Abstract
Autophagy er en evolusjonært konservert prosess ansvarlig for nedbrytning og resirkulering av cytoplasmatiske komponenter gjennom autolysosomes. Targeting AR aksen er en standard strategi for prostatakreft behandling; imidlertid, rollen av AR i autophagic fremgangsmåter er ennå ikke fullt ut forstått. I denne studien fant vi at AR spilt en negativ rolle i AR degrader celastrol-indusert autofagi. Knockdown av AR i AR-positive prostatakreftceller resulterte i økt autofagi. Ektopisk ekspresjon av AR i AR-negative prostatakreftceller, eller forsterkningen av funksjon av AR signalisering i AR-positive celler, førte til undertrykkelse av autophagy. Siden MIR-101 er en hemmer av autofagi og dens uttrykk ble redusert sammen med AR i ferd med celastrol-indusert autofagi, hypotese vi at AR hemmer autofagi gjennom trans av
MIR-101
. AR bindingssetet ble definert i oppstrøms
MIR-101
genet ved luciferaserapportørplasmid og chip analyser. MiR-101 uttrykk korrelert med AR status i prostata kreft cellelinjer. Hemming av celastrol-indusert autofagi av AR ble kompromittert ved å blokkere MIR-101; mens transfeksjon av MIR-101 førte til hemming av celastrol-indusert autofagi på tross av AR uttømming. Videre mutagenese av AR bindingssetet i
MIR-101
gen førte til redusert undertrykkelse av autofagi av AR. Til slutt ble autofagi hemming av Mir-101 etterligne funnet å forbedre den cytotoksiske effekten av celastrol i prostatakreftceller. Våre resultater viser at AR hemmer autofagi
via
trans av
MIR-101
, og dermed kombinasjon av MIR-101 ligner med celastrol kan representere et lovende terapeutisk tilnærming for behandling av prostatakreft.
Citation: Guo J, Huang X, Wang H, Yang H (2015) Celastrol induserer Autophagy av målretting AR /MIR-101 i prostata kreft celler. PLoS ONE 10 (10): e0140745. doi: 10,1371 /journal.pone.0140745
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 13. juni 2015. Godkjent: 30 september 2015; Publisert: 16 oktober 2015
Copyright: © 2015 Guo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av Science Foundation Natural i Heilongjiang-provinsen, Kina (C201432), Innovasjon Research Project i Harbin, Kina (2012RFLXS011) og Scientific Research Foundation for returnerte Overseas Chinese Scholars, State Education departementet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Autophagy er en fredet prosess ansvarlig for omsetningen av lang. levde proteiner eller fjerning av skadede organeller i eukaryote celler. Det er regulert av serien av autofagi relaterte gener (ATGs) som er involvert i initiering, autophagosome dannelse og modning [1]. Autophagy skjer normalt ved lave basalnivåer, men blir indusert i respons på stress stimuleringer, inkludert sult, hypoksi, eller hormonmangel [2]. Økt autofagi kan gi en fordel for kreftceller til å håndtere de forhold som ikke er gunstig for å overleve.
