitet funksjoner av kreft microvessels var høyest i både rim og kjerneområder av VEGF189-overekspresjon tumorer (
p
0,001 for både svulst rim og kjerne). Den relative fartøy tetthet og relative fartøystørrelse indekser som stammer fra SSCE-MRI viste at VEGF189-overekspresjon svulster hadde den minste (
p
0,05) og den mest-tett (
p
0,01) mikrokar, som penetrert dypt fra tumor felgen inn i kjernen, etterfulgt av den VEGF165-overepxressing tumor, som microvessels ble plassert hovedsakelig i svulsten felgen. microvessels de laveste tetthet ble funnet i VEGF121-overekspresjon svulst; Disse microvessels hadde et forholdsvis stort hulrom og ble funnet hovedsakelig i tumoren felgen. Vi konkluderer med at blant de tre VEGF isoformene evaluert, VEGF189 induserer de tettest spirende og minste tumor microvessels med høyest
in vivo
perfusjon og permeabilitet funksjoner. Disse karakteristikkene av kreft microvessels kan bidra til de rapporterte uønskede effekter av VEGF189 overekspresjon på tumorprogresjon, metastaser, og pasienten overlevelse i en rekke menneskelige kreftformer, inkludert ikke-småcellet lungekreft, og foreslår at bruk aggressiv behandling kan være nødvendig i kreft hos mennesker i som VEGF189 er overuttrykt
Citation. Yuan A, Lin CY, Chou CH, Shih CM, Chen CY, Cheng HW, et al. (2011) Funksjonelle og strukturelle kjennetegn ved Tumor Angiogenese i lungekrefttilfellene overekspresjon Ulike VEGF isoformer vurdert av DCE- og SSCE-MR. PLoS ONE 6 (1): e16062. doi: 10,1371 /journal.pone.0016062
Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA
mottatt: 16 august 2010; Godkjent: 07.12.2010; Publisert: 20 januar 2011
Copyright: © 2011 Yuan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien er finansiert av National Science Council (https://web1.nsc.gov.tw), gi nummer NSC 98-3112-B-001-019. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
angiogenese kreves for tumorvekst og metastase [1], [2], og det har vist seg at høye tumor angiogenese aktivitet er forbundet med avansert tumorvekst, fjernmetastaser, og en ugunstig prognose i humane cancere [ ,,,0],3], [4]. Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) er en potent angiogenese faktor i henhold til både fysiologiske og patologiske tilstander, og kan indusere tumor angiogenese [5], [6]. Det humane VEGF-genet (
VEGF-A
), som er lokalisert på kromosom 6p, inneholder åtte exoner [7]. Alternativ spleising av VEGF-genet gir opphav til flere isoformer. Tre store VEGF-A-isoformer (VEGF121, VEGF165, og VEGF189) uttrykkes i en rekke forskjellige humane vev og tumorprøver [5], [8], og har differensial biokjemiske egenskapene og biologiske funksjoner i fysiologisk angiogenese [9] – [13 ].
De biologiske funksjoner av ulike VEGF-A isoformer i patologisk angiogenese, for eksempel tumor angiogenese, er fortsatt uklart. Flere studier, blant annet vår forrige undersøkelse, har vist at uttrykket av VEGF189 i en svulst er sterkt assosiert med høy tumor microvessel teller, kreft metastase, og kort pasient overlevelse i flere kreft hos mennesker [14] – [16], og med høy xenotransplantability av flere humane kreftceller hos mus [17]. Men mekanismene bak disse aktivitetene er fortsatt ukjent. Få studier har undersøkt rollene til de ulike store VEGF isoformene i å bestemme funksjonene til svulsten microvasculature og i tilrettelegging tumorigenesis og metastase via tumor angiogenese.
