Abstract
Plasma, den fjerde tilstand av materie, er definert som en delvis eller fullstendig ionisert gass som omfatter en blanding av elektroner og ioner. Fremskritt i plasmafysikk har gjort det mulig å bruke ikke-termisk atmosfærisk trykk plasma (NTP) i kreftforskning. Imidlertid har tidligere undersøkelser rettet hovedsakelig mot apoptotisk celledød kreft mediert ved NTP som en potensiell kreftbehandling. I denne studien undersøkte vi effekten av NTP på invasjon eller metastase, samt mekanismen som plasma induserer anti-migrerings og anti-invasjons egenskaper i humane papillære skjoldbruskcancercellelinjer (BHP10-3 og TPC1). Sårtilheling, pull-down, og Transwell analyser viste at NTP redusert celle migrasjon og invasjon. I tillegg induserte NTP morfologiske endringer og cytoskeletal rearrangementer, som detektert ved scanning elektronmikroskopi og immunocytokjemi. Vi undersøkte også matriks-metalloproteinase (MMP) -2 /-9 og urokinase-type plasminogen aktivator (uPA) aktivitet ved anvendelse av gelatin zymografi, uPA-analyser og RT-PCR. FAK, Src, og paxillin uttrykk ble oppdaget ved hjelp av Western blot analyser og immunocytochemistry. NTP redusert FAK, Src, og paxillin ekspresjon, så vel som MMP /uPA-aktivitet. I konklusjonen, NTP hemmet invasjon og metastasering av BHP10-3 og TPC1 celler ved å redusere MMP-2 /-9 og uPA aktiviteter og omorganisere cytoskjelettet, som er regulert av FAK /Src kompleks. Disse funnene tyder på nye tiltak for NTP og kan hjelpe i utviklingen av nye terapeutiske strategier for lokalt invasive og metastatisk kreft
Citation. Chang JW, Kang SU, Shin YS, Kim KI, Seo SJ, Yang SS, et al. (2014) Ikke-Thermal atmosfærisk trykk Plasma hemmer Thyroid Papillary Cancer Cell invasjon via cytoskeletal Modulation, Altered MMP-2 /-9 /uPA aktivitet. PLoS ONE 9 (3): e92198. doi: 10,1371 /journal.pone.0092198
Redaktør: Jian Cao, Stony Brook University, USA
mottatt: 13 november 2013; Godkjent: 19 februar 2014; Publisert: 25 mars 2014
Copyright: © 2014 Chang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Bio Medisinsk Technology Development Program av NRF finansiert av den koreanske regjeringen (2012M3A9B2052870). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Keunho Lee er administrerende direktør i PSM America Inc., dedikert som teknisk konsultasjon på enheten, og dette endrer ikke vår tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Thyroid papillær karsinom er en av de vanligste kreftformen i verden og viser generelt lat karakter [ ,,,0],1]. Imidlertid kan det noen ganger være aggressive, med ekstrakapsulær spredning, stropp muskel, tilbakevendende laryngeal nerve, og tracheal invasjon, så vel som metastaser til lymfeknuter. I sjeldne tilfeller kan skjoldbruskkjertelen papillær kreft metastaserer til lungene eller bein [2], [3]. Tilstedeværelsen av lokale eller fjernmetastaser påvirker tumorresidiv, pasient overlevelse og livskvalitet, og dermed føre til dårlig prognose [4]. Derfor er det nødvendig å finne nye måter å hindre aggressive trekk ved invasjon og metastasering i skjoldbruskkjertelen papillær kreft.
Plasma medisin er en raskt voksende felt som involverer en ny behandlingsform [5], [6]. Forskjellige plasmakilder og plasma-enheter brukes for en rekke indikasjoner, inkludert desinfeksjon [7], sårheling [8], blodkoagulering [9], og cancercelledød [10]. Dessuten har teknologiske fremskritt tillater generering av plasma ved romtemperatur og atmosfæretrykk (ikke-termisk plasma-atmosfærisk trykk, NTP) [10] – [12]. NTPs har blitt rapportert å ha anti-kreft-aktivitet i forskjellige vev, inkludert lungekreft [5], kolorektal kreft [10] – [12], og melanom [13], som tyder på en ny antitumor terapeutisk modalitet. I tillegg vår gruppe tidligere viste at NTP ga vekst arrest og forsinket tumorinvasjon i kolorektal kreftceller [10], [11]. Imidlertid har den anti-kreft mekanisme av NTP i hovedsak fokusert på apoptose-relaterte mekanismer med økt reaktive oksygenarter eller redoks-ubalanser [14].
