Abstract
Bakgrunn
Nylig , en ny variant av eR-α, ble eR-α36 identifisert og klonet. ER-α36 mangler iboende transkripsjon aktivitet og formidler hovedsakelig nongenomic østrogen signalering. Her studerte vi rollen som nongenomic østrogensignalveier mediert av ER-α36 i tamoxifen motstand og agonist handling.
Metodikk
cellulær lokalisering av ER-α36 ble undersøkt ved immunfluorescens i MCF- 7 celler og Hec1A celler. MCF-7 brystkreftceller, MCF-7-celler som uttrykker rekombinant ER-α36 (MCF-7 /ER36), Hec1A endometrial kreft celler og Hec1A celler med siRNA knockdown av ER-α36 (Hec1A /RNAiER36) ble behandlet med 17β-estradial ( E2) og tamoxifen (TAM) i fravær og nærvær av kinase inhibitor U0126 og LY294002. Vi undersøkte fosforylering av signalmolekyler og uttrykk for c-myc av immunoblotting og tumorcellevekst ved MTT-analyse.
Konklusjoner
ER variant ER-α36 forbedrer TAM agonist aktivitet gjennom aktivering av membran-initiert signalveier i livmorkreft, og at eR-α36 er involvert i
de novo Hotell og ervervet TAM motstand i brystkreft
Citation. Lin SL, Yan LY, Zhang XT, yuan J, Li M, Qiao J et al. (2010) ER-α36, en variant av ER-α, Fremmer Tamoxifen Agonist Handling i livmorkreft cellene via MAPK /ERK og PI3K /Akt Pathways. PLoS ONE 5 (2): e9013. doi: 10,1371 /journal.pone.0009013
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 11. desember 2009: Godkjent: 13 januar 2010; Publisert: 02.02.2010
Copyright: © 2010 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Basic Research Program of China (2006CB504004, 2006CB944005). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tamoxifen er en selektiv østrogenreseptor-modulator (SERM) med blandet agonist /antagonist-aktiviteter som har blitt brukt mye som en effektiv behandling av alle faser av østrogenreseptor (eR) -positivt brystkreft [1]. Tamoxifen undertrykker tilbakefall av brystkreft og reduserer forekomsten av kontralateral brystkreft med 49% [2]. Tamoxifen har også blitt brukt som en Kjemopreventivt middel i kvinner som har høy risiko for brystkreft [3]. Det antas at tamoxifen virker som en antagonist ved å konkurrere med østrogener for ligandbindende domene av ER, for derved å inhibere ER-mediert mitogent østrogensignalisering [4]. Men det største hinderet for å tamoxifen bruk er tamoxifen motstand, noe som skjer
de novo
eller kan bli kjøpt opp etter bruk [5]. I tillegg øker tamoxifen bruk forekomsten av livmorkreft hos postmenopausale kvinner med langtidsbehandling [6]. De molekylære mekanismene bak både
de novo Hotell og ervervet tamoxifen motstand og dens agonist handling i endometrievev er dårlig forstått.
ER tilhører steroid hormon familien til den kjernefysiske reseptor super. Det er overveiende anses at ER virker som en transkripsjonsfaktor som hovedsakelig er lokalisert i cellekjernen [7]. Imidlertid har oppsamling av bevis vist at ER eksisterer også på plasmamembranen og deltar i hurtig østrogensignalisering. Det har blitt rapportert at ER er modifisert ved posttranslational palmitoylation i den ligand-bindende domene som kan bidra til dens membran lokalisering [8]. Association of ER og caveolin-en ble også vist til rette ER lokalisering på plasmamembranen [9]. Caveolin-1 er et strukturelt protein av caveolae og tjener som et stillas protein for å rekruttere signalmolekyler så som vekstfaktorreseptorer, G-proteiner, Src-familie-tyrosin-kinaser og det PI3K [10]. Det ble postulert at østrogen kan raskt aktivere forskjellige signalveier, inkludert MAPK /ERK, fosfolipase C, PI3K /Akt og G protein-koblede reseptor-aktivert baner i caveolae [11].