Dynamisk kontrastforsterket MRI (DCE-MRI) med utnyttelse av T1-kontrastmiddel Magnevist (Gd-DTPA, MW: 938 Dalton), er i stand til å tilveiebringe en vaskulær funksjonell parameter, den vaskulære overføringskonstant (
K
trans), som gir et mål for perfusjon og permeabilitet av fartøy [18] – [21]. I tillegg steady-state kontrastforsterket MRI (SSCE-MRI) i kombinasjon med T2 agent, Resovist (super paramagnetiske jernoksid (SPIO) partikler, størrelse: 45-60 nm), kan gi strukturell informasjon om microvasculature, nemlig den relative fartøyet tetthet indeks (rVDI) og den relative fartøystørrelsen indeks (rVSI) [22] – [26]. MR er derfor raskt fremstår som en lovende metode for å vurdere vaskulær perfusjon og permeabilitet, og microvessel tetthet (MVD) og størrelse
in vivo
i flere kreft hos mennesker [27] -. [30]
Vi antok at ulike VEGF isoformer kan indusere tumor angiogenese med ulike biologiske funksjoner. Derfor brukte vi DCE- og SSCE-MR for å vurdere de funksjonelle og strukturelle kjennetegn ved tumor angiogenese i lungekrefttilfellene overekspresjon en av tre forskjellige enkelt VEGF isoformene (VEGF121, VEGF165, eller VEGF189) i en murine xenograft modell. Målet med denne studien var å teste om
K
trans, rVDI, og rVSI av tumor angiogenese skilte mellom lungesvulster overekspresjon en av tre forskjellige VEGF isoformer. Resultatene vil bidra til å klargjøre rollen til forskjellige VEGF-isoformer i indusering av tumor angiogenese, interaksjonen mellom struktur og funksjon av tumor angiogenese, og mekanismene bak sammenhengen mellom ekspresjonen av et spesifikt VEGF isoform i en tumor og pasientens kliniske resultatet i humane kreftformer.
Resultater
Generering av stabile CL1-0 cellelinjer som uttrykker ulike VEGF isoformene
kreft cellelinje forelder lunge CL1-0 ble stabilt transfektert med VEGF121, VEGF165, eller VEGF189 isoformen cDNA eller tom vektor (mock transfektert). Ca. 20 kloner av hver VEGF-isoform-uttrykkende celle ble analysert, og en panel (dvs. VEGF121-3, VEGF165-C12, og VEGF189-A3) til slutt ble valgt for eksperimenter, som viste de tilsvarende nivåer av VEGF-isoformen uttrykk. Det rekombinante VEGF isoformen mRNA uttrykt av hver klon ble bekreftet ved sanntids kvantitativ RT-PCR. Det rekombinante protein uttrykkes ble også bekreftet ved Western-blotting (fig. 1A), med de forventede molekylvekter blir 18 kDa (VEGF121), 23 kDa (VEGF165), og 26 kDa (VEGF189). Mengden av hver isoform VEGF i kultursupernatanten, som bestemt ved ELISA, var 1,14 x 10
2 til 2,9 x 10
2 ng /celle i en 48-timers periode. VEGF isoformene uttrykk nivå
in vivo
i de implanterte svulster bestemmes av sanntids kvantitativ RT-PCR ble lik blant svulster overekspresjon en av tre VEGF-isoformen (p = 0,953, enveis ANOVA) (Fig. 1B ).
A. Western blot av VEGF-isoformen protein uttrykk i cellelysat av menneskelige CL1-0 lungekreft celler transfektert med enkelt forskjellige VEGF isoform konstruksjoner. Hver VEGF protein isoform omfattet en glykosylert (øvre) og en ikke-glykosylerte (lavere) protein. Tubulin ble anvendt som en intern kontroll. B. Kvantifisering av VEGF mRNA uttrykk
in vivo
i tumor implantater av sanntids kvantitativ revers transkripsjon-PCR. Ekspresjonsnivået av VEGF isoformen var lik blant CL1-0 lungecancer-cellelinjer som overuttrykker en av tre VEGF-isoformer (p = 0,953, en-veis ANOVA).