tumorinvasjon til omgivende vev eller metastasering til fjerntliggende organer er den dominerende årsak dødelighet hos pasienter med kreft [15]. Derfor er det lagt vekt på å hemme kreft invasjon og metastasering. Mange linjer med bevis viser at en kompleks prosess av gjensidig avhengige trinn, inkludert cellemigrering, invasjon, overflate adhesjon, og degradering av den ekstracellulære matriks (ECM), er nært beslektet med tumorinvasjon og /eller metastase og er regulert av ekstremt kompliserte mekanismer [ ,,,0],16]. Tidligere har vi foreslått at NTP behandling redusert celle migrasjon og invasjon i kolorektal kreft celler [10]. Imidlertid er mekanismene som er involvert i den plasma-indusert inhibering av cellemigrering og invasjon ikke fullt ut forstått.
Hensikten med denne studien var å undersøke de inhiberende virkninger av NTP på migrering og invasjon av human thyroid kreft celle linjer. Så langt vi kjenner til, er dette den første studien evaluere anti-kreft effekt av NTP på celle migrasjon og invasjon forbundet med cytoskeletal modulasjon og endringer av matriksmetalloproteinase (MMP) -2 /-9 /urokinasetype plasminogen aktivator (uPA ) aktiviteter.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og reagenser
de menneskelige skjoldbrusk papillær carcinoma cellelinjer BHP10-3 og TPC1 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas , VA, USA). Den normale skjoldbruskcellelinje Nthy-ori 3-1 ble velvillig presentert av prof. Minho Song (Chungnam National University, Korea). BHP10-3 og Nthy-ori 3-1 celler ble holdt i RPMI 1640 medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA), mens TPC1-celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium /Ham «s næringsblanding F-12 (DMEM /F12; Gibco ), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 U /ml penicillin-streptomycin (Gibco). Cellene ble holdt ved 37 ° C med 5% CO
2 under fuktede forhold.
Eksperimentelle systemspesifikasjoner
Som beskrevet tidligere [11], vi designet og produsert en spray-type NTP-system med en nyutviklet bue-fri og antistatisk plate som gir en jevn plasmastråle for biomedisinsk forskning. Dette systemet viser høy effektivitet for overflatemodifisering av bio-prøver ved lave temperaturer, noe som er avgjørende for biologiske eksperimenter.
De tekniske spesifikasjonene for plasmasystemet ( «lommelykt med spray-type») er vist i figur . 1A og B. Spesifikasjonene for strømforsyningen for dette systemet er 2 kV minimum, 13 kV maksimum, og en gjennomsnittlig frekvens på 20-30 kHz; Disse spesifikasjonene kan variere med typen og mengden av gass som brukes. I denne studien, helium (He) og oksygen (O
2) ble anvendt som bæregasser fordi vi tidligere har funnet at tilsetning av O
2 til en han plasma effektivisert kreftcellen hemming [10]. Den emisjonsspektra av plasmaet i henhold til kraften som brukes i denne undersøkelsen (2 eller 4 kV) er vist i fig. 1B.
(B) Optisk emisjonsspektra av He og O
2 gassblanding plasma i henhold til den elektriske intensitet (2 eller 4 kV) i området på 280-920 nm. (C) Bilde av «lommelykt med spray-type» plasma jet med han og O
2. Den synlige plasma hadde en lengde på ca. 2,5 cm som varierte med gasstrømmen og spenning.
Scanning elektronmikroskopi (SEM)
For SEM,-celler ble dyrket på dekkglass og løst i 1 time ved romtemperatur i 4% paraformaldehyd i fosfat-bufret saltvann (PBS) (pH 7,2). Objektglassene ble behandlet som tidligere beskrevet [17]. Cellene ble undersøkt ved hjelp av en scanning elektronmikroskop. (S-4800, Hitachi, Tokyo, Japan) opererer på 10 eller 15 kV
Cytoskjelett farging
Celler ble høstet og re-belagt på fibronektin -belagte Dekk. Etter 24 timer ble cellene fiksert i 20 minutter i 3,7% formaldehyd og re-hydratisert i PBS med 0,1% Triton X-100. Etter blokkering i 45 minutter med PBS som inneholdt 5% BSA, ble platene inkubert med Texas Red-konjugert phalloidin (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Hoechst 33258 ble innført i counterstain kjernene. Skinnene ble analysert ved bruk av fluorescens mikroskopi (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).
