Abstract
Fluorescent-antistoff målretting av metastatisk kreft har blitt demonstrert av vårt laboratorium for å aktivere svulst visualisering og effektiv fluorescens styrt kirurgi. Målet med denne studien var å finne ut om insulin-like growth factor-1 reseptor (IGF-1R) antistoffer konjugert med lyse fluorophores, kan gjøre det mulig visualisering av metastatisk tykktarmskreft i ortotopiske naken musemodeller. IGF-1R antistoff (klon 24-31) ble konjugert med 550 nm, 650 nm eller PEGylert 650 nm fluorophores. Subkutane, ortotopiske, og levermetastaser modeller av tykktarmskreft i nakne mus ble målrettet med fluorescerende IGF-1R antistoffer. Western blotting bekreftet ekspresjon av IGF-1R i HT-29 og HCT 116 humane tarmkreftcellelinjer, både uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP). Merking med fluoroforen-konjugert IGF-1R antistoff påvist fluorescerende foci på membranen av tykktarmskreftceller. Subcutaneously- og orthotopically-transplanterte HT-29-GFP og HCT 116-GFP svulster brightly fluorescerte på lengre bølgelengder etter intravenøs administrering av fluorescerende IGF-1R antistoffer. Orthotopically-transplantert HCT 116-GFP-tumorer ble sterkt merket med fluorescerende IGF-1R antistoffer slik at de kunne bli avbildet ikke-invasiv måte ved lengre bølgelengder. I en eksperimentell levermetastase modell, IGF-1R antistoffer konjugert med PEGylert 650 nm fluoroforer selektivt fremhevet levermetastaser, som da kan være en ikke-invasiv avbildes. De IGF-1R fluorescent-merkede antistoff levermetastaser var svært lyse sammenlignet med normal lever og det fluorescerende antistoff-etikett samlokalisert med grønt fluorescerende protein (GFP) ekspresjon av tykktarmskreftceller. Denne studien viser altså at fluoroforen-konjugert IGF-1R antistoffer selektivt visualisere metastatisk kreft i tykktarmen og har klinisk potensial for økt diagnostisering og fluorescens styrt kirurgi
Citation. Park JY, Murakami T, Lee JY, Zhang Y , Hoffman RM, Bouvet M (2016) Fluorescent-antistoff målretting av Insulin-like Growth Factor-1 Receptor visualiserer metastatisk Menneskelig Colon Cancer in ortotopiske musemodeller. PLoS ONE 11 (1): e0146504. doi: 10,1371 /journal.pone.0146504
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES
mottatt: May 26, 2015; Godkjent: 17 desember 2015; Publisert: 05.01.2016
Copyright: © 2016 Park et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Cancer Institute CA142669 og CA132971, til MB og Anticancer cancer~~POS=HEADCOMP, Inc., og et stipend fra Korea Research Foundation under grunnforskning forfremmelse fond av Kunnskapsdepartementet og Helse- Resources Development of Korea 2010-0022990 til JYP. The National Cancer Institute gitt støtte i form av lønn for forfatteren MB, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller i denne forfatteren er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. JYP, TM, og RMH er nonsalaried filialer av Anticancer, Inc. YZ ansatt i Anticancer, Inc. Anticancer, Inc., markedsfører dyremodeller av kreft. Det er ingen andre konkurrerende interesser. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft er den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall i vestlige land [1 ]. Utvikling av koloskopi muliggjør tidlig oppdagelse og fjerning av forstadier adenomatøse polypper [2,3]. Komplett kirurgisk reseksjon kan kurere godt valgt pasienter med levermetastaser [4,5]. Forbedret avbildning av metastatisk tykktarmskreft bør øke overlevelsen ved å gjøre koloskopi og kirurgi mer effektiv. Vi har tidligere vist at målretting orthotopic metastatisk kreft i tykktarmen, inkludert pasient avledet ortotopiske xenografter (PDOX) modeller, med fluorescerende anti-carcinoembyronic antigen (CEA) antistoffer aktivert forbedret svulst visualisering og effektiv fluorescens styrt kirurgi (FGS) [6]. Målretting av den epidermale vekstfaktor-reseptor med fluoriserende antistoffer forbedrede kolonoskopi [7].