tumorvolumer og vekstkurver for VEGF- -isoform-overekspresjon svulster, målt ved T2WI
volumene av VEGF121-, VEGF165-, og VEGF189- overekspresjon svulster, målt på T2-vektede bilder (fig. 2) økte fra dag 7 til dag 35 etter inokulering, mens mock tumorer viste ingen signifikant økning i tumorvolum (The uekte tumor indikerer tumor avledet fra CL1-0 lungekreft-cellelinje transfektert med tom vektor). Svulsten vekstkurve viste at VEGF189- og VEGF165- overekspresjon svulster vokste raskere enn de andre (
n
= 6,
p
0,0001 ved to-veis ANOVA, alle
p
verdier 0,001 av Fisher
post hoc
test, fig. 3). Vekstkurven viste også at VEGF189- og VEGF165-overekspresjon svulster vokste raskt og eksponentielt etter dag 21 (
p
0,05, etter Fishers
post hoc
test, Fig. 3).
Tumor vekst av CL1-0 kreftceller som overuttrykker en av tre VEGF isoformene på ulike tidspunkter i SCID-mus, estimert ved hjelp T2WI. #, VEGF189 versus VEGF121 og mock svulster; +, VEGF165 versus VEGF121 og mock svulster; *, Sammenligning mellom ulike isoform-uttrykke og mock svulster. Forskjeller mellom VEGF-overekspresjon svulster og mock svulster var signifikant på
p
0,05 (ett symbol),
p
0,01 (to symboler),
p
0.001 (tre symboler), og
p
. 0,0001 (fire symboler) nivåer
på slutten av dag 35, volumene av de tumorxenotransplantater var 141,1 ± 22.4 mm
3, 610.8 ± 87,8 mm
3, og 738.0 ± 116,1 mm
3 for VEGF121-, VEGF165-, og VEGF189-overekspresjon svulster, henholdsvis, mens det av den uekte svulsten xenograft var 37,4 ± 7,9 mm
3. Volumene av VEGF165- og VEGF189-overekspresjon svulster på dag 35 var betydelig større enn for de mock-transfektert og VEGF121-overekspresjon tumorer (fig 3;. All
p
0,001 av Fishers
post hoc
test). Volumet av VEGF189-overekspresjon svulst tendens til å være større enn den VEGF165-overekspresjon svulst, men forskjellen var ikke statistisk signifikans.
Perfusjons og permeabilitet av tumor microvessels evaluert av
K
trans kartet på DCE-MRI
Figur 4A viser time
K
trans kart for de tre VEGF-isoformen-overekspresjon svulster fra dag 7 til dag 35. ulike angiogene mønstre av
K
trans ble observert i de forskjellige VEGF-overekspresjon og mock svulster. På dag 35,
K
trans signalet ble observert hovedsakelig i svulsten rim i mock-transfektert og VEGF121-overekspresjon svulster, mens i VEGF165-overekspresjon svulst,
K
trans-signalet ble plassert hovedsakelig i felgen, med noen i kjernen. En betydelig mengde signal som strekker seg fra kanten til kjernen ble bemerket i VEGF189-overekspresjon svulst.
