Abstract
Nye bevis knytter avvikende aktivering av Hedgehog (Hh) signaliserte med patogenesen av flere krefttyper, inkludert medulloblastoma, glioblastom, melanom samt bukspyttkjertel, tykk- og prostata karsinom. Her undersøkte vi rolle av transkripsjonsfaktoren Gli1 i eggstokkreft. For å oppnå dette, ble uttrykket profilen til Gli1 undersøkt i normale eggstokker, ovarietumorer og eggstokkreft cellelinjer, og
in vitro
effekter av en bestemt Hh-pathway blocker, KAAD-cyclopamine, eller en bestemt Gli1 inhibitor (GANT58) på celleproliferasjon og på Hh mål genuttrykk ble også vurdert. Resultatene som ble oppnådd viste at epitelceller i ovarian cancer vev uttrykker betydelig høyere nivåer av atom Gli1 enn i normalt ovarievev, hvor proteinet var nesten umulig å oppdage. I tillegg multivariat analyse viste at kjernefysisk Gli1 var uavhengig assosiert til dårlig overlevelse i avanserte serøs eggstokkreft pasienter (HR = 2,2, 95% KI 1,0 til 5,1, p = 0,04).
In vitro
eksperimenter demonstrerte Gli1 uttrykk i de tre eggstokkkreft cellelinjer som ble testet, A2780, Skov-3 og OVCAR-3. Bemerkelsesverdig, selv om KAAD-cyclopamine førte til nedsatt celleformering, denne behandlingen hemmet ikke pinnsvin målgenet ekspresjon i noen av de tre eggstokk-kreft-cellelinjer, noe som tyder på at inhibering av celleproliferasjon ble en uspesifikk eller toksisk virkning. I tråd med disse data, ble ingen forskjeller på celleformering observert når cellelinjer ble behandlet med GANT58. Totalt sett, våre kliniske data støtter rollen Gli1 som en prognostisk markør i avansert serøs eggstokkreft og som en mulig terapeutisk mål i denne sykdommen. Men våre
in vitro
funn synliggjøre behovet for valg av passende eksperimentelle modeller som nøyaktig representerer menneskelig svulst for å teste fremtidige behandlinger som involverer Hh pathway hemmere
Citation. Ciucci A, De Stefano jeg, Vellone VG, Lisi L, Bottoni C, Scambia G, et al. (2013) Uttrykk for den Glioma-Associated Oncogene homolog 1 (Gli1) i Advanced Serous eggstokkreft knyttet til ugunstige Total overlevelse. PLoS ONE 8 (3): e60145. doi: 10,1371 /journal.pone.0060145
Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: 07.11.2012; Godkjent: 22 februar 2013; Publisert: 28 mars 2013
Copyright: © 2013 Ciucci et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer er en av de viktigste årsakene til. død i kvinnelige malignitet i de aller fleste utviklede land [1]. Faktisk, siden denne sykdommen har noen symptomer på tidlige stadier av utviklingen, de fleste kvinner er diagnostisert etter den primære svulsten har allerede spredning; til tross for den første responsen til kirurgisk debulking og førstelinjebehandling med carboplatin og paclitaxel fleste svulster etter hvert utvikle resistens og 5-års overlevelse er generelt under 30% [2]. Selv om mange forsøk har blitt gjort for å avklare etiologi av eggstokkreft kreftutvikling og de molekylære mekanismene som er involvert i spredning av ovarialcancer celler, forblir denne sykdommen blant de mindre forstått av store menneskelige kreftformer.
Sonic pinnsvin (Shh) signal -transduction vei er viktig i å regulere mønster, spredning, overlevelse og vekst av mange celler og vev, i embryoet og voksen. Binding av sekretorisk Hh ligander (Sonic, indisk, eller Desert, SHH, IHH eller DHH) til deres transmembrane reseptor Lappet (Ptch1) starter den klassiske Hh signalveien ved å slippe glattet (Smo) fra Ptch1 avhengig undertrykkelse. Smo modulerer en cytoplasma kompleks som inneholder lyddemper av Fused (Sufu), og dermed aktivere 3 glioma-forbundet (Gli) transcriptional regulatorer. Gli1 induserer og Gli3 undertrykker Hh målgener med
Gli1
,
PTCH1
,
Cyclin D1
,
c-myc
, og
BCL -2
, mens Gli2 kan fungere enten i en positiv eller negativ måte avhengig posttranskripsjonelt og posttranslational prosesserings hendelser [3].