Pull-down-analyser (RhoA, Rac1, og Cdc42 GTPase aktiveringsanalyser)
For ytterligere å bestemme effekten av NTP på morfologiske endringer som påvirker cellevandring, ble en RhoA /Rac1 /Cdc42 Aktivering analyse Combo Biochem Kit (Cytoskjelett Inc., York, UK) brukes i henhold til produsentens instruksjoner med 600 mikrogram total protein. I korte, rhotekin-RBD effektor domene affinitet perler ble brukt til å binde aktiv RhoA, og PAK-PBD effektor domene affinitet perler ble brukt til å binde aktiv Cdc42 og Rac1. Etter inkubering i 2 timer, ble proteinene eluert med Laemmli-buffer og separert på 12% akrylamid /bis-akrylamid-geler. Negative og positive kontroller ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. For å bekrefte tilstedeværelse av GTPases i celleproteinekstrakter, ble 5% inndatakontrollene også kjøre på geler. De gels ble overført til nitrocellulosemembraner, som ble inkubert over natten med antistoffer mot Cdc42, Rac1, og RhoA (inkludert i pakken) med forsiktig risting. Proteinene ble påvist ved anvendelse av et forbedret kjemiluminescens kit Western blotting.
Sårtilheling assays
For cellemigrerings analysene, ble cellene sådd ut i 12-brønners kulturplater ved en tetthet på ca. 1 x 10
5 /brønn og dyrket til konfluens. Sårheling analyser ble utført som tidligere beskrevet [10]. I korte trekk, ble monolaget skrapet med en steril pipette, etterfulgt av omfattende vasking for å fjerne cellulært avfall. Cellene ble deretter eksponert for gass (He eller O
2-only), 2 eller 4 kV av NTP, henholdsvis i 1 s. Sårtilheling forhold ble dokumentert ved fotografering etter 24 timer siden doblingstidene for BHP10-3 og TPC1 var 30,0 ± 1,2 t og 29,7 ± 0,8 h, henholdsvis. Doblingstidene ble beregnet ut fra den cellevekstkurve over tre dager som følger: (t
2: siste tid t
1: innledende tid, q
2: endelige cellenummer, q
1 : initial cellenummer)
Western blot-analyser
Cellene ble lysert i lyseringsbuffer inneholdende 150 mM NaCl, 1,0% NP-40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris ( pH 8,0), og protease-inhibitor cocktail (pH 7,4; Roche Applied Science, Wien, Østerrike) som tidligere beskrevet [18]. Følgende antistoffer ble benyttet for Western blotting: anti-focal vedheft kinase (FAK), -Src, -Paxillin, -extracellular signalregulert kinase (ERK), -Akt, og -α-tubulin (1:1000, Cell Signaling Technology , Danvers, MA, USA).
Immunocytochemistry
Cellene ble dyrket på objektglassene (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) og behandlet med gass (Han + O
2 ) bare, 2 eller 4 kV av NTP, respektivt. Etter 24 timer ble platene vasket med PBS, fiksert i 20 minutter i 3,7% formaldehyd, og re-hydratisert i PBS. Etter blokkering i 45 min i BSA (i 5% PBS), lysbildene ble inkubert i 1 time med polyklonalt kanin-anti-p-FAK og-paxillin antistoffer (1:50; Cell Signaling Technology), vasket med PBS, og inkubert i 45 min med Alexa 488-merket geit anti-kanin antistoffer (1:250, molekylære prober). Etter skylling i PBS, ble Hoechst 33258 tilsatt i 15 min for å counterstain kjernene. Platene ble vasket med PBS og montert med Vectashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) og deretter analysert ved hjelp av fluorescens mikroskopi (Carl Zeiss).