Nylig har vi identifisert og klonet en ny variant av eR-α med en molekylvekt på 36 kDa som ble navngitt som eR-α36 [12]. Den opprinnelige 66 kDa ER-α ble kåret ER-α66 [13]. ER-α36 transkripsjonen initieres fra en promotor som ligger i den første intron av ER-α66-genet og er generert fra to alternative spleisebegivenheter. ER-α36 protein mangler således ligand-avhengig og-uavhengig trans domene (AF-1 og AF-2), men den beholder DNA-bindende domene og delvis dimerisering domene og ligandbindende domener [12]. ER-α36 har en unik 27 aminosyre domene ved den C-terminale som erstatter de siste 138 aminosyrene som kodes for av eksonene 7 og 8 av ER-α66 genet. Vår forrige rapport viste at 17β-østradiol og SERM som tamoxifen kan indusere aktivering av MAPK /ERK sti og stimulere cellevekst gjennom membran-assosiert ER-α36 [14]. Vi har derfor antatt at ER-α36 kan være forbundet med den agonist-aktivitet av tamoxifen. I den foreliggende rapport, studerte vi ER-α36 funksjon i ER-positiv MCF-7 brystkreftceller og Hec1A endometrial kreft celler, og undersøkt bidraget fra den MAPK /ERK og PI3K /akt reaksjonsveier mediert av ER-α36 til agonisten virkningen av tamoxifen i livmorkreft.
Resultater
eR-α36 uttrykkes på plasmamembranen i MCF-7 og Hec1A Cells
eR-α36 er en roman variant av ER-α66 generert av alternativ arrangøren bruk og alternativ spleising [12]. For å undersøke ER-α36 ekspresjon i MCF-7-celler og Hec1A-celler, ble Western blotting-analyse utført ved anvendelse av ER-A36 spesifikt antistoff mot de unike 20 aminosyrer ved C-terminalen i ER-α36. ER-α36 uttrykkes i begge cellelinjer (Fig. 1A, venstre). Imidlertid Western blot-analyse kunne ikke påvise ER-α66 ekspresjon i Hec1A celler (Fig. 1A, til høyre), i samsvar med det Hec1A er en ER-negativ cancercellelinje [15]. For å undersøke cellulære lokalisering av ER-α36, ble immunfluorescens analyse utført. I begge cellelinjer, immunofluorescens farging viste en intens plasmamembranen fordelingsmønster (fig. 1B). Caveolae er invaginated mikrostrukturer på plasmamembranen hvori caveolin-en tjener som et stillas for å danne protein signaleringskomplekset. Som vist på fig. 1C, caveolin-1 ble først og fremst uttrykt på celleoverflaten (rød). Sammenslåtte bilder av ER-α36 og caveolin-en viste betydelige samlokalisering signaler (gul) på plasmamembranen.
a, uttrykk for ER-α36 og ER-α66 protein i MCF-7 og Hec1A celler . Proteinekstrakter ble fremstilt fra MCF-7 og Hec1A celler og benyttet for Western blot-analyse. B, Lokalisering av ER-α36 i MCF-7 og Hec1A celler. Celler dyrket på Dekk ble fikset og immunofluorescently farget med en bestemt anti-ER-α36 antistoff (grønn). Cellene ble kontra med Hoechst 33258 (blå). C, Samlokaliseringen av ER-α36 og caveolin-en på plasma membran av Hec1A celler. Grønn: ER-α36; Red: caveolin-1; blå: kjernekraft; gul, samlokalisering signaler. Bar, 10 mikrometer. D, Time-retters analyse av ER-α36 uttrykk i Hec1A celler. Hec1A celler ble behandlet med 2 uM Tam for angitte tidspunkter. Nivåer av proteinekspresjon ble normalisert med β-aktin ekspresjon nivå, og hver søyle representerer middelverdi ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler
Deretter analyserte vi ligand-induserte ER-α36 uttrykk.. Hec1A cellelinjer ble behandlet med tamoxifen for ulike tidspunkter og ER-α36 uttrykk ble vurdert av Western blotting-analyse, avsløre at ER-α36 uttrykk ble økt i tamoxifen behandlede celler (Fig. 1 D).