Type I insulinlignende vekstfaktor-reseptor (IGF-1R) er et transmembran-tyrosin-kinase-reseptor omfattende to α og to p-kjeder og er den store reseptor for IGF-i og IGF-II. IGF-1R er uttrykt i 51 ~ 100% av kolon kreft, avhengig av studien [8-10]. Den høye frekvens av ekspresjon i tykktarmskreft og membranen subcellulær beliggenhet IGF-1R et potensielt mål for fluoriserende antistoffer for å muliggjøre visualisering kreft, diagnose, og FGS [11]. Ved hjelp av IGF-1R har også ytterligere klinisk potensial siden overekspresjon av IGF-1R korrelerer med kortere median overlevelse for tykktarmskreftpasienter som gjennomgår kirurgi og adjuvant kjemoterapi [10].
Denne rapporten viser muligheten for IGF- 1R målrettet fluoroforen konjugerte antistoffer til å visualisere metastatisk tykktarmskreft i passende musemodeller.
Materialer og metoder
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP cellelinjer
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinjer HT-29 [12] og HCT 116 [13] ble opprettholdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT), penicillin /streptomycin (Gibco-BRL, Carlsbad, CA), natriumpyruvat (Gibco-BRL) , natriumbikarbonat (Cellgro, Manassas, VA), L-glutamin (Gibco-BRL), og minimale essensielle medium ikke-essensielle aminosyrer (Gibco-BRL). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator.
Bygging av GFP-uttrykke tykktarmskreft cellelinje
Byggingen av grønt fluorescerende protein (GFP) som uttrykker HCT 116 er beskrevet tidligere [14-16]. For GFP-genet transduksjon, ble 20% konfluent HCT 116 celler [17] inkubert med en 1: 1 blanding av retrovirale supernatantene til de PT67 emballasje celler og RPMI 1640 (Gibco-BRL, Life Technologies, Inc.) i 72 timer. Cellene ble høstet ved trypsin /EDTA 72 timer etter inkubering med GFP-retrovirale supernatanter og subdyrket i et forhold på 01:15 i selektivt medium som inneholdt 200 ug /ml G418. Nivået av G418 ble øket til 800 ug /ml trinnvis. Kloner som uttrykker GFP ble isolert med kloning sylindere (Bel-Art produkter, Pequannock, NJ) ved trypsin /EDTA og ble forsterket og overført ved konvensjonelle dyrkingsmetoder. Høy GFP uttrykk kloner ble deretter isolert i fravær av G418 for 10 passasjer å velge for stabilt uttrykk av GFP [14-16].
Mus
athymiske nu /nu hårløse mus (Anticancer Inc., San Diego, CA), 4-6 uker gamle , ble anvendt i denne studien. Mus ble oppbevart i en barriere anlegg under HEPA filtrering. Mus ble matet med en Autoclaved laboratorium gnagerdiett. Alle mus kirurgiske prosedyrer og avbildning ble utført med dyrene bedøvet ved intramuskulær injeksjon av ketamin 50%, 38% xylazin, og 12% acepromazin maleat (0,02 ml). Dyr mottok buprenorfin (0,10 mg /kg ip) umiddelbart før operasjonen og en gang om dagen i løpet av de neste 3 dager for å lindre smerte. Tilstanden av dyrene ble overvåket hver dag. Svulster ble målt med calipers annenhver dag. Når svulster ble større enn 2 cm eller en dyp sår ble dannet, ble dødshjelp utført. Dyrene ble alle avlivet 2-3 uker etter operasjonen. CO
2 inhalasjon ble brukt til aktiv dødshjelp. For å sikre død etter CO
2 kvelning, ble halshugging utført. Alle dyrestudier ble godkjent av Anticancer, Institutional Animal Care Inc. og bruk Committee (IACUC) i henhold til de prinsipper og prosedyrer som er skissert i National Institute of Health Guide for omsorg og bruk av dyr i henhold Assurance Antall A3873-1.
antistoff-dye konjugering
mus monoklonale antistoffer mot IGF-1R (klon 24-31, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) ble konjugert med DyLight 650, Dylight 550, eller PEGylert Dylight 650 fargestoffer (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) i henhold til produsentens spesifikasjoner, noe som sikrer et minimum av minst 4: 1 dye: protein ratio [18]. Protein: dye konsentrasjoner ble bekreftet ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts) [18]
Western blotting
Cellelysater ble hentet i lysis buffer som inneholder 70 mM β-glycerophosphate. , 0,6 mM natriumortovanadat, 2 mM MgCl
2, 1 mM etylenglykol-tetraeddiksyre, 1 mM DTT (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), 0,5% Triton-X100, 0,2 mM fenylmetylsulfonylfluorid, og 1% protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Lysater ble separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE) og overført til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Membranene ble blokkert i 5% (vekt /volum) fettfri tørrmelk og probet med anti-IGF-1Rα (SC-712, Santa Cruz, Dallas, TX, USA). De immunreaktive proteiner ble visualisert ved hjelp av SuperSignal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).