Invasion (Transwell) analyser
Transwell (24-brønns) kamre (Costar, Cambridge, MA, USA) ble anvendt for å vurdere celle invasjon ifølge NTP behandling som tidligere beskrevet [10]. Til å begynne med fibronektin (2 ug /filter) ble oppløst i 100 ul MEM og helt over i den øvre delen av polyetylen filter (porestørrelse, 8 um) ble belagt .De brønner over natten i en laminær strømningshette.
Deretter 10
5-celler (i 100 ul vekstmedium) ble tilsatt til toppen av filter i den øvre brønnen. Kammeret ble inkubert i 24 timer i 5% CO
2 ved 37 ° C. Til slutt ble festet celler i den nedre seksjon farget med H . E, og tellet ved hjelp av lysmikroskopi
Revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra homogenisert celler ved anvendelse av TRIzol-reagens (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA). ReverTraAce qPCR RT masterblanding (Toyobo Co. Ltd., Osaka, Japan) ble brukt til å transkribere revers-RNA. Total RNA (1 ug) ble blandet med 10 ug av blandingen. Revers transkripsjon ble utført og cDNA ble syntetisert. CDNA ble tilsatt til en blanding av Quick Taq HS DyeMix (Toyobo Co. Ltd.) og spesifikke primere, og forsterket ved hjelp av en T100 ™ Thermal Cycler (Bio-Rad, Waltham, MA, USA). De matriks-metalloproteinase (MMP) -2 og MMP-9 Primersekvensene var: MMP-2-F, 5′-ACC TGG ATG CCG TCG TGG AC-3 «; MMP-2-R, 5»-TGT GGC AGC ACC AGG GCA GC-3 «; MMP-9-F, 5»-GGG GAA GAT GCT GCT GTT CA-3 «; og MMP-9-R, 5′-GGT CCC AGT GGG GAT TTA CA-3».After denaturering i 3 minutter ved 94 ° C, Prøvene ble amplifisert for 35 sykluser på 30 sek ved 94 ° C, 60 ° C, og 72 ° C, med en 5-minutters forlengelse ved 72 ° C. Produktene ble separert ved elektroforese i 1,5% agarosegeler og påvist ved anvendelse av ultrafiolett lys (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Zymografi
MMP-2 /-9-aktiviteten ble analysert ved å bruke gelatin zymografi som tidligere beskrevet [19]. BHP10-3 og TPC1 celler ble behandlet med gass (He + O2) bare, 2 eller 4 kV av NTP i 1 s, og inkubert i ytterligere 24 timer. Supernatanten (100 pl) av hver prøve ble blandet med 1 pl 100 mM 4-aminophenylmercuric acetat, og prøvene ble aktivert i 1 time ved 37 ° C. Deretter ble hver prøve anbringes i prøvebuffer i 10 minutter og underkastet elektroforese i polyakrylamidgeler ved 125 V i 120 minutter ved 4 ° C ved anvendelse av et Novex Xcell II-system (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Gelene ble inkubert i renatureringsbuffer i 60 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av inkubasjon i 18 timer i 100 ml utvikle buffer ved 37 ° C med lys risting. Gelene ble deretter farget i 3 timer med Coomassie brilliant blue. Etter avfarging i 400 ml metanol, 100 ml eddiksyre og 500 ml destillert vann, ble bilder som er tatt ved hjelp av en bildeanalysator.
urokinase-type plasminogen aktivator (uPA) assays
BHP10-3 og TPC1cells (3000 celler /brønn) ble tilsatt til 96-brønners plater i fullstendig medium inneholdende 10% FBS. Etter inkubering over natten, ble cellene behandlet med gass (He + O
2) bare, 2 eller 4 kV av NTP, respektivt. Platene ble deretter inkubert i ytterligere 24 timer. Cellene ble deretter bearbeidet som tidligere beskrevet [19]. I korthet ble cellene vasket med DMEM som mangler fenol rød og plassert i 200 pl reaksjonsbuffer inneholdende 50% (v /v) på 0,05 U /ml plasminogen i DMEM (uten fenolrødt), 40% (v /v) av 50 mM Tris-buffer (pH 8,2), og 10% (v /v) av 2,25 mM kromozym PL i 100 mM glycin. Blandingene ble inkubert i 3 timer ved 37 ° C i 5% CO