Aberrant aktivering av Hh signal har vært innblandet i flere kreftformer, blant annet hud, hjerne , colon, lunge, prostata, blod og bukspyttkjertel blant andre, drevet enten av en ligand avhengig eller en ligand-uavhengig reaksjonsvei [4], [5]. Ligand avhengige Hh veien kan enten være autokrint, hvor Hh ligand produsert av kreftceller handle på nabotumorceller forårsaker celle-autonome vei aktivering, eller kan innebære en parakrint mekanisme hvor Hh ligand skilles fra Epitel signaliserer den underliggende stromal rommet for å skape en gunstig mikromiljøet som støtter tumorvekst. Autokrin signalering er sett i tilfelle av lunge og prostata cancer, mens i tilfelle av ovarial og tykktarmskreft den parakrin mekanisme virker utbredt [4], [5]. I den ligand-uavhengige signalering, blir Hh veien aktiveres i en celle-indre måte gjennom tap-av-funksjon mutasjoner i negativ-virkende komponenter, for eksempel Ptch1 og Sufu, eller gjennom gain-of-funksjon mutasjoner i positiv-virkende komponenter , slik som Smo [4]. Dessuten samhandler HH-Gli signalering med andre signalveier i toveis og kontekstspesifikke måter, og flere linjer med bevis tyder på at kontekstavhengig regulering av Gli koden ved onkogener og tumor dempere gir grunnlag for bred involvering av Gli1 i kreft hos mennesker, dette proteinet støtte tumorprogresjon og metastatisk overgang [6], [7]. Bemerkelsesverdig i eggstokk-kreft, HH-reaksjonsveien kan også reagerer med østrogensignalisering i et komplekst nettverk modulere den fenotypiske plastisitet [8].
I den foreliggende studie forsøkte vi å bestemme hvorvidt Hh-veien aktiveres in ovarian kreft. For å oppnå dette må vi først undersøkt immunohistochemically uttrykk for Gli1 protein i normal eggstokk overflaten epitel og i avanserte serøs eggstokkreft og korrelert sitt uttrykk med clinicopathological parametere og pasientutfall. Deretter undersøkte vi uttrykket av Gli1 i eggstokkreft cellelinjer, og
in vitro
effekter av en bestemt hedghehog vei blocker, KAAD-cyclopamine [9], [10] eller en bestemt Gli1 hemmer, GANT58 [ ,,,0],11], på celleproliferasjon og på pinnsvin målet genuttrykk. Gli1 er faktisk ansett som den ultimate, og dermed avgjørende transkripsjonen aktivator av Hh veien; sin transkripsjon er indusert av Hh signalering, noe som gjør det, så langt, den beste pålitelig markør for en aktiv vei, konsekvent transkriberes Hh-responderende celler [7]. Dessuten Gli1 har vært ansett som et egnet mål for kreftbehandling, fordi det er nedstrøms av flere signalveier [12].
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien innhentet godkjenning fra etisk komité i katolske universitetet i Sacred Heart, Roma, Italia og pasienter ga skriftlig samtykke til vev innsamling og analyser.
pasienter
studien inkluderte 56 pasienter med avansert serøs eggstokkreft innlagt på gynekologisk onkologi Unit, katolske universitetet i Roma, mellom mars 2000 og desember 2008. makroskopisk og histopathologically normale eggstokker, fjernet for forebyggende årsaker ble også innhentet fra 12 postmenopausale kvinner. Clinicopathological kjennetegn ved den generelle serien er oppsummert i tabell 1. I henhold til standard retningslinjer, ble maksimal kirurgisk forsøk forsøkt i alle pasienter som resulterer i fullstendig reseksjon (resttumor 0 mm) i 35 (63%) tilfeller. Alle pasientene fikk platina-basert kjemoterapi (75-100 mg /m
2 for cisplatin, AUC = 5 for carboplatin, per syklus). Femti pasienter (89,3%) fikk også paclitaxel (135-175 mg /m
2 for hver syklus). Tilbakefall av sykdom ble definert i henhold til GCIG CA125 kriterier [13], [14] og /eller radiologisk bekreftelse av tumorprogresjon. Å definere kjemosensitivitet, brukte vi den vanlige definisjonen av platina motstand, definere som «følsomme» pasienter som fikk tilbakefall 6 måneder eller mer etter tidligere platina-holdig kjemoterapi, og som «motstandsdyktig» pasienter som fikk tilbakefall mindre enn 6 måneder etter kjemoterapi ble stoppet, eller som utviklet seg under behandling [15]. Oppfølgingsdata var tilgjengelig for alle 56 pasienter (median oppfølging, 35 måneder, rekkevidde, 9-127 måneder). I løpet av oppfølgingsperioden, ble observert progresjon og død av sykdommen i 42 og 23 pasienter, henholdsvis.