ER-α36 formidler østrogen- og Tamoxifen- stimulert ERK Activation
for å undersøke mekanismen bak den agonist effekt av tamoksifen i livmorkreftceller, bestemte vi oss for å undersøke funksjonen av ER-A36 i tamoxifen behandlet Hec1A celler. Vi først undersøkt fosforylering nivåene av MAPK /ERK, en serin-treonin-kinase som er involvert i celleformering [16]. Som vist på fig. 2A og fig. 2B, E2 eller tamoxifen behandlinger resulterer i hurtig fosforylering av ERK1 /2. Reprobing membranen med en total ERK1 /2 antistoff indikerte at den totale ERK1 /2-innhold ikke ble endret, noe som tyder på at den økede ERK1 /2 fosforylering ikke var forårsaket av øket ERK1 /2 uttrykk.
A og B, Hec1A-celler ble behandlet med 10 nM E2 eller 2 uM Tam for de angitte tidspunkter. Nivåer av ERK1 /2 fosforylering ble målt i proteinekstrakter med Western blot-analyse. Totalt ERK1 /2 ble brukt som lasting kontroll. Hver søyle representerer middelverdi ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler. C og D, ER-α36 uttrykk i Hec1A /V og Hec1A /RNAi celler. Hver søyle representerer middelverdi ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med Hec1A /V celler. E, Hec1A /V og Hec1A /RNAi-celler behandlet med 10 nM E2 eller 2 uM Tam ble analysert for nivået av ERK1 /2-fosforylering med Western blot. Totalt ERK1 /2 ble anvendt som kontroll lasting, og hver søyle representerer middelverdi ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler (-) vs. behandlinger. F, lysater fra Hec1A celler behandlet med DMSO (spor 1, 2 og 3), 10 nM E2 (banene 2 og 5), 2 uM Tam (banene 3 og 6) eller forbehandlet med 10 uM U0126 (kolonnene 4, 5 og 6 ) i 30 min ble analysert med Western blot analyse.
for å teste involvering av ER-α36 i aktivitetene på E2 og tamoksifen observert i Hec1A celler som mangler ER-α66 uttrykk, bestemte vi oss for å banke ned ER-α36 uttrykk med siRNA tilnærming. Vi etablerte stabile cellelinjer som uttrykker shRNA ekspresjonsvektor mot ER-α36 (Hec1A /RNAi celler) og undersøkt ER-α36 uttrykk (Fig. 2C og 2D). Som vist på fig. 2E, E2 og tamoxifen unnlatt å stimulere fosforylering av ERK1 /2 i Hec1A celler med ER-A36 slått ned, noe som tyder på at ER-A36 er reseptoren som medierer aktivitetene til østrogen og tamoxifen.
ekstracellulær regulert kinase kinase (MEK) virker på oppstrømsiden av ERK1 /2 og kan fosforylere og aktivere ERK1 /2 [17]. MEK spesifikk hemmer U0126 effektivt hemmet ERK1 /2 aktivisering stimulert av E2 og tamoxifen (Fig. 2F).
Vi har også etablert stabile cellelinjer fra ER-positive MCF-7 brystkreft celler som konstitutivt uttrykte rekombinant ER -α36 (MCF-7 /ER36-celler) (fig. 3A). I kontrollgruppen MCF-7-celler transfektert med tom vektor, E2 behandling indusert fosforylering av ERK1 /2 (Fig. 3B), som kan oppheves ved tamoxifen (Fig. 3C). Imidlertid tamoxifen indusert fosforylering av ERK1 /2 i MCF-7 /ER36-celler (Fig. 3D). MEK spesifikk inhibitor U0126 effektivt inhiberte ERK1 /2 aktivisering stimulert av E2 og tamoxifen (fig. 3E). Derfor er disse resultatene indikerte at ER-α36 medierer Ras /MEK /ERK-reaksjonsveien indusert av både østrogen og tamoxifen og foreslo at ER-A36 kan være involvert i tamoxifen motstand og til og med fremme agonist handling av tamoxifen.
A , Western blot-analyse av ER-α36 ekspresjon i MCF-7 /V og MCF-7 /ER36-celler. Ekspresjonsnivåer ble normalisert til nivåer av β-aktin, og hver søyle representerer middelverdi ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med MCF-7 /V-celler. B og C, MCF-7 /V celler behandlet med 10 nM E2 alene eller sammen med 2 uM Tam sammen for å få de angitte tidspunkter. Proteinekstrakter ble analysert med Western blot-analyse. Totalt ERK1 /2 ble brukt som lasting kontroll. Hver søyle representerer middelverdi ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med kontrollceller. D, MCF-7 /ER36 celler behandlet med 2 mikrometer Tam for ulike tidspunkt ble analysert for ERK1 /2 fosforylering med Western blot. Ekspresjonsnivåer ble normalisert til nivåer av total ERK1 /2, og hver søyle representerer middelverdi ± SEM (n = 3) *, P . 0,05 i forhold til ubehandlede celler. E, Lysater ble fremstilt fra MCF-7 /ER36 celler behandlet med DMSO (spor 1, 2 og 3), 10 nM E2 (banene 2 og 5), 2 pM av Tam (søyle 3 og 6) eller forbehandlet med 10 uM U0126 (banene 4, 5 og 6) i 30 minutter og immunoblottet med antistoffer mot pErk1 /2 eller total ERK1 /2.