In vivo
temp
K
trans kart og kvantitative kurve for tumorxenotransplantater av CL1-0 kreftceller som overuttrykker en av tre VEGF isoformene på ulike tidspunkter, evalueres av DCE-MRI. (A) Representant
K
trans fargekart i forskjellige VEGF-overekspresjon og mock-transfektert tumorer (innenfor stiplet sirkel) til forskjellige tider, fra dag 7 til dag 35 fostertap. Fargen varierte fra blå (0 /min, laveste
K
trans) til rød (0,8 /min, høyest
K
trans). B) Kvantitativ analyse av
K
trans verdier over tid i regionene i hele tumor (øverst), tumor rim (midten), og tumor kjerne (lavere). #, VEGF189 versus andre isoformer og mock svulster; +, VEGF165 versus VEGF121 og håne svulster. Forskjeller mellom VEGF-overekspresjon svulster og mock svulster var signifikant på
p
0,05 (ett symbol),
p
0,01 (to symboler),
p
0.001 (tre symboler), og
p
0,0001 (fire symboler) nivåer. (C)
K
trans-verdien på dag 35 i den tumor kanten (øvre) og tumor kjerne (i midten), og forholdet mellom
K
trans-verdier mellom svulst kjerne og tumor kant (nedre). Forskjeller mellom VEGF-overekspresjon svulster og mock svulster var signifikante på *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
0.001, og ****
p
. 0,0001 nivåer
den midlertidige endringen i
K
trans verdier i det hele tatt, rim, og kjernen av tumor økt betydelig etter dag 14 i VEGF189- og VEGF165-overekspresjon svulster, mens det var ingen signifikant økning i
K
trans verdier for de mock-transfektert og VEGF121-overekspresjon svulster (fig . 4B). Tinning
K
trans kurvene var betydelig høyere i VEGF189-overekspresjon svulster i hele tumor (Fig. 4B, øvre), tumor rim (Fig. 4B, midten), og tumor kjerne (Fig . 4B, lavere) enn i de andre (alle
p
0,001 av Fishers
post hoc
test)
på dag 35,
K
trans-verdi på felgen og kjernen av tumorene var 0,25 ± 0,07 /min og 0,06 ± 0,03 /min, henholdsvis, for VEGF121-overuttrykkende tumorer, 0,53 ± 0,08 /min og 0,28 ± 0,05 /min for VEGF165- overekspresjon svulster, 0,88 ± 0,1 /min og 0,66 ± 0,12 /min for VEGF189-overekspresjon svulster, og 0,19 ± 0,05 /min og 0,06 ± 0,02 /min for mock tumorxenotransplantater (fig. 4C).
K
trans på dag 35 var signifikant høyere i VEGF189-overekspresjon svulster enn i de andre tre typene (alle
p
0,01 for felgen og
p
0,001 for kjernen av Fishers
post hoc
test fig. 4C, øvre, midtre). Kjerne /kant-forhold på
K
trans i VEGF189-overuttrykkende tumorer på dag 35 var 0,73 ± 0,09, som var betydelig høyere enn de i VEGF165- (0.53 ± 0.03) og VEGF121- (0,26 ± 0,08) overekspresjon svulster og i de mock tumorxenotransplantater (0,25 ± 0,05;
p
0,05,
p
0,0001, og
p
0,0001, henholdsvis ved Fishers
post hoc
test). Dette indikerer at signalet av
K
trans kartet ble distribuert dypest fra felgen til kjernen regioner av VEGF189-overekspresjon svulster (fig. 4C, lavere).
vaskulære strukturelle kjennetegn ved tumor angiogenese vurdert av rVDI og rVSI på SSCE-MR
Figur 5A og B viser representative kart over henholdsvis rVDI og rVSI, i mock og ulike VEGF-overekspresjon svulster på dag 36. rVDI kartet viser bare noen få spredte fartøy tetthet signaler i svulsten rim i en mock-transfektert svulst. Den VEGF189-overuttrykkende tumor viser en høy tetthet av mikrokar distribuert fra felgen til kjernen av tumoren. I motsetning til dette oppviser den VEGF121-overuttrykkende tumor en lav tetthet av mikrokar som er begrenset til felgen, og den VEGF165-overuttrykkende tumor har en blandet lav og høy tetthet av mikrokar som er fordelt hovedsakelig i felgen, med noen i kjernen ( fig. 5A). Som vist i det øvre panel på fig. 5C, den rVDI av hele svulsten var høyest i VEGF189-overekspresjon tumorer (0,26 ± 0,03 /s
1/3), middels i VEGF165-overekspresjon tumorer (0,17 ± 0,01 /s
1/3), og lavest i VEGF121-overekspresjon (0.11 ± 0.01 /s
1/3) og mock-transfektert (0.07 ± 0.02 /s
1/3) tumorer (alle
p
0,01 av Fishers
post hoc
test). I både rim og kjerne, VEGF189-overekspresjon svulster viste de høyeste rVDI verdier blant alle VEGF-isoformen-overekspresjon og mock-infiserte tumorer (Fig. 5C, midtre og nedre paneler).