Immunohistochemistry
Immunohistochemistry ble utført som tidligere beskrevet [16]. I korthet, ble antigenet gjenfinning prosedyre utføres av mikrobølgeovnen oppvarming i citrat-buffer (pH = 6). Seksjoner ble inkubert med 20% normalt geiteserum i 30 minutter ved romtemperatur for å redusere ikke-spesifikk binding. Celler som uttrykker Gli1 (klone H-300, sc-20687, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, fortynning 1:50), ble identifisert etter inkubasjon over natten ved 4 ° C. Antistoff som brukes i den foreliggende undersøkelse ble testet for spesifisitet som tidligere beskrevet [17] – [20]. Seksjoner ble inkubert med sekundært antistoff (geite-anti-kanin) i 30 min, ved romtemperatur. Glassene ble utviklet med diaminobenzidine (DAB underlaget System, DakoCytomation), kontra med Mayers hematoxylin, dehydrert i etanol og xylen, og endelig montert. Basalcellekreft ble anvendt som en positiv kontroll. Beising uten primært antistoff ble anvendt som en negativ kontroll.
Evaluering av Immunhistokjemisk farging
Ekspresjon ble evaluert ved å vurdere den prosentandelen av celler som oppviser immunologisk reaksjon i et minimum av 500 histologisk identifiserte neoplastiske celler. Gli1 farging ble observert både i cytoplasma og i kjernen i ovarian carcinoma celler. Men som Gli1 er en transkripsjonsfaktor, ble bare atom Gli1 uttrykk scoret for senere dataanalyser og korrelasjonsstudier. Farging ble evaluert av to uavhengige observatører (GFZ og VGV) som var uvitende om pasientenes diagnose. For å definere en cut-off verdi for Gli1, sammenlignet vi atom immunoreaktivitets målt i normal versus tumorvev. Immunreaktivitet var fraværende i epitelceller hos alle bortsett fra én normale eggstokker, med én enkelt prøve som viser en svak farging reaksjon i omtrent 10% av cellene. Tumor delene der 10% av cellene ble farget ble dermed anser for å være positiv
Cell Kultur
ovarialcancer cellelinjer A2780, Skov-3 og OVCAR-3 ble kjøpt fra. Europa Innsamling av cellekulturer (ECACC, Salisbury, UK). OVCAR-3 og A2780 celler ble dyrket i RPMI 1640 medium (Lonza, Basel, Sveits), ble SKOV-3 dyrkes i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Lonza). Mediet ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Lonza), 2 mM glutamin og antibiotika (100 mg /ml streptomycin og 100 IE /ml penicillin) (Lonza). Alle kulturer ble holdt ved 37 ° C under en fuktig atmosfære med 5% CO2 og 95% luft.