ER-α36 formidler østrogen- og Tamoxifen-stimulert PI3K /Akt Aktivering
det er velkjent at serin /treonin kinase Akt, eller proteinkinase B, spiller en viktig rolle i celle-proliferasjon og overlevelse ved inhibering av apoptose [18]. Vi testet om E2 og tamoxifen behandling induserer også aktivering av Akt reaksjonsveien i Hec1A celler. Behandling av E2 og tamoxifen førte til rask fosforylering av Akt (Fig. 4A og 4B), mens både E2 og tamoxifen unnlatt å indusere Akt fosforylering i Hec1A /RNAi celler (fig. 4C). Tamoxifen også indusert fosforylering Akt i MCF-7-celler som uttrykte rekombinant høyt ER-α36 (fig. 4E). Forbehandling med PI3K-inhibitor LY294002 avskaffet Akt fosforylering stimulert av E2 eller tamoxifen i begge cellelinjer (Fig. 4D og 4F), som indikerer at ER-α36 medierer tamoxifen forårsaket Akt fosforylering gjennom PI3K reaksjonsveien i disse cellene. Således våre data antydet at ER-α36-mediert activaton av PI3K /Akt reaksjonsvei kan også være involvert i resistens og agonist-virkning av tamoxifen.
Hec1A-celler ble behandlet med 10 nM E2 (A) eller 2 uM Tam (B) for de angitte tidspunkter og lysatene ble immunoblottet med et antistoff mot fosforylert Akt. Nivåer av fosforylering ble normalisert til total-protein Akt, og hver søyle representerer middelverdi ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler. C, Western blot analyse av Akt-fosforylering i Hec1A /V og Hec1A /RNAi ER36-celler behandlet med 10 nM E2 eller 2 uM Tam i 10 min. Nivåer av fosforylering ble normalisert til total-protein Akt, og hver søyle representerer middelverdi ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler. #, P 0,05 sammenlignet med E2- eller Tam-behandlede Hec1A /V celler. D, Hec1A celler forbehandlet med 50 uM PI3K-inhibitor LY294002 (LY, Kolonnene 4, 5 og 6) i 2 timer og deretter behandlet med 10 nM E2 (søyle 2 og 5) eller 2 uM Tam (søyle 3 og 6) i 10 min . E, Western blot-analyse av Akt-fosforylering i MCF-7 /ER36 celler behandlet med 2 uM Tam for de angitte tidspunkter. Expression ble normalisert til total Akt, og hver søyle representerer middelverdien ± SEM (n = 3) *, P . 0,05 sammenlignet for ubehandlede celler. F, Lysater ble fremstilt fra MCF-7 /ER36 celler behandlet med DMSO (spor 1 og 2), 2 uM av Tam (sporene 2 og 4) eller forbehandlet med 50 uM PI3K-inhibitor LY294002 (LY, Felt 3 og 4) for to h, og immunoblottet med antistoffer mot fosforylert Akt eller total Akt.
ER-α36 er involvert i regulering av c-myc Protein Expression i Hec1A Cells
protoonkogenet c-myc har dyp mitogene effekter på kreftceller gjennom dens evne til å fremme cellesyklusprogresjon [19]. Antisens-oligonukleotider til c-Myc kan hemme brystkreftceller spredning [20]. Tamoxifen inhiberer østrogenindusert c-Myc-ekspresjon i ER-α66-positiv brystkreft celler. Imidlertid spiller c-Myc en viktig rolle i tamoxifen agonist aksjon [21]. Vi målte uttrykket nivåer av c-myc i Hec1A celler behandlet med E2 eller tamoxifen. Som vist på fig. 5A, behandling med E2 eller tamoxifen indusert c-Myc-ekspresjon i Hec1A /V-celler, men ikke i Hec1A /RNAi ER-α36-celler, noe som kan være effektivt opphevet ved MEK-inhibitor U0126 (fig. 5B) og PI3K-inhibitor LY294002 (fig. 5C).
