Abstract
Mange kreftceller vise en CIN (
C
hromosome
I
stabilitet) fenotype, der de viser høy forekomst av kromosom tap eller gevinst på hver celle syklus. Gjennom årene har en rekke forskjellige mekanismer, inkludert mitotisk spindel multipolaritet, cytokinese svikt, og merotelic kinetochore orientering, er blitt foreslått som årsaken til CIN. Imidlertid er en fullstendig teori om hvordan CIN vedvare mangler fortsatt. Vi brukte CIN tykktarmskreftceller som et modellsystem for å undersøke den mulige cellulære mekanisme (r) underliggende CIN. Vi fant ut at CIN cellene ofte sammensatte multipolar spindler tidlig i mitosen. Men multipolar anaphase celler var svært sjeldne, og live-celleforsøk viste at nesten alle CIN celler delt i en bipolar mote. Videre viste fast celle analyse høye frekvenser av merotelically vedlagte lagging kromosomer i bipolar anaphase CIN celler, og høyere frekvenser av merotelic vedlegg i multipolar vs. bipolare prometaphases. Til slutt fant vi ut at multipolar CIN prometaphases vanligvis besatt γ-tubulin i det hele tatt spindel polene, og at en betydelig andel av bipolar meta /tidlig anaphase CIN celler besatt mer enn en sentrosomen på en enkelt spindel pol. Til sammen våre data tyder på en modell der merotelic kinetochore vedlegg kan lett bli etablert i multipolar prometaphases. De fleste av disse multipolar prometafase cellene vil da bi-polarisere før anaphase utbruddet, og de gjenværende merotelic vedleggene ville produsere kromosom mis-segregering på grunn av anafase lagging kromosomer. Vi foreslår dette spindelpolen sammenvoksing mekanisme som en viktig bidragsyter til kromosom ustabilitet i kreftceller
Citation. Silkworth WT, Nardi IK, Scholl LM, Cimini D (2009) multipolar Spindel Pole Coalescence er en viktig kilde til kinetochore mis-vedlegg og kromosom mis-Segregering i kreftceller. PLoS ONE 4 (8): e6564. doi: 10,1371 /journal.pone.0006564
Redaktør: Kevin G. Hardwick, University of Edinburgh, Storbritannia
mottatt: Mai 10, 2009; Godkjent: 03.07.2009; Publisert: 10 august 2009
Copyright: © 2009 Silkworth et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. IKN var en mottaker av en Fralin Summer Undergraduate stipend sommeren 2008 og sommeren 2009. Dette arbeidet ble delvis støttet av NSF gi MCB-0842551 og Thomas F. og Kate Miller Jeffress Memorial Trust gi J-828 til DC. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nøyaktig mitotisk kromosom segregering er nødvendig for å opprettholde en diploid kromosomantall. De fleste kreftceller er aneuploid [1], [2] og Aneuploidy ble foreslått, allerede et århundre siden, for å være en årsak til kreft [3]. I tillegg til dette aneuploid tilstand, mange kreftceller utviser høy forekomst av kromosom mis-segregering (dvs. gevinst eller tap av hele kromosomer) ved hver cellesyklus, en tilstand som omtales som kromosom ustabilitet eller CIN [4] – [6], som bidrar til å opprettholde høye nivåer av Aneuploidy. En rekke studier har forsøkt å identifisere feilen (e) i mitotisk kromosom segregering potensielt ansvarlig for CIN. Tidlige studier antydet defekter i mitotisk sjekkpunkt som den viktigste årsaken til CIN [7]. Imidlertid har senere arbeid vist at de fleste CIN kreftcellene har en robust kontrollpost [8] og deres respons til mitose perturbere behandlinger er undistinguishable fra responsen av