Immunocytochemistry
celler (2,0 til 4,0 x 10
4 celler /brønn) ble belagt i to-brønn kammer lysbilde (Nunc® Lab-Tek® II Chamber Slide, Nunc, Inc., Naperville, IL). Cellene ble dyrket i 24 timer og anvendt for immunfarging. Objektglassene ble vasket to ganger med PBS, fiksert med 4% paraformaldehyd og permeabilisert med 0,5% Triton X-100. Den endogene peroksidase ble blokkert med 3% H
2o
2 i 5 min. Etter vasking to ganger med PBS, ble cellene inkubert med en blokkerende oppløsning inneholdende 20% normalt hesteserum i PBS i 30 minutter ved romtemperatur. Overskudd av blokkerende oppløsning ble drenert, og prøver ble inkubert med en 1:50 fortynning av anti-Gli1 antistoff (klon H-300, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology) over natten ved 4 ° C i et fuktet kammer. Prøvene ble deretter skylt tre ganger med PBS og inkubert med sekundært antistoff, EnVision System-HRP (Dako, Carpinteria, CA) i 30 minutter ved romtemperatur. Den immunoreaktivitets ble oppdaget ved hjelp av 3,3′-diaminobenzidin substrat (DAB underlaget System, Dako). Skinnene ble kontra med Mayers hematoxylin, dehydrert i etanol og xylen, og endelig montert.
Proliferation Assay
A2780 (3,0 × 10
4 per brønn), OVCAR-3 (2,0 x 10
4 per brønn) og SKOV-3 (2,0 x 10
4 per brønn) celler ble sådd i 24-brønns plater i fullstendig kulturmedium. Etter inkubering over natten, ble mediet endret til 2% FBS inneholdende forskjellige konsentrasjoner av KAAD-cyclopamine (Santa Cruz Biotechnology), eller GANT58 (Calbiochem, San Diego, CA). Stoffer ble oppløst i absolutt DMSO og fortynnes i passende kulturmediet umiddelbart før bruk. Kontrollceller mottok den samme mengde av DMSO fortynningsmiddel. Etter 48 timer inkubering ble cellene høstet ved trypsinering, og levedyktige celler ble telt ved bruk av Nucleocounter (Chemometec, Allerød, Danmark). Alle forsøkene ble utført minst tre ganger in duplo.
MTT-analysen
alle ovarie cancer cellelinjer ble sådd ut (4,0 x 10
3 per brønn) i 96-brønners plater i fullstendig kulturmediet. Etter inkubering over natten, ble mediet endret til 2% FBS inneholdende forskjellige konsentrasjoner av KAAD-cyclopamine (Santa Cruz Biotechnology) eller GANT58 (Calbiochem). Cytotoksisitet ble kvantifisert ved måling av reduksjonen av MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5- difenyltetrazoliumbromid, en tetrazol) for å produsere en mørk blå formazanprodukt. MTT ble tilsatt til hver brønn 48 timer etter begynnelsen av fornærmelse. Etter 3 timer inkubasjon ble Solubilisering /stoppløsningen tilsatt til kulturbrønnene for å oppløse formazanet produkt, og absorbansen ved 570 nm registrert ved hjelp av et 96-brønners plateleser (Victor 1420, Wallac, Perkin Eimer). Alle forsøkene ble utført minst tre ganger in duplo.
Western Blot analyse
Hel-celle-ekstrakter ble fremstilt etter lyse i en buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,2 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 10% glyserol tilsatt fosfat og proteaseinhibitorer. Like mengder protein (50 mikrogram /prøve) ble separert ved SDS gradient polyakrylamidgelelektroforese (4-20%) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), overført til PVDF membraner (Immobilon-P overføring membran, Millipore, Billerica, MA). Membranene ble blokkert i 1 time med 5% (vekt /volum) fettfri tørrmelk i Tris-buffret saltvann inneholdende 0,1% Tween 20 (TBST) og inkubert med primære antistoffer (Gli1: H300, Santa Cruz Biotechnology; p-actin: A5441, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i TBST med 3% ikke-fett tørrmelk, ved 4 ° C over natten. Etter vasking tre ganger med TBST, ble membranene merket med pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur. Spesifikke proteiner ble visualisert med ECL Western blotting system i henhold til produsentens instruksjoner (Pierce Bioteknologi, Rockford, IL). β-aktin Western blot analyse ble utført som en kontroll av lik prøven lasting.