Celastrol, en triterpenoid isolert fra tradisjonell kinesisk medisin «Thunder Gud Vine» har vist effekt mot menneskelig prostatakreft
in vitro Hotell og
in vivo product: [3, 4]. Det fremmer destabilisering av androgenreseptoren (AR) ved inhibering av HSP90 eller aktivering av kalpain [5, 6]. AR er et medlem av steroid-superfamilien av ligand-aktiverte transkripsjonsfaktorer. Det spiller en viktig rolle i utvikling og progresjon av prostatacancer, således androgen deprivasjon gjennom medisinsk eller kirurgisk kastrering er en standard strategi for behandling av prostatakreft [7]. Blokkering AR signalveien er blitt vist å utløse autophagy i AR positive prostatacancercellelinjer, noe som er gunstig for celleoverlevelse eller celledød, avhengig av de anvendte spesifikke inhibitorer og celle sammenhenger [8-11]. Induksjon av autophagy ble funnet å forbedre cellenes levedyktighet på androgen deprivasjon og hypoksi eller under sulte betingelser [8, 9, 11]. AR degrader ble vist å indusere celledød via induksjon av autofagi [10]. Flere molekyler, slik som grp78 og AMPK har vist seg å være involvert i reguleringen av androgen deprivasjon indusert autophagy [8, 9]. Men som en transkripsjonsfaktor, den mekanismen som AR regulerer autofagi er ikke fullt ut forstått. Våre microarray data viste at Mir-101 uttrykk ble nedregulert når autofagi ble indusert av celastrol. MiR-101 har blitt rapportert som en hemmer av autofagi, som undertrykker både induksjon og modning av autofagi ved å målrette
ATG4D
,
RAB5A Hotell og
STMN1 product: [12]. I tillegg ble en AR bindingssetet spådd i oppstrømsområdet av
MIR-101
genet [13]. Disse funnene blir bedt om vår hypotese om at celastrol induserer autofagi ved å målrette AR /MIR-101 i prostatakreftceller. I denne studien, bekreftet vi AR bindingssetet i oppstrømsområdet av
MIR-101
genet ved luciferaserapportørplasmid og chip analyser. Uttrykket av MIR-101 ble funnet å korrelere med AR status i prostata kreft cellelinjer. Til tross for AR uttømming av celastrol, transfeksjon av MIR-101 etterligne i LNCaP celler førte til hemming av autofagi. Når MIR-101 ble blokkert, ble AR hemming på autofagi lettet. Videre mutagenese av AR bindingssetet i oppstrømsområdet av
MIR-101
gen førte til redusert hemming av AR-mediert autofagi.
Materialer og metoder
Chemical og oligonukleotider
Celastrol ble kjøpt fra Cayman kjemiselskap (Ann Arbor, Michigan, USA). Alle oligonukleotider ble syntetisert av Dian (Guangzhou, Kina) med følgende sekvenser: Mir-101 etterligne, 5′-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3 «; miRNA ligne Negativ kontroll (Ncontrol) # 22: 5»-UUUGUACUACACAAAAGU ACUG-3 «, MIR-101-inhibitor: 5′-UUCAGUUAUCACAGUACUGUA-3′; miRNA inhibitor Ncontrol # 22: 5»-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3 «. siRNA for AR: 5»-GGTGATCACAGGATAGGTATT-3 «, siRNA for kontroll: 5′-GGGCCATGGCA CGTACGGCAAG-3».
cellekultur og celle transfeksjonsteknologier
Menneskelig prostata kreft cellelinjer LNCaP, 22Rv1 , DU145 og PC-3 ble oppnådd fra Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology (Shanghai, Kina) og dyrket i RPMI 1640 (Gibco BRL Co. Ltd., USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Biological Industries, Israel) og 1% penicillin /streptomycin i en 37 ° C fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2/95% luft.
For androgen sult, LNCaP-celler ble dyrket i fenolrødt-fritt RPMI 1640 medium (Gibco BRL Co Ltd, USA) inneholder 1% trekull-strippet FBS (Invitrogen, Eugene, OR, USA) i 24 timer før forsøkene.
Transfeksjon ble utført ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Eugene, OR, USA). Transient transfeksjon av pEGFP-C1-AR eller tom vektor (Addgene) ble utført i LNCaP eller PC-3 celler. Etter transfeksjon, ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende 1 nM av R1881. Stabil transfeksjon av pEGFP-C1-AR eller tom vektor ble utført i DU145 cellene. Celler ble forbehandlet med R1881 (1 nM) i 24 timer før eksperimentet. LNCaP celler ble transfektert med pEGFP-LC3 (Addgene) og valgt med 0,8 mg /ml G418 (Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) for å oppnå stabile transfektanter.