A, Western blot-analyse av c-myc-ekspresjon i Hec1A /V og Hec1A /RNAi-celler behandlet med 10 nM E2 eller 2 uM Tam i 12 timer. Ekspresjonsnivåer ble normalisert til nivåene av β-aktin, og hver søyle representerer middelverdi ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler (-) vs. behandlinger. #, P 0,05 sammenlignet med Tam-behandlede Hec1A /V celler. B og C, Hec1A-celler ble behandlet i 12 timer med 10 nM E2 eller 2 uM Tam eller sammen med 10 mM av MEK-inhibitor eller U0126 50 uM PI3K-inhibitor LY294002. Nivåer av c-myc ekspresjonen ble normalisert til nivåene av β-aktin, og hver søyle representerer middelverdi ± SEM (n = 3). *, P 0,05 sammenlignet med ubehandlede celler (-) vs. behandlinger. #, P . 0,05 sammenlignet med E2- og Tam-behandlet Hec1A /V celler
ER-α36 formidler Tamoxifen stimulert Cell Proliferation i Hec1A Cells
For ytterligere å studere rollen av eR-α36 in tamoxifen-agonistaktivitet i endometrial kreft celler, ble Hec1A /V og Hec1A /RNAi-celler behandlet med tamoxifen og deres prolifaration ble målt ved MTT-analyse. MTT analyse viste at tamoxifen stimulert veksten av Hec1A /V celler. Imidlertid tamoxifen var i stand til å hemme veksten av Hec1A /RNAi-celler på en doseavhengig måte (fig. 6A). Den celleformering som induseres av tamoxifen ble hemmet av MEK-inhibitor U0126 og PI3K-inhibitor LY294002 (Fig. 6B), noe som tyder på at både MAPK /ERK og PI3K /Akt trasé var involvert i E2 og tamoxifen stimulert cellevekst i endometrial kreft celler.
a, Hec1A celler transfektert med tom uttrykk vektor (Hec1A /V) eller Hec1A cellelinjer hvor ERα36 hadde vært stabilt slått ned av shRNA uttrykk (Hec1A /RNAi) ble belagt 96-brønners plater (3 × 10
3 celler /brønn). Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Tam i medium inneholdende 2,5% dekstran trekull-strippet FBS i 72 timer. MTT-analysen ble utført som beskrevet i
materialer og metoder
. Resultater av tre uavhengige eksperimenter ble gjennomsnitt og middelverdi ± SEM vises. *, P 0,05 sammenlignet med Tam-behandlede Hec1A /V celler henholdsvis. B, Hec1A-celler ble behandlet med 10 nM E2 eller 2 uM Tam sammen med 10 pM av MEK-inhibitor eller U0126 50 henholdsvis uM PI3K-inhibitor LY294002 i 72 timer og analysert ved MTT-analyse. Resultater av tre uavhengige eksperimenter ble gjennomsnitt og middelverdi ± SEM vises. *, P 0,05 sammenlignet med kontrollceller. C, Tom ekspresjonsvektor transfektert MCF-7-celler (MCF-7 /V) eller MCF-7-celler transfektert med ERα36 ekspresjonsvektor (MCF-7 /ER36-celler) ble sådd ut i 96-brønners plater (5 x 10
3 celler /brønn). Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av tamoxifen i medium inneholdende 10% FBS i 72 timer. MTT-analysen ble utført. Resultater av tre uavhengige eksperimenter ble gjennomsnitt og middelverdi ± SEM vises. *, P 0,05 sammenlignet med Tam-behandlede MCF-7 /ER36 celler henholdsvis. D, MCF-7 /V og MCF-7 /ER36-celler ble behandlet med 2 uM Tam sammen med 10 uM U0126 eller 50 uM PI3K-inhibitor LY294002 henholdsvis i 72 timer og analysert ved MTT-analyse. Resultater av tre uavhengige eksperimenter ble gjennomsnitt og middelverdi ± SEM vises. *, P 0,05 sammenlignet med kontroll MCF-7 /V celler
Vi observerte at tamoksifen sterkt inhiberte celleproliferasjon i MCF-7 /V-celler, i overensstemmelse med tidligere rapporter at tamoxifen fungerer som en. potent antagonist i ER-positiv brystcancer MCF-7-celler [22]. Imidlertid, MCF-7 /ER36 celler som konstitutivt uttrykker høye nivåer av rekombinant ER-α36 oppviste ufølsomhet for tamoxifen behandling (Fig. 6C). MEK-inhibitor U0126 og PI3K-inhibitor LY294002 dessuten hemmet veksten av begge cellelinjer (fig. 6D). Disse resultatene antyder igjen at høyt nivå av ER-α36 ekspresjon kan gi resistens mot tamoxifen.