ikke-CIN-celler [8], [9]. Cytokinese svikt har også blitt foreslått i fortiden som en mulig årsak til CIN [10], [11]. Imidlertid ville cytokinese svikt produsere en enkelt polyploid dattercelle, og kan ikke forklare CIN, som er definert som det mis-segregering av kromosomene til høyere priser. Som et resultat av CIN produserer både høye nivåer av Aneuploidy og stor variasjon i kromosom kopiantall innenfor populasjonen [4], mens cytokinese svikt vil bare resultere i en dobling av kromosomantall. Dermed cytokinese svikt
per se
kan ikke forklare CIN, med mindre det blir fulgt av andre kromosom mis-segregering hendelser der enkelt kromosomer (snarere enn hele genomet) er mis-segregert. Andre studier antydet multipolaritet som en mulig årsak til CIN [12] – [15] basert på den observasjon at kreftceller fra en rekke områder (anmeldt i [1]) ofte montere multipolar spindler (vanligvis ledsaget av sentrosomen forsterkning). Selv om multipolar kromosom segregering vil sikkert føre til omfattende kromosom mis-segregering, en rekke studier antydet at mange av disse multipolar celler kan gjennomgå en prosess med spindel pol koalesens /clustering [16], [17], som ville hindre den massive kromosom mis -segregation som ville være forbundet med multipolar kromosom segregering. Det er blitt foreslått at dette spindelpolen koalesens mekanisme ville gi en selektiv fordel til celler som Aneuploidy nivåer ellers ville være så alvorlig å resultere i celledød [18], [19]. Endelig har en rekke studier funnet høye frekvenser av anaphase lagging kromosomer (dvs. kromosomer som ikke skille på spindelen pol, men henger etter den spindel ekvator under anaphase) i ulike kreftceller, inkludert muntlige kreftceller [20], [21], menneskelige brystkreft celler [22], [23], ovarialcancer celler [24], og kolorektal kreft celler [22]. En av disse studiene [22] viste også at lagging kromosomer ble merotelically orientert (dvs. ble deres kinetochore bundet til mikrotubuli fra både spindel polene i stedet for bare en). Oppsummert har mange alternative mekanismer for CIN blitt foreslått gjennom årene; er imidlertid en fullstendig teori om hvordan CIN vedvare er fremdeles mangelfull, og det er ikke klart om noen sammenheng mellom noen av disse mekanismene er tilstede.
I denne studien vi brukte CIN tykktarmskreftceller som et modellsystem for å undersøke mulige cellulære mekanismen (e) underliggende CIN. Vi fant ut at CIN cellene ofte sammensatte multipolar spindler tidlig i mitosen, men multipolar anaphases var svært sjelden, og nesten alle CIN celler fordelt på en bipolar mote. Vi fant også at bipolar anaphase CIN celler viste høye frekvenser av merotelically vedlagte lagging kromosomer. Videre er en betydelig fraksjon av bipolar meta /tidlig anafase CIN celler besatt mer enn en sentrosomen ved et enkelt spindelpolen. Til slutt fant vi høye frekvenser av merotelic vedlegg i multipolar prometaphases. Til sammen våre data tyder på en modell der merotelic kinetochore vedlegg kan lett bli etablert i multipolar prometaphases. De fleste av disse cellene vil da bi-polarisere før anaphase utbruddet, og de gjenværende merotelic vedleggene ville produsere kromosom mis-segregering på grunn av anafase lagging kromosomer. Vi foreslår dette spindelpolen sammenvoksing mekanisme som en viktig bidragsyter til kromosom ustabilitet i kreftceller.