In vivo
rVDI og rVSI kart og kvantitative kurver for tumorxenotransplantater av CL1-0 kreftceller som overuttrykker en av tre VEGF isoformene, evalueres av SSCE-MR. Representative høyoppløselige kart av (A) rVDI og (B) rVSI i de ulike VEGF-overekspresjon og håne svulster på dag 36 etter svulst implantasjon. I rVDI kartet, fargen varierte fra blå (0 S
-1/3, lavest rVDI) til rødt (0,4 S
-1/3, høyeste rVDI). I rVSI kart, farge varierte fra blått (0, lavest rVSI) til rødt (30, høyest rVSI) .Quantitative analyse av (C) rVDI og (D) rVSI i hele tumor (øvre), tumor felg (i midten), eller tumor kjerne (nedre). Forskjeller mellom VEGF-overekspresjon svulster og mock svulster var signifikante på *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
0.001, og ****
p
. 0,0001 nivåer
kartet rVSI viser noen signaler i svulsten rim i mock svulst. Kartet rVSI indikerer også at tumor microvessels var nesten alle store fartøyer i VEGF121-overekspresjon svulster (i felgen), blandet store og små i VEGF165-overekspresjon svulster (hovedsakelig i felgen med noen i kjernen), og nesten alle små i VEGF189-overuttrykkende tumorer (fra felgen til kjernen, fig. 5B).
Som vist i det øvre panel på fig. 5D, den rVSI av hele svulsten var høyest i de VEGF121-overekspresjon tumorer (37,24 ± 4,88), mellom i VEGF165-overekspresjon tumorer (28,84 ± 1,46), og lavest i VEGF189-overekspresjon (18,82 ± 2,27) og mock ( 9,84 ± 2,25) tumorer (alle
p
0,05 av Fishers
post hoc
test). I både kanten og kjernen, den VEGF189-overuttrykkende tumor hadde den laveste rVSI blant de VEGF-isoform-overuttrykkende tumorer (fig. 5D, midtre og nedre paneler).
Angiogenese fenotype av tumorer som overuttrykker forskjellige isoformer av VEGF immunhistokjemisk farging
ved lav strøm (fig. 6A, x 100), den immunhistokjemisk farging avslørte et fåtall microvessels fordelt på periferien av tumor reir av mock tumorer, og tettere tumor microvessels fordelt hovedsakelig på periferien av tumor eller svulst hekker i VEGF121- og VEGF165-overekspresjon svulster. I den VEGF189-overuttrykkende tumorer, var meget tette microvessels ses både på felgen og i kjernen.
Angiogenese fenotyper av mikrokar evaluert ved immunhistokjemisk farging av tumorxenografter overekspresjon forskjellige VEGF-isoformer. (A) Immunhistokjemisk farging av tumor microvessels (brun farge, × 100 i hovedpanelet, × 400 i innfelt) i tumorxenotransplantater. (B) Den microvessel tettheten var høyest i de VEGF189-overekspresjon svulster, mellom i VEGF165-overekspresjon svulster, og lavest i de VEGF121-overekspresjon svulster. (C) Antall fartøy med en diameter større enn 15 mikrometer per svulst seksjon i svulsten xenograft var høyest i de VEGF121-overekspresjon svulster, mellom i VEGF165-overekspresjon svulster, og lavest i de VEGF189-overekspresjon svulster. Forskjeller mellom VEGF-overekspresjon og mock svulster var signifikante på *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
0,001 og ****
p
. 0,0001 nivåer
Ved høy effekt (fig. 6A, × 400, innsats), VEGF121-overekspresjon svulster hadde flere store microvessels med utvidede lumen i tillegg til de små-lumen microvessels og VEGF165-overekspresjon svulster hadde mellomstore microvessels. I motsetning til i VEGF189-overekspresjon og mock-transfektert svulster, nesten alle de microvessels hadde en liten lumen.