2. Absorbansen ved 405 nm ble målt ved anvendelse av en automatisert spektrofotometrisk plateleser.
Statistiske analyser
Én-veis analyse av varians (ANOVA) etter post hoc Tukey test ble utført ved anvendelse av SPSS 20,0 statistisk programvare ( SPSS, Chicago, IL, USA). Parametere av data fra tre uavhengige forsøk er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. En
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant (*
P
0,05; **
P
0,01; ***
P
. 0,001)
Resultater
NTP induserer endringer i mobilnettet morfologi i menneskelige skjoldbruskkjertelen papillær kreft celler
de overlevende celler som festet til overflaten etter NTP behandling utstilt en forskjellig morfologi (fig. 2A og B). Thyroid papillær cellene normalt vokse i en flat mønster, preget av mange cytoplasma anslag (lamellipodia og filopodia) [20]. Etter NTP behandling, cellene viste en helt annen morfologi som var preget av en mindre og innleide utseende, og redusert cytoplasmatiske microspikes resulterer i begrenset celle spredning (Fig. 2A).
(A) Etter behandling med gass ( han + O
2) bare, 2 eller 4 kV av NTP i 1 s henholdsvis cellene ble inkubert i 24 timer. Morfologien av begge cellelinjer ble så undersøkt ved hjelp av lysmikroskopi. I kontroll og gass bare-behandlede grupper, cellene var flatt og langstrakt, med lamellipodia (stjerne) og filopodia (pil) som etablerte celle-celle-kontakter sideveis. I kontrast til NTP-behandlede celler viste morfologiske forandringer preget av en kontrakt cytoplasma, hemmet celle-til-celle kontakt, og opphevet cytoplasmatiske anslag (lamellipodia og filopodia). (B) SEM bilder bekreftet effekten av NTP på celle morfologi. Cytoplasma av NTP-behandlede celler viste svinn og tap av horisontal polarisering og cytoplasmatiske fremspring. Dessuten er overflaten av cellene behandlet med plasma var grovere enn den i kontrollgruppen og gass bare-behandlede celler. (C) immunfluorescens analyser ved anvendelse av Texas Red-konjugert phalloidin ble utført for å visualisere cytoskjelettet (F-aktin); Hoechst 33258 ble brukt til å merke cellekjerner. I kontroll og gass behandlede-celler, ble kontraktile aktin legg (stress-fibre) og en diagonal aktin filament nettvare dannet. Men i NTP-behandlede grupper ble aktin filamenter fordelt i den sammentrukkede cytoplasma ødelegge arkitektur av cytoskjelettet, og ingen markert spenning fiberdannelse ble bemerket. Scale bar = 50 mikrometer. Hver figur var representative for tre forsøk med tre paralleller.
Scanning elektronmikroskopi av begge cellelinjene bekreftet ovennevnte funn som styrer og gass bare-behandlede celler viste mesenchymale-lignende funksjoner med mange cytoplasmatiske anslag. I motsetning til dette NTP-behandlede celler hadde mer kompakt cellelegemer og grov celleoverflatene i hvilken de utstikkende cytoplasmiske prosesser var tilsynelatende redusert (fig. 2B).
NTP induserer en feilregulert cytoskeletal arkitektur i human thyroid papillære kreftcellene
Vi brukte immunocytokjemi mot intracellulære aktin filamenter med fargestoff-konjugert phalloidin og fant at den aktin cytoskeletal struktur av plasma-behandlede celler ble endret. I kontroll og gassbehandlede celler, ble kontraktile actin bunter (stress-fibre) og en diagonal aktin filament meshwork notert. Imidlertid aktin filamenter ble fordelt i den sammentrukkede cytoplasma, og dermed ødelegge arkitektur av cytoskjelettet, og ingen markert spenning fiberdannelse ble observert i NTP-behandlede celler (Fig. 2C).
NTP hemmer aktiviteten av Rho GTPases (RhoA, Rac1 og Cdc42)
Rho familien av GTPases er godt kjent for sitt engasjement i cellulære funksjoner som celle polaritet, lamellipodia eller filopodia formasjon, og cellemigrasjon. Derfor, undersøkte vi effekten av NTP på Rho familien (RhoA, Rac1, og Cdc42) aktivitet. Som vist på fig. 3, NTP behandling betydelig redusert de aktive formene av RhoA og Rac1.