Resultater
CIN tykktarmskreftceller har multipolar spindler i prometafase, men ikke i anaphase
kolorektal kreft celler kan deles i to grupper [5], [25], de som utviser CIN, og de som ikke gjør det, tradisjonelt kalt MIN grunn av sine typiske
M
icrosatellite
i
stabilitet. På grunn av denne egenskap, kolorektal kreft celler representerer en spesielt interessant modell for å studere kromosom mis-segregering i kreftceller, fordi MIN celler kan anvendes som en eksperimentell kontroll for CIN celler. For denne studien valgte vi to CIN kolorektal kreft cellelinjer (HT-29 og SW620) og ett MIN kolorektal cellelinje (HCT116). Å identifisere mitotiske defekter potensielt ansvarlige for kromosom mis-segregering i CIN celler, utførte vi farging eksperimenter å merke kinetochores (ved hjelp CREST antistoffer) og mitosetråder (ved hjelp av anti-a-tubulin antistoffer) i CIN og MIN celler. Vi så brukt med høy oppløsning konfokal mikroskopi for å identifisere prometafase defekter i både CIN og MIN-celler (figur 1). Vi fant ut at det mest fremtredende prometafase defekt i CIN celler var spindel multipolaritet og at CIN prometafase celler utstilt multipolar spindler (figur 1A) på frekvenser som var betydelig høyere enn de som finnes i MIN celler (Figur 1b). De fleste av de multipolar spindler oppviste en tre-veis eller tetrapolar morfologi, selv om multipolar celler med 5-8 spindel staver (5,4%, 19,5% og 7,9% av alle multipolar HCT116, HT-29, og SW620, henholdsvis) ble også observert. Vi så på multipolaritet i anafase-celler, og fant at frekvensene av multipolar spindler i anafase CIN-celler var mye lavere enn de som finnes i prometafase (figur 1B). I tillegg var det ingen forskjell mellom MIN og CIN celler i frekvensen for multipolar anaphases (figur 1B).
A. Eksempler på MIN (HCT116) og CIN (HT-29, SW620) prometafase celler immunostained for α-tubulin (rød, venstre kolonne) og kinetochores (grønne, midt kolonne). Alle bildene er maksimal intensitet projeksjoner av stabler av optiske seksjoner ervervet 0.6 mikrometer intervaller gjennom celle Z-aksen. Sammenslåtte Bildene vises i høyre kolonne. For hver cellelinje, er et eksempel på en bipolar prometafase og en av multipolar prometafase vist. Scale bar, fem mikrometer. B. Frekvenser av prometafase og anaphase celler med multipolar spindler. Dataene som vises her representerer middelverdier og standardfeil (barer) av fire uavhengige forsøk. Multipolar CIN prometaphases var signifikant hyppigere enn multipolar MIN prometaphases (χ
2 test, P 0,001 for både HT-29 og SW620 sammenlignet med HCT116). Men multipolar CIN anaphases skjedde ved lave frekvenser som ikke er forskjellig fra multipolar MIN anaphases.
Både CIN og MIN celler deler seg i en bipolar mote, men mitose varer lenger i CIN celler
De lave frekvensene av multipolar spindler i anaphase CIN celler antydet at multipolar prometaphases ikke kan fullføre en multipolar divisjon, men kan i stedet møte ulike skjebner. Noen muligheter inkluderer mitotisk arrest, mitotisk celledød, eller mitotisk glidning. For å bestemme den mulige skjebne (e) av mitotiske CIN kreftceller, utførte vi time-lapse eksperimenter. I hvert eksperiment ble flere synsfelt utvalgt og avbildes ved fasekontrastmikroskopi med en 20 x objektiv på et invertert mikroskop utstyrt med et helautomatisk trinn. Bilder ble kjøpt hvert 30 sek i tre timer. Time-lapse filmer ble deretter analysert for å bestemme varigheten av mitose og skjebnen til cellene inn mitose i løpet av innspillingen. Som forventet fra våre faste celledata (Fig. 1B), vi sjelden observert kromosom segregering å skje i en multipolar mote (figur 2A). I de fleste celler, kromosomer segregert i to grupper på motsatte sider av cellen, og en enkelt cytokinetic fure som dannes mellom dem (Video-S1). Antall celler som utviser multipolar kromosom segregering i vår live-celleforsøk (figur 2A) var ikke signifikant forskjellig (χ
2, P 0,37 for alle tre cellelinjer) fra antall multipolar anaphase celler vi fant i fast celle eksperimenter (figur 1B). I tillegg fant vi at 40-67% av CIN cellene stiller multipolar kromosom segregering ikke klarte å fullføre cytokinese (figur 2A), mens det var ingen tilfeller av cytokinese svikt i celler som utviser bipolar kromosom segregering. Til slutt, vi fant ikke noen indikasjon på vedvarende mitotisk arrest, celledød under mitose, eller mitotisk glidning. Disse data indikerer at det meste av kromosom ustabilitet i CIN celler skal komme fra kromosom segregering defekter i celler som deler seg i en bipolar måte og komplettere celledeling. Våre levende celleforsøk avslørte også at tiden i mitose, målt som tiden som har gått fra starten av celle avrunding til anaphase utbruddet, var signifikant lenger i CIN celler i forhold til MIN celler (tabell 1), på samme måte som hva andre har funnet i andre kreftcellelinjer [26].