MVD og flere store microvessels i tumorxenotransplantater på immunhistokjemisk farging
Som vist på fig. 6B, MVD målt fra immunhistokjemisk farging av CD31 var høyest i VEGF189-overekspresjon tumorer (100,00 ± 13,30 /mm
2), mellom i VEGF165-overekspresjon tumorer (70,66 ± 6,84 /mm
2), og lavest i VEGF121-overekspresjon (40,07 ± 10,15 /mm
2) og mock-transfektert (29.98 ± 4.24 /mm
2) tumorer (alle
p
0,05 av Fishers
post hoc
test).
Som vist i fig. 6C, antall fartøy med en diameter større enn 15 mikrometer per svulst seksjon i svulsten xenograft var høyest i VEGF121-overekspresjon svulster (13.21 ± 0.95 /mm
2), mellom i VEGF165-overekspresjon svulster (8.58 ± 1.11 /mm
2), og lavest i VEGF189-overekspresjon (5.58 ± 0.76 /mm
2) og mock-transfektert (3,21 ± 0,47 /mm
2) svulster (alle
p
derfor samle mer komplette data om endringer i angiogen mikrovaskulær struktur og funksjon kan lette forståelsen av mekanismene bak tumor angiogenese og dermed gi terapeutiske implikasjoner.
K
trans, rVDI, og rVSI parametere innhentet av DCE- og SSCE-MR er i stand til å gi data på vaskulær perfusjon og permeabilitet, fartøy tetthet, og fartøystørrelse, henholdsvis. Så langt vi kjenner til, er dette den første studien som har brukt kontrastforsterket MR for å vurdere de funksjonelle og strukturelle kjennetegn ved kreft microvessels indusert av forskjellige VEGF isoformene
in vivo
, og å ha korrelert funksjonell og strukturelle kjennetegn ved angiogenese i VEGF-isoform-overekspresjon svulster.
ulike VEGF isoformene velig viser ulike biokjemiske egenskaper. VEGF121 er en kortere, ikke-heparin-bindende surt protein og er fritt diffusjonsevne, mens VEGF165 og VEGF189 kan binde heparin og heparansulfat proteoglykaner (HSPGs) [13]. VEGF189 er ofte forbundet med celleoverflaten og ekstracellulær matriks, mens VEGF165 er både et utskilt protein og er HSPG-assosiert [13]. VEGF165 og VEGF189 hver har forskjellige affiniteter for forskjellige ko-reseptorene, så som neuropilin-1 og neuropilin-2, og for HSPGs, såsom syndecan [14]. Nyere studier har vist at forskjellige VEGF-isoformer kan indusere tumor angiogenese som oppviser forskjellige morfologiske egenskaper [31] – [34]. VEGF121- og VEGF165-indusert tumor microvessels var assosiert med vasodilatasjon, microvessel utbrudd, og blødning [32]. I motsetning til dette, kan VEGF189 indusere intens tumor angiogenese som består av små, nydannede microvessels [31], [33]. I denne studien våre data fra SSCE-MR var samsvarende med disse morfologiske funn. Vi har videre vist at forskjellige VEGF-isoformer kan indusere microvessels med ulike
in vivo
vaskulære funksjoner, og den VEGF189-indusert angiogenese i lunge cancer er kjennetegnet ved de høyeste perfusjon og permeabilitetsegenskaper. Disse resultatene tyder på at VEGF189 kan indusere de mest tette og minste spirende kreft microvessels som har de høyeste perfusjon og permeabilitet egenskaper hos de tre VEGF-isoform-overekspresjon svulster undersøkt.
De nøyaktige molekylære og biologiske mekanismene bak annerledes morfologiske og funksjonelle egenskaper tumor angiogenese indusert av forskjellige VEGF isoformene fortsatt uklare; videre undersøkelser er nødvendig for å avklare dette. Noen nyere undersøkelser har gitt mulige forklaringer på disse forskjellene. Ruhrberg
et al.