mRNA analyse i Real Time PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av Total RNA isolering NucleoSpin RNA II (MACHEREY-NAGEL GmbH Co KG) og ble reverstranskribert ved hjelp RETROscript kit (Ambion®, Life Technologies Invitrogen, Carlsbad, California), i henhold til produsentens protokoll. For å evaluere kvantitative endringer i Gli1 mRNA-nivåer ble hver RT-reaksjonsblandingen deretter utsatt for sanntids-PCR (Q-PCR) ved anvendelse av følgende sykkel betingelser: 35 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 20 s; glødning og forlengelse ved 60 ° C i 20 s; bruker Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Grønn QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA, USA). PCR-reaksjoner ble utført i en 20 ul reaksjonsvolum i en MX3000P sanntid PCR maskin (Stratagene). PCR-primere for detektering av spesifikke transkripter var som følger: Gli1, 5′-GCCAGCCAAGAGAGACCAACAG-3 «og 5′-CCGACAGAGGTGAGATGGACAG-3′; β-aktin-5»-ACG TTG CTA TCC AGG CTG TCC AT-3 «og 5′-TTA ATG TCA CGC ACG ATT TCC CGC-3». Relative mRNA konsentrasjoner ble beregnet ut fra take-off point of reaksjoner (terskel syklus, Ct) ved hjelp av komparative kvantifisering metoden utføres av Stratagene programvare og basert på -ΔΔCt metoden. Denne analysen er tilnærmet en gitt prøve mål-mRNA (Gli1) nivå i forhold til middelverdien for mål-mRNA-nivåer i ubehandlede kontroller ( «kalibrator» verdi), for således å tillate statistisk analyse av avvik fra middelverdien selv blant kontrollene. Ct-verdier for β-actin uttrykk fungert som en normaliserende signal. I hver analyse ble PCR effektivitet også beregnes ved hjelp av seriefortynning i en forsøksprøve; effektivitet verdier mellom 80 og 100% ble funnet for hver primer sett og tatt hensyn til den komparative kvantifisering analyse.
Statistical Analysis
uttrykk for Gli1 og sin tilknytning til clinicopathological parametre ble evaluert med Mann-Whitney-parametrisk test. Sykdomsfri overlevelse og total overlevelse ble beregnet fra datoen for diagnose til datoen for progresjon /død, eller den datoen sist sett. Den prognostiske Effekten av de forskjellige parametere for klinisk utfall (f.eks tilbakefall eller død av sykdom) ble testet ved å plotte overlevelseskurver ifølge Kaplan-Meier-metoden, og sammenligning av grupper ved bruk av log rank test, så vel som ved multivariat analyse ved anvendelse av Cox-modellen . Kaplan-Meier overlevelses estimatene ble samlet inn dato for histologisk diagnose til tidspunktet for den siste oppfølging eller død. I univariat analyse ble hver parameter kategorisert for senere statistisk analyse. Bare variabler med p-verdi ≤0.2 i univariate analysen ble inkludert i multivariat modell. Resultatene oppnådd i
in vitro
eksperimenter ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD og ble analysert ved to-halet t-test. Forskjeller ble betraktet som signifikant hvis P≤0.05. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism5 programvare (San Diego, California, USA). Cox analyse ble utført ved hjelp av Statplus 2009.
Resultater
Gli1 Expression i Avanserte Serous eggstokkreft
En totalt 56 primær avanserte serøs eggstokkreft og 12 normale eggstokkene vev fra postmenopausale kvinner ble evaluert. Gli1 immunreaktivitet var fraværende i den flate epitel, så vel som i stromale celler, av de normale eggstokkene (fig. 1A) i alle unntatt ett tilfelle, denne siste viser en svak nukleær farging i omtrent 10% av cellene. En positiv kjernereaksjon ble observert i 29% av serøse karsinomer (figur 1B.); cytoplasma immunoreaktivitets ble også observert i de fleste prøvene ble undersøkt. Disse funnene tyder på at Hh signalveien er aktivert i ovarialcancer celler sammenlignet med normale epitelceller.