A. Frekvenser av cellene stiller multipolar kromosom segregering i fase kontrast time-lapse eksperimenter. B. Frekvenser av bipolar anaphase MIN (HCT116) og CIN (HT-29, SW620) celler med lagging kromosomer. Dataene som vises her representerer middelverdier og standardfeil (barer) av fire uavhengige forsøk. Frekvenser av anaphase henger kromosomer var signifikant høyere i CIN enn MIN celler (χ
2 test, P 0,001 for både HT-29 og SW620 sammenlignet med HCT116). C. Eksempler på MIN (HCT116) og CIN (HT-29, SW620) anaphase celler immunostained for α-tubulin (rød, første kolonne) og kinetochores (grønn, andre kolonne). Bildene er maksimal intensitet projeksjoner av stabler av optiske seksjoner ervervet 0.6 mikrometer intervaller gjennom celle Z-aksen. Flettede bilder er vist i den tredje kolonne. For hver cellelinje, er et eksempel på normal anafase og en anaphase med en etterslepende kromosom vist. Kolonnen helt til høyre viser celler med lagging kromosomer på ett fokusplanet, der kontrasten er forbedret for å markere merotelic tilkoblinger av lagging kromosom kinetochore. Scale bar, fem mikrometer.
Bipolare anaphase CIN cellene har høye frekvenser av merotelically vedlagte lagging kromosomer
Som beskrevet ovenfor, multipolaritet var vanlig i CIN prometafase celler, men det ble sjelden observert i anaphase (figur 1B), og de fleste CIN celler segregert sine kromosomer i en bipolar mote (figur 2A). Dette indikerte at multipolar kromosom segregering er en usannsynlig årsak til kromosom ustabilitet i CIN celler, og foreslo at feil oppstår under bipolar kromosom segregering var den mest sannsynlige årsaken til CIN. Å identifisere slike mulige defekter, brukte vi høy oppløsning konfokalmikroskopi å analysere anaphase celler med immunostained kinetochores og mikrotubuli (Figur 2C). Vi fant ut at bipolar CIN anaphase celler besatt merotelically festet lagging kromosomer (dvs. kromosomer som hang etter den spindel ekvator i stedet for å segregere til spindelen pol, og hvis kinetochore var bundet til å mikrotubulidynamikk bunter fra begge spindel polene i stedet for bare én; Figur 2C , høyre kolonne) ved høyere frekvenser enn MIN celler (figur 2B). Interessant, frekvenser av anaphase celler med lagging kromosomer var svært lik frekvensen av multipolar prometafase celler (sammenligne figur 1B med figur 2B).
Både multipolar og bipolar CIN celler har flere centrosomes
de lave frekvenser for multipolar anaphases sammenlignet med de av multipolar prometaphases (figur 1B) og den bipolare kromosom segregering observert i levende celler (figur 2A) foreslått at de fleste av de multipolar spindlene kan bipolarize før anaphase utbruddet. For å teste denne hypotesen, utførte vi γ-tubulin flekker i kombinasjon med microtubule og kinetochore farging på CIN celler på ulike stadier av mitose (3A-B). Høy oppløsning konfokal mikroskopi viste at i prometafase CIN-celler, γ-tubulin-farging var tilstede i det hele tatt spindel poler i over 95% av cellene (figur 3A). Deretter vi så på bipolare metafase /tidlig anafase-celler (figur 3B) og fant at et betydelig antall celler oppviste flere γ-tubulin-positive prikker på et enkelt spindelpolen (figur 3B-C), noe som tyder på at en del av spindelen polene til stede i multipolar prometafase celler kan bevege seg tett sammen på senere mitotiske faser for å generere to fokuserte spindel poler, og dermed en bipolar spindel. Det bør bemerkes at den observerte frekvenser (6,8% og 10,5% for HT-29 og SW620, henholdsvis) kan undervurdere den faktiske antall spindel poler som gjennomgår denne koalesens prosessen, da noen av dem kan bevege seg så nær hverandre for å fremstå som en av γ-tubulin farging.