Viste at i
VEGF
188/188
mus hjernen, var det en økning i endotelceller filopodia utvidelser, noe som kan føre til økt vaskulær forgrening og spirende angiogenese [ ,,,0],35]. I motsetning til dette ble VEGF121 vist å mangle evnen til å indusere spiring angiogenese [35], men bare coopts forhåndsdefinert peritumor fartøy og induserer vasodilatasjon. Våre MRI data gir solide bevis for de biologiske atferdsforskjeller endotelceller stimulert av ulike VEGF isoformene
in vivo
i tumor angiogenese. Det er også bevis for at den molekylære signalerings avviker blant disse isoformer. VEGF165 og VEGF189 kan bindes til VEGF-ko-reseptorene, slik som neuropilin-1 og HSPGs, og disse bindingene kan modifisere VEGF-signalisering i endotelceller, kontrollere biotilgjengeligheten av VEGF til VEGF-reseptorer [36] – [38]. Virksomheten til VEGF189 i atomtrans [34] og crosstalk av VEGF-signalveier med inte [39] kan også påvirke biologiske funksjoner av ulike VEGF isoformer i tumor angiogenese. Differensial celle biologiske funksjoner og molekylære signal transductions også oversette til forskjellige
in vivo
morfologiske og funksjonelle egenskaper tumor angiogenese indusert av ulike VEGF isoformer i humane kreftformer.
K
trans kartleggingen viste at
K
trans av microvessels var høyest i VEGF189-overekspresjon svulster. Den høye
K
trans verdien av VEGF189-overekspresjon svulster kan skyldes den høyeste tettheten av microvessels som penetrerer dypt fra felgen til kjernen av svulsten, som kan gi en høy vaskulær perfusjon funksjon. Tidligere studier har vist at VEGF189 kan øke den vaskulære permeabiliteten av huden fartøy og prolifererende intratumorale fartøy, vurdert ved Mile s vaskulær permeabilitet-analyse og Ig G farging [13], [31]. Våre data er i samsvar med disse funnene, og tyder på at den økende permeabilitet kan bidra til størst
K
trans verdi observert i VEGF189-overekspresjon svulster. I tillegg har vår tidligere rapport vist at blodstrømmen (Fρ), microvessel permeabilitet (PSρ) og blodvolumet (Vb) bestemt ved DCE-MRI var alle signifikant økning i tumor overekspresjon VEGF-189-isoformen [40]. Tozer
et al.
Nylig viste at mus VEGF188 kan indusere trange microvessels med størst microvessel lengde, motstand mot blødning og motstand mot antiangiogenesis middel terapi, men er forbundet med svulst vaskulær modenhet [34]. Dette kan oppstå fra forskjellige cellelinjer for å bli brukt til å overuttrykker VEGF isoform (fibrosarcom-cellelinjen vs lunge adenokarsinom-cellelinje), annen metode for eksperimentet, og annen modell benyttet. Men begge studiene viste forskjellig VEGF-isoformen har annen funksjon, og dette kan bestemme de forskjellige egenskapene til microvessels i svulster i forskjellige organer. Selv om VEGF121-overuttrykkende tumorer har større diametre microvessel, slik det er vist ved den høye rVSI, de tilsvarende
K
trans verdi er lav. Dette kan tyde på at
K
trans er avhengig hovedsakelig på rVDI snarere enn rVSI. Det nøyaktige forhold mellom
K
trans og rVSI eller rVDI kan være vanskelig å bestemme på grunn av den kompliserte tumor microenvironmental fysiologi med overekspresjon av VEGF forskjellige isoformer. Ikke desto mindre,
K
trans har blitt vist tidligere å være forbundet med fartøyet tetthet. Tidligere data har også vist at stasis av blod vil forekomme i de utvidede og kronglete vaskulære rom.