diskusjon
Tamoxifen er en SERM som har blitt mye brukt til å behandle avansert ER-positiv brystkreft og til forebygge brystkreft i høy risiko pre- og postmenopausale kvinner som chemopreventive middel [23], [24]. Imidlertid tamoxifen har også partiell østrogen aktivitet i livmoren som kan føre til endometrial hyperplasi [25]. Langsiktig tamoxifen bruk er assosiert med økt forekomst av livmorkreft [26]. Her rapporteres vi at en ny variant av ER-α, ER-α36, som er sterkt uttrykt på plasmamembranen til Hec1A endometrial kreft celler og i de endometriekreft prøver fra pasienter som var blitt behandlet med tamoksifen i minst tre år. Både E2 og tamoxifen celleproliferering av Hec1A celler antagelig gjennom ER-α36 mediert ikke-genomiske signalveier.
En rekke hypoteser har vært postulert å forklare tamoxifen menn agonist handling i livmorkreftutvikling. Det har vært antydet at reaktive metabolitter av tamoxifen danner DNA-addukter og generere mutagenitet i endometrievev [27]. Det er også blitt vist at AF1 domenet av ER-α66 samt celle- og promoter-spesifikke coactivator rekruttering er involvert i tamoxifen agonist aksjon [28], [29]. Rollen til tamoxifen i livmorkreftutvikling kan benytte tydelig genomisk aktivitet [30]. Nylig, samler bevis antydet at membran-initiert signalveier konferere tamoxifen motstand og agonist handling gjennom ulike kinasekaskader og distinkte andre budbringere [15].
MAPK familien består av ERK, JNK og P38. ERK spiller en avgjørende rolle i cellevekst og spredning. JNK og p38 er involvert i celle-differensiering og apoptose indusert av stress-stimuli så som UV-lys [31], γ stråling [32], [33], DNA-ødeleggende og kjemopreventive midler [34]. Mange onkogene signaliseringsmolekyler aktivere MAPK /ERK-reaksjonsveien [35]. ERK uttrykk er vanligvis økt, og aktiviteten er oppregulert i brystkreft vev sammenlignet med nabo normalt vev [36]. Videre er tamoxifen motstand
in vivo
hovedsakelig skjer ved ikke-genomisk mekanismer. Genomisk østrogen handling virker mindre aktiv [37], [38]. I denne studien fant vi at ER-α36 formidler både E2- og tamoxifen-indusert aktivering av MAPK /ERK sti og ER-α36 overekspresjon i tamoxifen sensitive MCF-7 celler redusert følsomhet for tamoxifen. I tillegg formidler ER-α36 tamoxifen indusert aktivering av MAPK /ERK sti og bidrar til agonist virkningen av tamoxifen i Hec1A livmorkreftceller også. Livmorkreft vev som svært express ER-α36 viste også høye nivåer av ERK-fosforylering.
PI3K /Akt pathway spiller en viktig rolle i cellevekst og overlevelse [39]. Akt aktiveres av mange signalveier, for eksempel overekspresjon av vekstfaktorreseptorer, [40]. Innføring av en konstitutivt aktiv Akt i MCF-7-celler kan indusere tamoxifen motstand ved å beskytte celler fra tamoxifen-indusert apoptose [41]. I tillegg er det Akt-aktivitet dramaticaly økte i tamoxifen- resistente MCF7 celler [18]. I fosforylerte Akt-positive pasienter, har endokrin behandling verre effekt enn i fosforylerte Akt-negative pasienter [42]. I denne undersøkelsen, fant vi ER-α36 mediert tamoxifen-stimulerte aktivering av Akt i celler med høye nivåer av ER-α36 ekspresjon antyder at aktiveringen av PI3K /Akt reaksjonsvei mediert av ER-α36 bidrar til motstand og agonist-virkning av tamoksifen .