figuren viser eksempler på flerpolar prometafase (A) og bipolar metafase (B) CIN cellene immunfarget for α-tubulin, kinetochores, og γ-tubulin. Bildene ble oppnådd ved sammenslåing maksimal intensitet projeksjoner av enten α-tubulin og CREST (kinetochores) bilder (venstre kolonne) eller α-tubulin og y-tubulin bilder (høyre kolonne). A. De fleste multipolar prometafase celler (eksakte prosenter vises nederst i høyre hjørne av høyre panel) utstilt γ-tubulin flekker på alle spindel polene. B. Eksempler på bipolar metafase CIN celler med flere centrosomes på en enkelt spindel pol (piler peker på γ-tubulin-farget prikker). Scale bar, fem mikrometer. C. Frekvenser av bipolare metafase /tidlig anaphase CIN celler som innehar flere centrosomes (som visualisert ved γ-tubulin flekker) på en enkelt spindel pol.
Høyere frekvenser av merotelic vedlegg i multipolar vs bipolar prometafase CIN celler
de mange y-tubulin signaler på spindel polene av bipolar metafase CIN celler, sammen med forekomsten av lagging kromosomer i bipolare anaphases på frekvenser som tett ligner frekvensene av multipolar prometaphases, antydet at merotelic vedlegg kan være fortrinnsvis dannet i multipolar prometafase celler som senere bi-polariserer av spindel pol sammenvoksing. For å teste denne hypotesen, brukte vi høy oppløsning konfokalmikroskopi kombinert med 3-D visualisering og bildebehandling (se Materialer og metoder for detaljer) for å identifisere merotelic kinetochores i kaldt behandlet (for å indusere ikke-kinetochore microtubule demontering, men bevare kinetochore mikrotubuli ) prometafase CIN celler immunostained for kinetochores og mikrotubuli (Figur 4A-D). Vi er fast bestemt antall merotelic kinetochores i bipolare vs. multipolar prometafase CIN celler ved å identifisere alle kinetochores bundet til to mikrotubulidynamikk bunter orientert i motsatt retning, og fant ut at multipolar prometafase celler besatt betydelig høyere antall merotelic vedlegg enn bipolare prometafase celler (Figur 4E ), noe som tyder merotelic vedlegg i slike multipolar prometaphases som en viktig kilde til lagging kromosomer i bipolare anaphase celler.
A. Enkelt fokalplanet til en ubehandlet HT-29 multipolar prometafase. Scale bar, 2,5 mikrometer. B. Samme celle og samme fokusplanet som i (A) oppnås etter behandling av bildene i de to kanalene med spesiell filtrering, sammenslåing, og glatting (se Materialer og metoder for detaljer). En merotelic kinetochore er synlig i eske området. KTs: kinetochores. MTS: mikrotubuli. C. Forholdet riss av fokalplanet vist i (A) og (B). Regioner av sidestilling mellom kinetochore og dens microtubule bunt (er) vises i grønt. D. utvidelse (400%) av eske området (B). E. Gjennomsnittlig antall merotelic kinetochores i bipolare vs. multipolar prometafase CIN celler. Multipolar prometaphases besitter betydelig mer merotelic kinetochores enn bipolare prometaphases (t-test, P 0,001 for begge cellelinjer)
Diskusjoner
cytokinese svikt bidrar ikke til CIN
.