Merking av levende celler in vitro ved hjelp av fluorescerende IGF-1R antistoffer
HT-29 og HCT 116 celler (2 x 10
5) ble dyrket over natten. IGF-1R antistoff (klon 24-31) konjugert med DyLight 550 fargestoff ble fortynnet til 4 ug /ml i fosfatbufret saltløsning (PBS, Corning Cellgro, Manassas, VA). Kulturmediet ble aspirert fra cellene og den fortynnede antistoff ble tilsatt til de levende celler. Celler ble inkubert med antistoff i 1 time ved romtemperatur. Cellene ble vasket forsiktig to ganger med PBS etter at antistoffet ble aspirert. Cellene ble observert under en FV1000 confocal mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) med hvitt lys og 559 nm laser [19].
Immunohistochemistry
Anti-IGF-1R (klone 24-31 ) konjugert med DyLight 650 ble brukt til farging tumorsnitt på lysbilder. Glassene ble inkubert med 10% normalt esel serum i en time ved romtemperatur, og inkuberes med det konjugerte antistoffet ved romtemperatur i en time ved en fortynning på 1: 100. Vevene ble tørket og observert med en IV-100 laser scanning mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) med en 633 nm laser [20]. Alternative lysbilder fra samme frossen svulstvev ble farget med hematoksylin og eosin og observert under lett mikroskopi.
Subkutan og ortotopiske tumor musemodeller
HT-29-GFP og HCT 116-GFP menneskelige kolon kreftceller (2 x 10
6) ble injisert subkutant inn i flankene til nakne mus. Når de subkutane svulstene ble mellom 10 og 20 mm i diameter, ble de høstet og fragmentert i små fragmenter. De tumorfragmenter ble implantert orthotopically i kolon av nakne mus, som beskrevet tidligere [6,21,22]. I korthet ble et enkelt tre-mm
3 tumor-fragment, som var egnet for suturering og også resulterte i en reproduserbar tumorvekst, festet til den mesenteriske grensen av den cekale veggen med 8-0 nylon kirurgiske suturer (Ethilon ™; Ethicon Inc ., Somerville, NJ). Ved fullføring ble cecum returnert til magen, og snittet ble stengt i ett lag bruker 6-0 nylon kirurgiske suturer (Ethilon).
levermetastaser modell
HCT116-GFP tykktarmskreft -celler (2 x 10
6), med Matrigel, ble injisert inn i milten hos nakne mus som tidligere beskrevet [17]. Levermetastaser dukket opp over en periode på 2-3 uker.
Imaging
I begge subkutan og ortotopiske tumormodeller, ble musene injisert med IGF-1R antistoff, konjugert med fluoroforen inn i hale vene, og deretter hele kroppen ikke-invasiv avbildning ble utført ved anvendelse av OV100 Small Animal Imaging System (Olympus, Tokyo, Japan) som beskrevet ovenfor [23]. Den optimale dosen av fluorofor-konjugert IGF-1R antistoff ble bestemt ved den dose som førte til bilder med den beste tumor-til-bakgrunnsforhold i det subkutane tumormodell som direkte visualisert med OV100. Etter at hele kroppen ikke-invasiv avbildning i ortotopisk tumormodell, ble ex vivo avbildning av tumoren med OV-100 utført på slutten av eksperimentet. I leveren ortotopisk transplantasjon modellen, etter som sikrer tilstedeværelse av levermetastaser av ikke-invasiv avbildning hele kroppen med OV100, ble musene injisert med anti-IGF-1R (klon 24-31) konjugert til PEGylert DyLight 650. Musene ble avlivet 24 timer etter injeksjonen, og en ventral vertikalt snitt fra brystbenet til den nedre del av magen ble tatt og deretter ble leveren ble fotografert ved hjelp av OV-100. Hele leveren med metastaser ble tatt ut og ex vivo avbildning med OV-100 ble gjentatt. Bakgrunnssignalet i det opprinnelige leveren ble redusert ved valg av eksitasjon filtre. GFP ble opphisset av en nm filter 460-490 og fluorescerende antistoff var spent med en 595-635 nm filter.
Bildeanalyse
Bildebehandling ble gjort med Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Inc ., San Jose, California).