Representative bilder for Gli1 farging viser uttrykk i normal eggstokk epitel (A), og høy (B) eller lav (C ) uttrykk i eggstokkreft vev. Basalcellekreft ble anvendt som positiv kontroll (D). Forstørrelse 20x og 40x. (E) Kaplan-Meier-overlevelseskurve for sannsynligheten av sykdomsfri overlevelse og (F) samlet overlevelse i henhold til ekspresjonen av atom Gli1 i avanserte serøse kreftpasienter eggstokkene. Positiv ( 10%) Gli1 uttrykk i kjernen er signifikant assosiert med total overlevelse ulempe (p = 0,04)
Tabell 2 viser median atom immunoreaktivitets av Gli1 i avanserte serøs kreftpasienter eggstokkene i henhold til. clinicopathological parametre. Ingen sammenheng ble påvist mellom atom Gli1 uttrykk og noen av parametrene som ble undersøkt.
prognostisk rolle Gli1 uttrykk for både DFS og OS ble testet i univariate og multivariate analyser justert for clinicopathological parametere. Univariat modell av DFS oppdaget ikke noen sammenheng mellom Gli1 uttrykk og klinisk utfall (tabell 3, fig. 1E). På den annen side, ved hjelp av Kaplan-Meier-analysen fant vi at pasienter med positiv Gli1 uttrykk hadde en ugunstig prognose total overlevelse; median total overlevelse i denne populasjonen var 35 måneder, mens det forble udefinert for negativ-Gli1 pasienter, som mer enn 50% av dem var fremdeles i live ved tidspunktet for analyse (P = 0,04) (tabell 4, figur 1F). Spesielt i den multivariate modellen, Gli1 atom uttrykk beholdt en uavhengig negativ prognostisk rolle for OS (p = 0,04, tabell 4).
Klassiske prognostiske faktorer i Avansert Serous eggstokkreft
prognostisk rolle alder ved diagnose, histologisk grad, restsvulst, og kjemosensitivitet for både DFS og OS ble testet i univariate og multivariate analyser (tabell 3 og 4). Tilstedeværelsen av eventuelle gjenværende tumor i primær kirurgi ( 0 mm) [21] og platina-motstand ble funnet å være assosiert med en høyere risiko for tilbakefall av sykdommen, i både univariate (p = 0,003 og p 0,0001, henholdsvis) og multivariate analyser (p = 0,003 og p 0,0001, henholdsvis). Platinum-motstand ble også funnet å være et ugunstig uavhengig prognostisk variabel for OS (p = 0,002).
Gli1 er uttrykt i ovarialcancer Cells
For å undersøke en antatt rolle for Gli1 i eggstokkreft vi først bestemt protein nivå i tre menneskelige ovarialcancer cellelinjer A2780, Skov-3 og ovčar-3. Immunocytokjemisk analyse viste Gli1 nukleær farging i de tre cellelinjer (Fig. 2A). Protein uttrykk var ved bekreftet av western blot analyse ved hjelp av en kommersiell antistoff hevet mot aminosyrer 781-1080 av Gli1 av human opprinnelse (figur 2A). Antistoffet gjenkjent forskjellige former som var nesten synlig i alle cellelinjer: 130 kDa isoform sannsynlig som virker som aktivator, den svake repressoren 100 kd [22], og en ytterligere 70 kDa båndet ennå ikke er identifisert, men også rapportert i ondartet pleural mesothelioma celle kulturer [23].
(A) Tre mennesker ovarialcancer cellelinjer, A2780, Skov-3, og OVCAR-3 ble utsatt for farging med antistoff mot Gli1. Alle tre cellelinjer uttrykke Gli1. Proteinekspresjon ble også bekreftet ved western blot-analyse. p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B) Cellene ble dyrket i 2% FBS medium og behandlet med 2, 5 og 10 uM KAAD-cyclopamine (K) eller GANT58 i 48 timer. KAAD-cyclopamine behandling inhiberer celleproliferasjon i alle tre cellelinjer, mens GANT58 ikke påvirker cellevekst. Vist er celleantall uttrykt som prosent DMSO-behandlede celler (gjennomsnitt ± SD fra tre forskjellige eksperimenter, * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, t-test). (C) Gli1 mRNA ekspresjon ble evaluert ved Q-PCR-analyse in ovarian cancer celler behandlet med 10 uM KAAD-cyclopamine i 48 timer. Data er uttrykt som ganger endring sammenlignet med de respektive kontroll (CTRL), tatt som kalibrator for sammenlignende analyse kvantifisering av mRNA-nivåer. Hver prøve ble målt i tre eksemplarer, ble forsøket gjentatt 2 ganger med lignende resultater. Grafikk viser gjennomsnitt ± SD.