cytokinese feil har blitt foreslått i det siste som en mekanisme ansvarlig for Aneuploidy i kreftceller [10], [11]. Faktisk har en rekke studier vist at polyploidi indusert av eksperimentelt hemme cytokinese, kan føre til malign transformasjon og tumorigenesis [27], [28]. Men som påpekt i innledningen, cytokinese svikt
per se
ville ikke være tilstrekkelig til å forklare CIN, dvs. høy kromosom mis-segregering priser. Likevel kan cytokinese svikt være en medvirkende faktor for CIN, så vi bestemt frekvens cytokinese svikt både i celler som utviser bipolar kromosom segregering og i celler med veis kromosom segregering. Vi observerte aldri cytokinese svikt i celler som gjennomgår bipolar celledeling, og dette fenomenet bare skjedde i omtrent halvparten av cellene gjennomgår multipolar celledeling (figur 2A). Fordi svært få celler stille multipolar kromosom segregering, de observerte tallene for cytokinese svikt representerer en svært sjelden hendelse i den totale cellepopulasjonen. Dermed svikter cytokinese unnlatelse av å forklare både høy forekomst av kromosom mis-segregering observert i CIN celler [4], [5] og høy forekomst av lagging kromosomer funnet i kreftceller [20] – [24] (figur 2B). I konklusjonen, selv om cytokinese svikt kan representere en sjelden, tidlig hendelse i tumor utvikling [27], [28], det ser ikke ut til å bidra vesentlig til CIN i kreftceller på senere stadier av tumorprogresjon.
multipolaritet og multipolar kromosom segregering i CIN kreftceller
Mange kreftceller har tidligere blitt vist å oppvise sentrosomen amplifikasjon [12], [15], [29], [30], og mitotisk spindel multipolaritet er blitt observert i kreft celler fra forskjellige steder [1], [12], [15], [20], [21], [24], [29] – [34]. Det har blitt foreslått at multipolar kromosom segregering ville produsere i stor grad aneuploide datterceller, noe som mest sannsynlig ville ikke overleve følgende cellesyklus [18], [19]. Ja, vår live-celleforsøk viste at multipolar celledeling er en sjelden hendelse i CIN celler (figur 2A). I tillegg er en fersk studie viste at multipolar celledeling i CIN cellene resulterer i enten celledød eller cellesyklus arrest [35]. Det er tidligere foreslått at multipolar kreftceller kan gjennomgå en bipolarization prosess, noe som ville skje via sentrosomen gruppering, og ville føre til bipolar kromosom segregering [16] – [18]. Nyere studier har vist at flere spillere kan være involvert i å fremme sentrosomen clustering (anmeldt i [36]). Disse inkluderer aktin-assosierte mekanismer [16], dynein [17], kinesin 14s (NCD /HSett) [16], [37], og kanskje andre proteiner /mekanismer [16], [36], [37]. Nyere studier [16], [26], [37] har også foreslått en mulig rolle spindelenheten sjekkpunkt i gir tid for spindel bipolarization i multipolar celler, som Mad2 hemming hindret spindel bipolarization [16], [37] og akselerert mitotisk exit i multipolar celler [26]. Etter avtale med disse studiene, finner vi at celler med høyere frekvenser av multipolar spindler tilbringer i gjennomsnitt lengre tid i mitose (tabell 1). Men akselererer Mad2 hemming mitose exit uansett spindel pol nummer og kinetochore vedlegg [38] – [40], så dens effekt på multipolar spindel bi-polarisering kan rett og slett være en sekundær effekt. Vi fant også at multipolar cellene har høyere antall merotelic kinetochores. Men merotelic vedlegg som ikke oppdages av spindelenheten sjekkpunkt (anmeldt i [1]), og derfor synes dette neppe være årsaken til mitotiske forsinkelse. På den annen side, CIN kreftceller har overdreven kromosom numre, slik at det er lett å forestille seg at det å oppnå stabile vedlegg for alle kromosomene vil ta lengre tid i slike celler sammenlignet med bipolare diploide celler. Imidlertid Yang et al. [26] nylig viste at eksperimentelt generert multipolar diploide RPE1 celler tar dobbelt så lang tid å gå inn anaphase forhold til sine bipolare kolleger, noe som tyder på