Resultater
uttrykk av IGF-1R i kolon kreftceller in vitro
Både HT-29-GFP og HCT 116-GFP colon cancercellelinjer uttrykte pro-IGF-1R og IGF-1R, som bestemt med Western blotting. HT-29-GFP uttrykt IGF-1R sterkere enn HCT-116-GFP (figur 1A). Western blotting ble gjentatt tre ganger, og vi har observert samme resultat hver gang. Etter inkubasjon med fluorescerende konjugert IGF-1R antistoff, uten gjennomtrengning, ble flere fluorescerende foci visualisert på HT-29 og HCT 116 celler i enlagskultur, som observert i henhold fluorescens mikroskopi (Fig 1B). Differensialinterferenskontrastmikroskopi bekreftet at det konjugerte antilegeme omsettes med IGF-1R på overflaten av kreftceller (figur 1B).
(A) Western blot-analyse viser pro-IGF-1R og IGF-1Rα ekspresjon hos 200 og 130 kDa i tykktarm kreft cellelinjer, henholdsvis (HT-29 og HCT 116). (B) merking av levende HCT 116 og HT-29-celler med 550 nm fluoroforen-konjugerte antistoffer viser flere fluoriserende brennpunkter på overflaten. Representative fluorescens bilder slått sammen med tilsvarende DIC (differensial interferens kontrast) bilder (x60 vann nedsenking objektiv med FV1000, med 559 nm laser).
Målrette subkutane colontumorer i hårløse mus med fluorescerende IGF-1R antistoffer
Når HT-29-GFP eller HCT 116-GFP subkutane svulster nådd ca 10 mm i diameter, dyrene fikk hver en enkelt 10, 30 og 50 mikrogram dose DyLight 650-konjugert anti-IGF -1R (klon 24-31) i 150 ul PBS via halevenen. Subkutan tumor avbildning ble gjort når tumordiameteren var ca. 10 mm. Musene ble fotografert ved både lys-felt og fluorescens-belysning ved hjelp av OV100 etter 48 timer. Med 30 mikrogram dose av konjugert anti-IGF-1R, som produserte de beste kontrast bilder, både HT-29 og HCT 116 subkutane svulster hadde sterkere fluorescens i forhold til bakgrunn (figur 2A). Fluorescens farging ble utført på frosne tumorprøver fra HCT 116 tumorer og bekreftet tilstedeværelsen av IGF-1R på kreftcellemembraner (figur 2B).
(A) mus som er avbildet under både hvitt lys og fluorescens belysning. Intensiteten av fluorescensen fra HCT 116 og HT-29 subkutane tumorer er mye større enn bakgrunnen. (B) Hematoxylin eosin farging (x200, venstre). Fluorescens farging for IGF-1R (x20 vanlig objektiv, IV-100 scanning laser mikroskop (Olympus) med en 633 nm laser, høyre) av frosne HCT 116 tumorprøver viser fluorescens på membranen av kreftcellene.
Målretting ortotopiske colontumorer i hårløse mus med fluorescerende IGF-1R antistoffer
mus med svulster orthotopically-implantert i mus cecum ble injisert med DyLight 650-konjugert anti-IGF-1R (klone 24-31) antistoff med en enkelt 30 mikrogram dose via halevenen 14 dager etter tumor-implantering. Imaging ble utført før og etter åpning av buken hos mus. Tumorstørrelse var ca. 10 mm. Den OV100 oppdaget svulsten fluorescens non-invasiv, ved intra åpen avbildning samt ex-vivo (fig 3). Fluorescens ble observert i huden, blære, og tarminnholdet, men ved lav intensitet.
fluorescens fra orthotopically transplanterte tumorer i cecum ble registrert før og etter abdominal laparotomi. Også fluorescens fra den resekterte tumoren ble detektert. Svak fluorescens ble også detektert fra huden og, blære og tarminnhold, men ved mye lavere intensitet enn tumoren. Hvite piler indikerer kolon svulsten.
Målretting av tykktarmskreft levermetastaser i hårløse mus med fluorescerende IGF-1R antistoff
Tre uker etter injisering HCT 116-GFP celler injisert i mus milt, tilstedeværelse av levermetastaser ble observert ved ikke-invasiv avbildning hele kroppen. Musene ble deretter behandlet med PEGylert DyLight 650-konjugert anti-IGF-1R (klon 24-31) med en enkelt 90 mikrogram dose via halevenen og avlivet 24 timer etter antistoff injeksjon. Vi gjorde avbildning i løpet av 24 timer i levermetastase modell fordi vår tidligere erfaring viste at antistoffet løsrevet fra svulsten raskere i levermetastase modell i forhold til de subkutane og ortotopiske tumormodeller [24]. Ventral abdominal laparotomi av musene viste flere metastatiske svulster i leveren. GFP og 650 nm fluorescens stammer fra metastatiske svulster, med normal lever bare viser et meget svakt signal (figur 4A). Selv om det ikke var mulig å telle alle de meget små svulster, ex vivo avbildning viste også at 650 nm signal samlokalisert med GFP og avgrenset omfanget av svulsten mer nøyaktig i forhold til sterkt lys avbildning. Hematoxylin eosin farging av vevsprøver som uttrykker fluorescens bekreftet tilstedeværelsen av metastatiske tumorer i muselever (figur 4B).