Behandling med KAAD-cyclopamine Hemmer Cell Proliferation of ovariekarsinomer Cells
For å undersøke om det aktiverte Hh veien er viktig for spredning av ovarialcancer celler, A2780, SKOV-3 og OVCAR-3, ble utsatt for økende konsentrasjon av KAAD-cyclopamine, en forbindelse i stand til å hemme både Hh ligand-avhengige og uavhengige sti-aktivering, ved direkte interaksjon med Smo. Direkte telling av levedyktige celler viste at KAAD-cyclopamine induserte en doseavhengig reduksjon av ovarial tumor celleformering (figur 2B). Vurdering av cellelevedyktigheten ved MTT-analyse bekreftet den hemmende effekten av KAAD-cyclopamine på A2780 cellevekst, mens ingen inhiberende effekt ble observert for SKOV-3 og OVCAR-3-celler (fig. S1). En over- eller undervurdering av MTT resultater hvis forhold til celle teller resultatene er allerede rapportert av flere forfattere, de viktigste medvirkende faktorer til dette avviket blir representert av forskjeller i cellestørrelse, celle morfologi, cellevekst (cluster eller enkeltlag) eller mitokondrie aktivitet [24] – [26]
Effekt av KAAD-cyclopamine på Hh Signa
for å bekrefte at reduksjonen av celleproliferasjon
in vitro
av KAAD-cyclopamine. var på grunn av spesifikk hemming av Hh vei, analyserte vi endringen i mRNA og proteinnivåene Gli1 i medikamentbehandlede ovarian carcinoma-cellelinjer. Q-PCR-analyse viste at behandling av A2780, Skov-3 og OVCAR-3 med 10 mm KAAD-cyclopamine ikke signifikant modulere Gli1 nivåer etter 48 timer etter eksponering (Fig. 2C). Mangelen på en effekt av KAAD-cyclopamine på Hh signaleringsaktiviteten ble ytterligere bekreftet ved immunblotting (data ikke vist). Disse dataene antyder at hemming av eggstokkreft spredning
in vitro
av KAAD-cyclopamine er ikke en Smo-mediert hendelse.
Behandling med GANT58 hemmer ikke Cell Proliferation of ovariekarsinomer Cells
for å bekrefte den manglende effekt av Hh sti-modulasjon på ovariecancer celleproliferasjon, A2780, SKOV-3 og OVCAR-3, ble utsatt for økende konsentrasjon av GANT58, en spesifikk Gli1 inhibitor. Resultatene som ble oppnådd viste at GANT58 induserte ikke noen reduksjon i ovarial tumor celleformering (Fig. 2B). Disse dataene ble bekreftet ved MTT-analyse (Fig. S1).
Diskusjoner
Selv om Hh veien aktivering har vært vist i ulike typer kreftformer [5], er det bare noen få rapporter som viser det i menneskelige ovarialcancer prøver [27] – [30], med bare to undersøke prognostisk rolle Hh-signalmolekyler i eggstokkreft. Dessuten resultatene fra disse to studiene var motstridende: Chen og kolleger [27] fant at blant Shh, DHH, ptch, Smo og Gli1, DHH var den eneste faktoren forbundet med overlevelse utfallet, mens i Liao studie [29] undersøke den prognostiske rollen Shh, ptch, Smo og Gli1, sistnevnte var den eneste protein uavhengig assosiert til pasientenes overlevelse. Ingen data er tilgjengelig for øyeblikket som kan hjelpe å forklare dette avviket, selv om det kan være grunn til analyse av ulike befolkningen i form av scenen og /eller svulst histotype. I denne studien undersøkte vi prognostisk rolle Gli1 i en homogen befolkning på avanserte serøse eggstokkreft viser at pasienter med tumorer uttrykke atom Gli1 farging ( 10%) opplever en kortere OS i forhold til negative tilfeller (≤10%). Den uavhengige rolle Gli1 uttrykk som markør for dårlig prognose ble holdt oppe av multivariat analyse, etter justering for resttumor ved kirurgi og kjemosensitivitet. Samlet våre funn ikke bare styrke hypotesen om at Gli1 kan representere en ny viktig prognostisk markør i eggstokkreft, men også foreslå at Gli1-uttrykker svulster dårlig svare på andre linjer terapier, og dermed støtter potensielle terapeutiske nytten av kombinasjoner av Gli-målrettet agent med standard behandling i eggstokkreft pasienter.