Rho familie (Rho, Rac1, og Cdc42) aktivitet ble evaluert ved hjelp av rullegardin detection kits etter eksponering for gass (han + O
2) bare, 2 eller 4 kV av NTP for 1 s. NTP behandling av BHP10-3 og TPC1 cellene betydelig redusert ekspresjon av GTP-RhoA og GTP-Rac1 (de aktive former av disse proteinene). Hver figur var representative for tre forsøk med tre paralleller.
NTP hemmer cellevandring gjennom FAK /Src kompleks i human thyroid papillær kreft celler
For å undersøke om NTP reduserer tumorcellemigrasjon, bunnen til lukking av sår analyser ble utført. Som vist på fig. 4A og B, våre resultater viser at plasma behandling undertrykte betydelig migrasjon av BHP10-3 (
P
0,01) og TPC1 (
P
0,001) celler over hele ribbet sonen. Den prosentvise inhibering av cellulær migrasjon var 48,2 og 55,4% i BHP10-3 celler og 63,6 og 84,1% i TPC1 celler etter 24 timer inkubasjon med 2 og 4 kV av NTP, henholdsvis, sammenlignet med kontrollceller. Gass eneste behandling hadde ingen betydelig innvirkning celle migrasjon i begge linjer.
(A) BHP10-3 og TPC1 celler ble sådd ut i 12-brønners plater, dyrket til konfluens, og monolaget ble såret med en pipette tips. Sårtilheling ble dokumentert av fotografering etter 24 timer inkubasjon. Scale bar = 200 mikrometer. (B) Kvantifisering av celle migrasjon. NTP vesentlig hemmet migrasjon av BHP10-3 (
P
0,001) og TPC1 (
P
0,001) celler over hele ribbet sonen. Dataene representerer middelverdi ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. NS, ikke signifikant; **
P
0,01, ***
P
. 0,001
For å ytterligere evaluere effekten av NTP på cellemigrasjon, vi evaluert protein lysater for fosforyleringen av FAK, Src, og paxillin, som er kjent for sin nære tilknytning til cellemigrering, invasjon, og cytoskeletal omleiring via FAK /Src kinase-komplekset [21]. Etter NTP behandling, vi har observert hemming av FAK-fosforylering og en konsekvent reduksjon i fosforylering av Src og paxillin, som er nedstrøms av FAK (Fig. 5A).
(A) Western blotting for p-FAK, p-Src og p-paxillin. Immunocytokjemisk analyse for (B) p-FAK og (C) p-paxillin. I kontroll og gass behandlede-celler, ble FAK lokalisert i små adhesjons strukturer på celle periferien. Etter NTP behandling, ble FAK fokal opphopning signifikant redusert i begge cellelinjer. Videre p-paxillin farging ble samlokalisert med p-FAK farging. NTP behandling også redusert p-paxillin uttrykk. Scale bar = 50 mikrometer. Hver figur var representative for tre forsøk med tre paralleller.
Vi analyserte også den intracellulære fordeling av fosforylert (p-) FAK og fosforylert (p) paxillin. I kontroll og gass bare-behandlede celler, p-FAK akkumulert i veldefinerte soner, herunder cellens omkrets, mens etter NTP behandling, ble p-FAK-farging betydelig redusert (fig. 5B). Ko-lokalisering av signalene for p-paxillin og p-FAK ble observert (fig. 5B og C).