c-myc protein er en kjernefysisk transkripsjon faktor som spiller en viktig rolle i cellevekst [43]. Tidligere studier har vist at MAPK /ERK og PI3K /Akt trasé regulere c-Myc-proteinet uttrykk [44], [45], [46]. Vi fant både E2 og tamoxifen induced c-myc uttrykk gjennom ER-α36-mediert aktivering av ERK og Akt. Inkubasjon av Hec1A celler med MEK hemmer U0126 og PI3K inhibitor LY294002 blokkert E2- og tamoxifen- indusert c-myc uttrykk. Derfor, tamoxifen utøver agonist handling gjennom ER-α36-mediert ikke-genomiske veien.
I sammendrag, rapporterer vi her at ER-α36 er uttrykt på plasmamembranen og i cytoplasma av endometrial carcinoma celler. Vi har videre demonstrert at både E2 og fremmet tamoxifen proliferasjon av endometrial kreft celler gjennom ER-α36-mediert aktivering av MAPK /ERK og PI3K /akt trasé og ER-α36 overekspresjon førte til tamoksifen motstand i MCF-7-celler. Våre resultater gir viktig ny informasjon for å videre forstå de molekylære mekanismene som ligger bak agonist virkningen av tamoxifen.
Materialer og metoder
Materialer og reagenser
Alle kjemikalier og reagenser ble kjøpt fra Sigma mindre annet er angitt. Polyklonalt anti-ERK1 /2 antistoff, polyklonalt anti-fosfo-ERK1 /2 antistoff (Thr
202 /Tyr
204), polyklonalt anti-caveolin-1 -TRITC antistoff, monoklonalt anti-c-myc-antistoff, polyklonalt anti-Akt antistoff, monoklonalt anti-ER-α66 (D-12) antistoff og monoklonale anti-β-aktin-antistoff ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Polyklonalt anti-fosfo-Akt (Ser
473) antistoff ble oppnådd fra Signalway antistoff (Pearland, TX). ER-α36 spesifikt antistoff mot de 20 unike aminosyrer ved C-terminalen i ER-α36, ER-α36 ekspresjonsplasmid, ER-α36 shRNA ekspresjonsvektor og den tomme ekspresjonsvektoren ble beskrevet tidligere [12], [14]. U0126 ble kjøpt fra Calbiochem (La Jolla, CA).
cellekultur og cellelinjer
MCF-7 humane brystcancerceller ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA), og human endometrial Hec1A kreftceller ble oppnådd fra Dr. Li-Hui Wei (Peking University Folkets sykehus, Beijing). Begge cellelinjer ble holdt ved 37 ° C med 5% CO
2 i passende kulturmedium. For å etablere MCF-7-celler som uttrykker rekombinant ER-α36, ble cellene sådd ut i en tetthet på 1 x 10
5 celler pr 60 mm skål og transfektert 24 timer senere med en ekspresjonsvektor som drives av cytomagalovirus (CMV) promoteren i pattedyr-ekspresjonsvektoren pCB6 + som beskrevet andre steder [14], ved bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ekspresjonsvektoren inneholder den full-lengde ER-α36 cDNA. Den tomme ekspresjonsvektoren ble også transfektert i celler for å tjene som en kontroll. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble cellene på nytt belagt og valgt med 500 ug /ml G418 i to uker. Mediet ble endret etter tre dager til kolonier dukket opp. Kloner ble utvidet for videre analyse. Kloner med høy ER-α36 uttrykk var en blanding av mer enn tjue kloner og betegnes MCF-7 /ER-α36. En cellelinje med sammenslåtte kloner transfektert med den tomme ekspresjonsvektor ble kalt MCF-7 /V og anvendt som en kontroll.