i denne sammenheng var vi bedt om å undersøke om det aktiverte Hh veien er viktig for spredning av ovarialcancer celler. For dette formål vi først vurdert ved immunocytokjemisk og immunoblotanalyse ekspresjonen av Gli1 i forskjellige ovarie cancer-cellelinjer, dvs. A2780, SKOV-3 og OVCAR-3, disse studiene avslørende lignende protein ekspresjon i alle 3 cellelinjer undersøkt. Siden cyclopamine hemmer Hh signalisering ved å binde seg til og å forhindre aktivering av Smo [31], ved siden bedømmes vi bidraget av autokrine signalering til tumorvekst ved å studere effekten av dette stoff på
in vitro
celleproliferasjon. Spesielt har vi funnet at selv om denne plante alkaloid induserte en dose-avhengig hemming av celleproliferasjon i de cellelinjer som ble testet, men denne effekten ble ikke korrelerer med en inhibering av Hh signalering, som bedømt ved mangelen på Gli1 modulasjon i behandlede cellekulturer. Disse funnene antyder at inhibering av celleproliferasjon var ikke et resultat av kanonisk Smo-mediert reaksjonsvei Hh-inhibering, men snarere en uspesifikk eller toksisk virkning. I tråd med disse data, ble ingen forskjeller på celleformering observert når cellelinjer ble behandlet med GANT58, en spesifikk Gli1 inhibitor. Spesielt, den manglende respons på SKOV-3 og OVCAR-3 cellelinjer til Hh veien inhibering er i overensstemmelse med tidligere resultater fra våre kunder og andre grupper, ved hjelp av cyclopamine eller en spesifikk inhibitor Gli1 [32], [33]. Videre Kudo
et al
. [34] også nylig viste at behandling med anti-Gli1 shRNA ikke påvirke Gli1 uttrykk i A2780 celler. På den annen side, våre
in vitro
data står i kontrast til studier av Liao
et al
. [29] og Kandala og Srivastava [35] viser at, etter behandling med cyclopamine ble Gli1 ekspresjon redusert i SKOV-3 og OVCAR-3 eller A2780-celler, respektivt. Årsakene til disse motstridende resultater fortsatt uklare, og legger et lag av kompleksitet til arbeidet som er utformet for å tilskrive eggstokkreft tumorvekst av overdreven Hh aktivitet. Selv om de kan være på grunn av forskjeller i eksperimentelle systemer (for eksempel cellelinjer som er utsatt for genotypisk og fenotypisk drift under kontinuerlig kultur) og /eller analysefremgangsmåter, er det også tenkelig at de faktisk kan reflektere heterogenitet av autokrin og parakrin signalisering i eggstokkreft . I denne sammenheng er det verdt å merke seg at, i tillegg til farging av epiteliale kreftceller, vi også observert sporadisk atom ekspresjon av Gli1 i den omkringliggende stroma (data ikke vist), dette funn tyder på en cellulær interaksjon mellom stroma og epitel, med mulig forekomst av parakrint signalering. Dessverre, på grunn av den begrensede stroma komponent vanligvis forbundet med høy grad av lesjoner, var vi ikke i stand til å fastslå omfanget av Gli1 uttrykk i svulstens mikromiljø, og flere studier er nødvendig for å bedre avklare rollen parakrint Hh signalisering i eggstokkreft.
Egentlig tilsvarende avvik i eksperimentelle resultater har også blitt rapportert i andre tumorer, så som prostata, pankreas, og tykktarm [36], [37]. Yauch og medarbeidere [38] har gjort en interessant observasjon at Smo-antagonist-formidlet vekstinhibering av et stort antall kreftcellelinjer av epitelial opprinnelse ikke korrelerer med Hh target genekspresjon i disse cellene, noe som antyder at a) den observerte
in vitro
vekst undertrykkelse kan skyldes off-target effekter når disse forbindelser anvendes ved høye konsentrasjoner, og b) det er en parakrin krav for Hh ligand signalisering i tumorgenese av Hh-uttrykkende kreftformer, med viktige implikasjoner for