NTP inhiberer celle invasjon ved å redusere MMP-2 /-9 og uPA-aktivitet, og Akt og ERK signalering i human thyroid papillære cancerceller
Tidligere undersøkelser har vist at FAK regulerer celle invasjon, så vel som migrasjon, overlevelse, og metastase i en rekke celletyper, inkludert skjoldbruskkjertelen [22], [23]. For å undersøke om NTP reduserer tumorinvasjon, ble invasjons analyser utført ved hjelp av Transwell kamre og Matrigel. Tumorinvasjon krever nedbrytning av basalmembran og ECM, cytoplasmisk forlengelse, og cellemigrasjon. Transwell analyser etterligne dette miljøet for tumorinvasjon. De vedlagte cellene i den nedre seksjon passert gjennom filteret i kammeret, noe som indikerer invaderende celler. Som vist på fig. 6A, H 0,001). (Fig. 6B)
(A) BHP10-3 og TPC1 celler ble sådd på filtre (porestørrelse, 8 um) belagt med Matrigel i det øvre kammeret og eksponert i He + O
2-gass bare, 2 eller 4 kV av NTP i 1 s. Etter 24 timer ble cellene i porer eller celler festet til undersiden av membranen tellet, og de celler som er festet til den nedre seksjon ble farget med H E og telt ved bruk av lys-mikroskopi (x 200). Scale bar = 100 mikrometer. (B) Kvantifisering av invasjonen analysedata. NTP behandling betydelig redusert antall BHP10-3 (
P
0,001) og TPC1 (
P
0,001) celler som penetreres membranen. Dataene representerer middelverdi ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0,001
For å forstå den mekanismen som NTP støt tumorinvasjon
in vitro
, gelatin zymografi for MMP-2 /-9-aktivitet ble utført. Våre resultater viste en merkbar reduksjon i MMP-2 /-9 aktivitet når BHP10-3 og TPC1 celler ble behandlet med NTP i 1 s (Fig. 7A). For ytterligere å identifisere påvirkning av NTP på MMP’er, ble RT-PCR benyttes for å evaluere mRNA ekspresjon av MMP-2 /-9. Som vist på fig. 7B, NTP behandling markert hemmet MMP-2 /-9 mRNA uttrykk. Disse funnene antyder at NTP hemmet celle invasjon ved å redusere transkripsjonen av MMP-2 /-9 og inhibere aktiviteten av eksisterende enzym. NTP inhiberte også uPA aktivitet som demonstrert av uPA-analyser (fig. 7C).
(A) Gelatin zymografi for MMP-2 /-9. NTP attenuert MMP-2 /-9 enzymatisk aktivitet i begge cellelinjer. (B) RT-PCR for MMP-2 /-9. MRNA nivåene av MMP-2 /-9 sank etter NTP behandling i begge celler. Hver figur var representative for tre forsøk med tre paralleller. (C) uPA-analyser. NTP behandling redusert uPA aktivitet betydelig. Dataene representerer middelverdi ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. NS, ikke signifikant, **
P
0,01, ***
P
0,001. (D) Western blotting. ERK og Akt-ekspresjon ble signifikant redusert etter NTP behandling i en intensitetsavhengig måte. Hvert tall var representativt for tre eksperimenter med triplikater.
Til slutt ble protein ekspresjon av Akt og ERK undersøkt ved hjelp av Western blotting. NTP behandling hemmet Akt og ERK uttrykk i begge cellelinjer i forhold til kontroll eller gass eneste gruppen (Fig. 7D).
Diskusjoner
Vår nåværende data indikerer at NTP utøves en anti-tumor effekt ved å hemme kreft celle migrasjon og invasjon. NTP er en lovende og voksende modalitet i kreftforskning, og vi tidligere rapportert at anti-kreft effekt av NTP formidles gjennom en vekst arrestasjon og celledød [10], [11]. Imidlertid er det første kontaktpunkt mellom en NTP og cellene cellemembranen, som inneholder forskjellige proteiner som utfører dynamiske funksjoner. Derfor, i denne studien har vi fokusert på endringer i celle utseende som skjedde på celleoverflaten etter NTP behandling. Våre data viser at plasmabehandlet skjoldbrusk kreft celler mistet sin flat, spindel-formet horisontal polarisering og hadde gått ned cytosoliske anslag, som er viktig for cellulær mobilitet og miljø sensing, mens cellene ikke viste signifikant apoptose av NTP behandling (Supplementary fig . S1). Disse aktin-baserte mobilfremspring, kalt lamellipodia (aktin filament meshwork) og filopodia (radialt orienterte aktin filamenter), er kontrollert av Rho familien små GTP-bindende proteiner (Rho-GTPases, RhoA, Rac1, og Cdc42) [24]. Disse svært regulerte proteiner også styre mesenchymale-lignende polarisering av celler og cytoskeletal rearrangements, som er det første skrittet i migrasjon [24]. Vi bekreftet induksjon av morfologiske endringer av NTP gjennom farging av cytoskjelettet, som avslørte aktin fiber omorganisering. Til sammen vår migrasjon og pull-down analysedata indikerer at plasma effektivt hemmet BHP10-3 og TPC1 celle migrasjon, og dermed knyttet celle morfologiske endringer cytoskeletal omorganisering.