at økningen i sentrosomen nummer kan være nok til å forsinke anaphase utbruddet. Forfatterne foreslo at tilstedeværelsen av flere mikrotubul asters kan forstyrre stabiliteten av kinetochore vedlegg [26], og dermed fører til en økning i den tiden som er nødvendig for å fullføre kinetochore vedlegg, og dermed forlenge mitose. Dette er en interessant mulighet, som må bli testet i fremtidige eksperimenter. I konklusjonen, hvor ekstra centrosomes forsinke anaphase utbruddet er fortsatt uklart, men disse studiene tyder på at både de ekstra kromosomer og de ekstra centrosomes i CIN kreftceller kan bidra til økningen i gjennomsnittlig tid brukt i mitose, der de multipolar cellene bipolarize via spindel pol sammenvoksing. Den sentrosomen clustering forbundet med spindelen bi-polarisering ble tidligere foreslått å konferere kreftceller med en selektiv fordel som ville forhindre massiv kromosom mis-segregering og tillate kreftceller til å fortsette å dele selv i nærvær av ekstra centrosomes [18], [19]. Således tidligere studier foreslått en slik spindelpolen sammenflytprosessen som en mekanisme for å hindre feilaktig kromosom segregering. Omvendt, foreslår vi her at multipolar spindelenheten etterfulgt av spindel pol koalesens representerer en viktig mekanisme av kromosom mis-segregering i CIN kreftceller (se neste avsnitt for en detaljert beskrivelse av vår foreslåtte modellen).
Kreft celle multipolaritet og merotelic kinetochore vedlegg: to sider av samme sak
det lave antallet multipolar anaphases forhold til multipolar prometaphases (figur 1B), lavt antall multipolar celledelinger (figur 2A), og tilstedeværelsen av flere γ -tubulin-positive signaler ved enkelt spindel polene i metafase /tidlig anafase CIN-celler (figur 3B-C), tyder på at de fleste av de multipolar prometaphases gjennomgå en prosess med spindelpolen sammenflyting før anaphase utbruddet, som tidligere er foreslått [16] – [19 ].
Vi foreslår at når CIN kreftceller i utgangspunktet montere multipolar spindler, enkelt kinetochores er mer sannsynlig enn de ville være i en bipolar spindel til ansikt (figur 5A), og bli knyttet til (figur 5B), to spindel staver (merotelic vedlegg). Dermed vil multipolar prometafase celler kan forventes å ha mer merotelic vedlegg i forhold til bipolare prometaphases. Ja, vi fant multipolar prometafase celler til å eie mer merotelic kinetochores forhold til bipolare prometaphases (figur 4). Som beskrevet ovenfor, multipolar spindler sannsynlig bipolarize via en spindelpolen koalesens prosess (figur 5B-C) før anaphase utbruddet. Selv om korreksjonsmekanismer for merotelic kinetochore vedlegg eksisterer [39], [41], [42], er dette kinetochore mis-vedlegg som ikke oppdages av mitotiske sjekkpunkt [43], [44], og cellene kan angi anaphase før oppnå fullstendig korreksjon [ ,,,0],39], [43]. Fordi celler som forbigående montere multipolar spindler vil begynne med flere merotelic vedlegg i forhold til bipolare celler (figur 4 og 5b), er flere slike mis-vedlegg forventes å vedvare gjennom anaphase og produsere lagging kromosomer (dvs. kromosomer som henger etter på spindel ekvator snarere enn å segregere til spindelen på stangen, figur 5D), og følgelig kromosom mis-segregering og Aneuploidy. Bemerkelsesverdig, fant vi også at frekvensene av anaphase celler med merotelically orienterte lagging kromosomer var svært lik frekvensen av multipolar prometafase celler (sammenligne figur 1B og figur 2B), noe som tyder på det spennende mulighet for at de henger kromosomer finnes i de cellene som i utgangspunktet montere multipolar spindler. I sammendraget, mens spin multipolaritet og anaphase henger kromosomer hadde tidligere blitt foreslått som urelaterte årsaker til CIN, viser vi her for første gang at et stort antall merotelic kinetochores form i multipolar prometafase celler, og dermed avslører den nære sammenhengen mellom multipolaritet og anaphase henger kromosomer .