Vi har også etablert cellelinjer fra Hec1A celler transfektert med en ER-α36 shRNA ekspresjonsvektor (Hec1A /RNAi) og den tomme ekspresjonsvektor (Hec1A /V). Kort fortalt ble ER-α36 shRNA ekspresjonsvektor pRNAT-U6.1 /Neo plasmid som inneholder shRNA mot ER-A36 (GenScript Corp. TX) og den tomme ekspresjonsvektoren transfektert inn Hec1A celler med Lipofectamine 2000 i henhold til produsentens anvisninger. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble cellene på nytt belagt og valgt med G418 (600 ug /ml) i to uker. Kloner ble utvidet for videre analyse.
immunfluorescens og Konfokalmikroskopi
cellulær lokalisering av protein ble bestemt ved indirekte immunfluorescens. Hec1A eller MCF-7-celler dyrket på sterile dekkglass ble fiksert i 4% paraformaldehyd i PBS i 10 min. Etter å ha blitt permeabilisert med 0,4% Triton X-100 ved romtemperatur i 10 minutter, ble cellene blokkert i 4% BSA-PBS tilsatt i 1 time og inkubert over natten ved 4 ° C med anti-ER-α36-spesifikt antistoff. Etter tre vaskinger i PBS ble cellene merket med FITC-konjugert sekundært antistoff. DNA-fargestoff Hoechst 33258 ble brukt for nukleær farging.
For dobbelt farging av ER-α36 og caveolin-1, etter at ER-α36 farging og vask i PBS ble cellene blokkert i 4% BSA-PBS supplert i 1 time ved romtemperatur. Etter inkubasjon med anti-caveolin-1-TRITC-antistoff over natten, ble cellene ytterligere vasket i PBS og farget med Hoechst 33258. Mikroskopiske analyser ble utført ved anvendelse av en Confocal laser scanning mikroskop (Zeiss LSM 510 META, Tyskland).
Semi-kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert ved TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens anvisninger. Total RNA (1,6 pg) ble anvendt for fremstilling av den første kjede-cDNA ved revers transkriptase (Takara, Dalian, P.R.China). De følgende primersett ble utviklet for amplifikasjon av human ER-α36 (BX640939, 1145-1434 bp): forover, 5′-CAAGTGGTTTCCTCGTGTCTAAAGC-3 «og omvendt, 5′-TGTTGAGTGTTGGTTGC CAGG-3′; Humant GAPDH mRNA ble amplifisert ved foroverprimeren 5»-ACGGATTTGG TCGTATTGGG-3 «og reversprimeren 5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3».
MTT-analysen
Celleformering ble analysert ved anvendelse av tre – (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5- difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse [47]. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater til en sluttkonsentrasjon på 5 x 10
3 /brønn for MCF-7 /V og MCF-7 /ER36-celler eller 3 x 10
3 /brønn for Hec1A /V og Hec1A /RNAi celler. MCF-7 /V og MCF-7 /ER36-celler ble inkubert i DMEM medium inneholdende 10% FCS med de angitte behandlinger. Hec1A /V og Hec1A /RNAi-celler ble inkubert i fenol rød-fritt medium inneholdende 2,5% dekstran trekull-strippet FCS (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) med de angitte behandlinger. Cellene ble deretter inkubert med MTT (0,5 mg /ml) i 4 timer ved 37 ° C. Etter fjerning av medium inneholdende MTT-reagens, 150 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn. Platene ble avlest ved bølgelengde på 490 nm ved anvendelse av en mikroplateleser (Bioteck POWERWAVE ™, USA).
Western blotting-analyse
Celler ble dyrket i fenol-rød-fritt medium med 2,5% dekstran charcoal- strippet FCS i 48-72 timer og deretter byttet til medium uten serum 12 timer før stimulering av agenter angitt. Cellene ble oppsamlet i iskald PBS, og celleekstrakter ble fremstilt i RIPA-buffer med proteinase inhibitor cocktail fra Sigma (St. Louis, MO). Cellelysater ble kokt med gel-ladningsbuffer i 5 minutter ved 100 ° C, løst i 10% SDS-PAGE, overført til PVDF-membraner, probet med egnede antistoffer og visualisert med forbedret Chemiluminescence (ECL) påvisningsreagenser (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ).
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av parvise prøver
t
-test eller ANOVA etterfulgt av Student-Newman-Keuls testing for å fastslå forskjeller i midler.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Takk
Vi vil takke Dr. Li-Hui Wei for bes gi Hec1A celler.. Vi takker også Dr. Yong-Feng Shang ved Peking University og Dr. Heide Schatten ved University of Missouri for grundig lesning av manuskriptet og gjennomtenkte forslag.