Fordi VEGF121 er en korteste, ikke-heparin-bindende surt protein som er fritt diffusjonsevne, vil de bli utskilt fra cellen de ytre omgivelser når de er syntetisert. Mengden av VEGF121-proteinet forble i cellen er ment å være lavere i forhold til andre VEGF-isoformer som har høyere andel av VEGF-proteiner som var igjen i cellene. Derfor kan tettheten av VEGF121 proteinbånd i Western blot oppnådd fra cellelysatet av CL1-0 kreftceller ikke står for den totale mengden av VEGF121 proteiner syntetisert eller det beløp som utskilles til omgivelsene. Vi har kvantifisert mengden av VEGF-isoformer som utskilles fra cellen inn i supernatanten ved hjelp av ELISA, og resultatene viste at mengden av VEGF121 protein i supernatanten var lik mengden av de to andre VEGF-isoformer. I tillegg har vi videre kvantifisert VEGF ekspresjonsnivået
in vivo
i tumorimplantater resekterte fra SCID-mus ved hjelp av sanntids-kvantitativ RT-PCR, og resultatet viste at ekspresjonsnivået av VEGF isoformen var lik blant svulster fra CL1-0 lungecancercellelinjer som overuttrykker en av tre VEGF-isoformer (p = 0,953, en-veis ANOVA) (fig. 1B). Derfor er forskjellene i tumorvekst og angiogene egenskaper mellom VEGF-isoformer i denne studien er på grunn av forskjellig funksjon av VEGF-isoformer, i stedet for som følge av de forskjellige uttrykk nivået av VEGF VEGF mellom ulike isoformer i tumorer.
I vår studie, den VEGF189 angiogenese hadde høyest MVD, trengt dypt fra svulsten felgen til svulsten kjernen, og hadde de høyeste perfusjon og permeabilitet funksjoner mellom tre forskjellige VEGF-isoform-overekspresjon tumortyper. Men den tumorstørrelsen ikke signifikant forskjellig mellom VEGF165- og VEGF189-overepxressing svulster. Vi observerte levedyktigheten av svulstene ved hjelp av immunhistokjemi og hematoxylin-eosin farging, og vi fant at det sentrale nekrose er større for VEGF165-overekspresjon svulster enn for VEGF189-overekspresjon svulster. Dette indikerer at til tross for å ha lignende totale tumorvolumer, det levedyktige delen av svulsten er større i VEGF189- enn i VEGF165-overekspresjon tumorer. Dette innebærer også at VEGF189-indusert microvessels fungere bedre enn VEGF165-indusert mikrokar i å opprettholde levedyktigheten av tumorer.
Klinisk en forbindelse har blitt funnet mellom ekspresjonen av VEGF forskjellige isoformer i humane tumorer og forskjellige egenskaper og clinicopathological pasientenes prognose. Tokunaga
et al.
[14], [41] har vist at i kolon kreftpasienter, tumorer med VEGF189 mRNA-ekspresjon har en høyere forekomst av levermetastaser, høyere involvering av årer, og er forbundet med en pasient dårligere prognose enn de som mangler VEGF189 mRNA uttrykk. I vår egen studie [15] og andre [14] – [16], [41], [42], høy tumor uttrykk for VEGF189 var signifikant korrelert med store svulster, avansert klinisk stadium, og systemisk metastaser, og var et selvstendig prognose faktor i kolorektal, nyrecelle, og ikke-småcellet lungekreft. I tillegg, Tokunaga
et al.
[17] har vist at VEGF189 ekspresjon er assosiert med den økte xenotransplantability av human spiserørskreft i huden hos mus. I den foreliggende undersøkelse, DCE-MRI avslørte en høy perfusjon og permeabilitet funksjon av tumor microvessels, og SSCE-MR viste en meget høy tetthet av små microvessels som penetrerer fra tumor felgen til kjernen i VEGF189-overekspresjon tumorer. Disse karakteristika for tumor angiogenese kan tilveiebringe en god tilførsel av næringsstoffer og O
2 for tumorvekst, og de høypermeable, tette microvessels kan lette kreftcellemetastase. Disse spesifikke funksjonelle og strukturelle kjennetegn ved VEGF189-indusert tumor angiogenese kan bidra til den rapporterte økning tumorgenese, høy forekomst av systemisk metastase, og uønskede prognosen for pasienter og den høye xenotransplantability av humane kreftformer som overuttrykker VEGF189 [14] – [17], [ ,,,0],41], [42].
en tradisjonell metode som brukes for å evaluere tumor angiogenese er en histologisk teknikk som kalles MVD telling i deler av vevsprøver.