A. Innenfor en multipolar spindel, er mer sannsynlig å møte to spindel poler enn det ville være i en bipolar spindel en enkelt kinetochore. B. På grunn av den multipolar spindel geometri, kan en enkelt kinetochore lett binde mikrotubuli som kommer fra to spindel polene snarere enn fra bare ett pol. Etter etableringen av merotelic kinetochore vedlegg, de mitotisk spindel bi-polarizes av en prosess med spindel pol koalesens (eller sentrosomen clustering). C. Merotelic kinetochore vedlegg kan vedvare gjennom metafase og inn anaphase. D. Under anaphase kan merotelic kinetochore vedlegget gi opphav til en henger kromosom.
Vi bør merke seg at, selv om mye lavere frekvenser enn i CIN celler, fant vi begge multipolar prometafase spindler (figur 1 ) og anaphase henger kromosomer (figur 2B-C) i HCT116 (min) celler. Ikke desto mindre har disse cellene er tidligere vist ikke å oppvise CIN [4], [22], og de ble vist å tolerere eksperimentelt-induserte kromosom mis-segregering [22], som tyder på at CIN må skyldes en kombinasjon av høy kromosom mis -segregation priser (ikke observert i HCT116-celler) og noen andre fenotypiske funksjon som gjør cellene tolerant for Aneuploidy [22].
Fremtidige eksperimenter bør være rettet mot å teste vår modell og dens prediksjon at hemming av spindel pol koalesens bør resultere i lavere frekvenser av lagging kromosomer i bipolare anaphase celler. Time-lapse avbildning av celler med merkede kinetochores og mikrotubuli ville bekrefte hendelsesforløpet foreslått her (figur 5) hvis merotelically festet anaphase lagging kromosomer ble observert hyppigere hos celler som starter mitose med multipolar spindler sammenlignet med celler som starter ut med bipolare spindler. Videre kan spindel pol clustering være hemmet å frikoble spindel multipolaritet fra anaphase henger kromosomer, og dermed demonstrere årsakssammenheng mellom disse to fenomenene. For eksempel, ved å utføre en genom-wide RNAi skjerm i Drosophila S2-celler, Kwon et al. [16] funnet mange forskjellige gener er implisert i en rekke cellulære prosesser, inkludert spindelpolen organisasjon, celleform og polaritet, og celleadhesjon, å være involvert i sentrosomen gruppering. Ifølge vår modell, bør tie av disse genene i CIN celler resultere i reduserte frekvenser av lagging kromosomer i bipolare anaphases, og senere eksperimenter bør være rettet mot å teste denne hypotesen. Selv om den omvendte eksperimentet (dvs. redusere merotelic vedlegg i multipolar celler) vil være mye mer utfordrende, kan noen eksperimenter gi indirekte bevis at å redusere merotelic vedlegg vil medføre en reduksjon i anaphase lagging kromosomer i cellene som forbigående montere en multipolar spindel. For eksempel kan anaphase utbruddet bli forsinket ved behandling av multipolar celler med en proteasominhibitor. Under den tiden av proteasomhemmingen blir multipolar spindler forventet å bi-polarisere, og merotelic vedlegg forventes å bli korrigert. Dermed ved utvasking av inhibitor, bør cellene skriv anaphase og viser lave frekvenser av lagging kromosomer.
Har noen andre mekanismen bidra til Cin?
Vi utelukker ikke at andre mekanismer kanskje bidra til kromosom ustabilitet i kreftceller. For eksempel, nyere studier antydet at mekanismene for merotelic kinetochore korreksjon er ikke veldig effektivt i CIN kreftceller [9], [45].