Anti-IGF-1R konjugert til PEGylert 650 nm fargestoff selektivt merkes i HCT 116-GFP metastatiske tumorer. Både in vivo (A) og ex vivo (B) avbildning, viser at 650 nm fluoroforen-konjugert IGF-1R antistoffer samlokalisert med HCT 116-GFP fluorescens og mer nøyaktig markerte tumoren sammenlignet med sterkt lys avbildning (hvite pilspisser). H E farging av vevsprøve (x200) uttrykker fluorescens bekrefter tilstedeværelsen av metastatisk tumor i muselever.
Diskusjoner
Målrette IGF-1R i sarkom med radiomerket antistoff og brystkreft med fluorofor-konjugerte antilegeme er blitt rapportert [11,25]. I denne studien ble antistoff rettet mot alfa subenheten av IGF-1R brukt. In vitro avbildning bekreftet at det konjugerte antistoff bundet til IGF-1R på den ytre membran av tykktarmskreftceller. Fluorescens-konjugerte anti-IGF-1R antistoffer gjort svulsten mer fluorescerende enn bakgrunnen, lett å skille tumor fra omkringliggende normale organer. Denne rapporten viser at fluorescens bildebehandling med fluorophore-konjugert IGF-1R antistoff kan kombineres med endoskopi og FGS for bedre diagnostikk og behandling av tykktarmskreft.
IGF-1R målrettet bildebehandling kan være i stand til å oppdage høy risiko polypper som foreslått av våre resultater, og ved tidligere rapporter at IGF-1R uttrykk ble påvist i kolon adenomer og ble sterkere som graden av kreft kommet. Ikke-neoplastiske hyperplastiske polypper uttrykte ikke IGF-1R [26]. Forutsi kreftfremkallende risiko for premaligne polypper med fluorescerende IGF-1R antistoffer kan aktivere individualisert behandling for kolon polypper, selv uten vev prøvetaking og kan bidra til å unngå unødvendige invasive prosedyrer eller gjentatt behandling.
IGF-1R rettet behandling er under utvikling og testet i kliniske forsøk [27]. Bestemme uttrykk for IGF-1R i svulster med fluorescens bildebehandling før eller under behandlingen kan være i stand til å veilede behandling eller forutsi behandlingsrespons. Fluorescens bildebehandling har fordeler siden den ikke krever invasiv svulst prøvetaking og kan gjentas lett [28].
Vi har tidligere demonstrert effektive FGS av tykktarmskreft i musemodeller ved hjelp av fluorescerende anti-CEA antistoffer [6,29, 30]. Fluorescens-avbildning har vist seg å detektere ørsmå levermetastaser og fjerne dem senere ved kirurgi hos pasienter [31]. Spesielt med tykktarmskreft, oppdager levermetastaser med fluorescens bildebehandling er viktig siden det kan forbedre komplett reseksjon. Våre resultater viste at med IGF-1R antistoff konjugert med et PEGylert fluorofor, metastaser ble mye mer fluoriserende i forhold til det normale lever bakgrunn, og ble mer presist detektert [24]. Vi har tidligere vist at PEGylerte fargestoffer konjugert til tumorspesifikke antistoffer reduserte ikke-spesifikt opptak av normal lever [24]. Målet med den foreliggende manuskriptet var å vise at en fluorescerende antistoff til IGF-1R kunne identifisere omfanget av levermetastaser i ortotopiske modeller av tykktarmskreft bedre enn standard lys visualisering, og vi oppnådd dette målet. Fluorescens avbildning ved hjelp av fluorofor-konjugert IGF-1R antistoff av levermetastaser bør være effektive for FGS.
Som konklusjon, har vi vist at fluorofor-konjugert IGF-1R antistoff er meget effektiv i merking tykktarmskreft i musemodeller. Formell bio-fordelingsanalyse og videre studier med kreft i tykktarmen PDOX modeller er nødvendig for å bekrefte at IGF-1R målsøkt billeddannende kan brukes i kliniske omgivelser. Våre tidligere studier med fluoroforen konjugert antistoff mot CEA, CA 19-9, Kit, og MUC-1 har vist sin evne til merking gastrointestinale svulster brightly in vivo [6,24,30,32-40]. Skrivbart biomarkører vil ha viktig klinisk potensial for diagnose og behandling som FGS.