FAK er en ikke-reseptor tyrosin kinase som lokaliserer ved fokale sammenvoksninger. FAK mRNA og protein uttrykk er økt i de aller fleste av invasive og metastatiske svulster, inkludert menneskelige skjoldbruskkjertelkreft [25]. Imidlertid er FAK knapt påvisbar i normale vev eller ikke-invasive tumorer [25] – [28]. Dessuten er det en av de mest fremtredende fosforylerte proteiner i skjoldbruskkjertelen papillær kreft celler [29]. Studier har vist at FAK fremmer cellemigrering gjennom kompleksdannelse med Src, og påfølgende fosforylering av cytoskeletal adaptermolekylet paxillin av FAK /Src-komplekset [30]. I tillegg er paxillin forbundet med Cdc42 /Rac target effektor, som kan koble Cdc42 og Rac til andre kinaser og nedstrøms mål [31], [32]. FAK er også kjent å regulere cellemigrering ved modulering av montering og demontering av aktin cytoskjelettet gjennom dens virkning på Rho familien av små GTPases [33], [34]. Resultatene av denne undersøkelse er i overensstemmelse med disse tidligere studier fordi vi funnet at NTP signifikant inhiberte cellemigrasjon ved å undertrykke ekspresjon av FAK /Src-komplekset og paxillin signalering, som er relatert til cytoskeletal regulering.
I tillegg til sine godt karakterisert rolle i cellemigrering, er FAK signale relatert til tumorinvasjon av en rekke mekanismer [35], [36]. For eksempel, spiller MMP /uPA systemet en viktig rolle i ECM degradering og er avgjørende for å tilrettelegge tumor migrasjon og invasjon under metastase [37]. Derfor, undersøkte vi effekten av NTP på tumorcelleinvasjon og den FAK og MMP /uPA-systemet. Forholdet mellom FAK og MMP-2 /-9 pathway er tidligere blitt undersøkt [22], [38]. FAK inhibering har vist seg å redusere MMP-9 sekresjon i carcinoma celler [39]. I tillegg uPA bindes til urokinase-plasminogen-aktivator-reseptoren aktiverer omdannelsen av plasminogen til plasmin. Aktivert plasmin formidler konvertering av pro-MMP til MMP. Derfor er MMP /uPA inhibering nært knyttet til redusert invasivitet av kreftceller. I denne studien resultatene med zymografi og RT-PCR viser at NTP behandling indusert reduksjon i MMP-2 /-9 uttrykk og sine aktiviteter, også. Disse dataene var i samsvar med tidligere publiserte studier der uttrykk for pro-MMP-2 /-9 og deres enzymaktivitet er nært korrelert med ondartede og /eller metastatisk fenotype av kreft [40] – [42]. Tatt sammen, vår nåværende resultater viser at NTP senker effektivt kreftcelle invasivitet via MMP-2 /-9 /uPA-system, som er forbundet med Akt og ERK signalings. Tidligere data viste at MMP /uPA-systemet er regulert gjennom PI3K-Akt og /eller ERK /p38 signalings [22], [43], [44].
Vi undersøkte også effekten av NTP i normal skjoldbruskcellelinje (Nthy-ori 3-1). NTP behandling fremkalte ikke signifikant apoptotisk celledød på normale skjoldbrusk celler (Utfyllende fiken. S2 og S3). Videre, i motsetning til tumorcellene, normale skjoldbrusk-celler viste ingen signifikant morfologiske forandringer (Supplementary fig. S4) og reduksjon i cellemigrering etter NTP behandling (Supplementary fig. S5) som tyder på forskjellig sensitivitet til NTP behandling mellom kreftceller og normale thyroid celler. Disse resultatene er i overensstemmelse med tidligere studier, som rapportert selektiv anticancer effekten av plasma-behandling [5], [45]. av tre uavhengige eksperimenter. Scale bar = 50 mikrometer.