Plasmider
pGL3-Basic var en sjenerøs gave fra Dr. Li Yu (Harbin Institute of Technology, Kina). For å generere reporter konstruksjoner, pGL3-B-MIR-101-L og pGL3-B-Mir-101-S, et 1793 bp DNA fragment i oppstrøms
MIR-101
genet som inneholder spådd AR bindende område og dets kortere fragment med delesjon av den anslåtte AR-bindingssetet ble amplifisert ved anvendelse av primere 5′-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCT ACAT-3 «; 5»-CCGCTCGAGTATTCCCTGCCACCCAGCTCACC-3 «, og 5′-CGCAC GCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTACAT-3′; 5»-CCGCTCGAGTATTCCCTGCC ACCCAGCTCACC-3 «, henholdsvis, og klonet inn i pGL3-Basic vektor. Reporteren konstruksjon som inneholder et 300 bp-fragment med den forutsagte villtype-AR-bindingssete, pGL3-B-MIR-101-WBS, ble amplifisert med PCR ved anvendelse av primere 5»-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTACAT-3 «, og 5»-CCGCTCGAG CTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC- 3 «. For å mutagenisere den anslåtte AR bindingssetet i pGL3-B-MIR-101-WBS (betegnet pGL3-B-MIR-101-MBS), to-trinns PCR ble utført. For det første trinn PCR, de følgende primere (muterte nukleotider ble indikert med små bokstaver): 5»-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCC TACAT-3 «; 5»-TAACTTTAtAgaATATTtaAgATAG-3 «, 5′-CTATcTtaAATATtcTaTAA AGTTA-3′; og 5»-CCGCTCGAGCTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC-3 «ble anvendt. PCR-produktene ble benyttet som templat for det andre trinnet av PCR ved bruk av ytre par av primere.
PGL3-B-MIR-101W konstruksjonen ble dannet ved PCR-amplifisering av et 2166 bp DNA-fragment inneholdende både AR-bindingssete og MIR-101-gensekvensen ved å bruke primerne 5′-CGCACGCGTGCCTTGGTCAGACTGGAT-3 «, 5′-CCGCTCGAGAT GTTACCACGCCATTTA-3′, og kloning inn i pGL3-Basic vektor. Dets mutant form av konstruksjonen, PGL3-MIR-101m, ble generert med to-trinns PCR, som beskrevet ovenfor ved hjelp av to par av primere inneholdende et mutant AR-bindingssete 5»-CGCACGCGTGCCTTGGTCAGACTGGAT-3 «; 5»-TAACTTTAtAgaATATTtaAgATAG-3 «, og 5′-CTATcTtaAATATtcTaTAAAGTTA-3′; 5»-CCGCTCGAGATGTT ACCACGCCATTTA-3 «. Bokstaver i små bokstaver indikerer muterte nukleotider.
kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Eugene, OR, USA). En total på 1,0 mikrogram av total RNA ble benyttet for å syntetisere komplementært DNA ved hjelp av EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (Transgen, Beijing, Kina). qPCR ble utført for å bestemme uttrykket nivåer av hvert gen ved å bruke de følgende primere: ATG5: 5′-GCAAGCCAGACAGGAAAAAG-3 «, 5′-GACCTTC AGTTGGTCCGGTAA-3′; ATG7: 5»-CAGGAGATTCAACCAGAGAC-3 «, 5′-AGAT ACCATCAATTCCACG G-3′; AR: 5»-CAGCAACAGCAGCAGGAAGC-3 «; 5»-CTTT TGCATTCGGCCAATGG-3 «; GAPDH: 5»-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 «; 5»-G GCATGGACTGTGGTCATGAG-3 «. Pri-MIR-101: 5»-GTATTTCGTAGGACAGG-3 «; 5»-TCTACAGGAAGCGAGT-3 «. Data ble normalisert til GAPDH uttrykket nivåer.
miRNA uttrykket ble analysert som rapportert av Shi
et al product: [14]. Kort fortalt ble total RNA (1 mikrogram) polyadenylert bruker Poly (A) Daling Kit (Ambion Inc, Foster, CA) etter produsentens anvisninger. Etter fenol-kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling, ble RNA reverstranskribert med revers transkriptase EasyScript (Transgen, Beijing, Kina) og 0,5 ug av poly (T) adapter 5′-GCTGTCA ACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGT (24) N (A /C /G ) -3 «i henhold til produsentens protokoller (Invitrogen, Eugene, OR, USA). MiR-101 ble bestemt ved anvendelse av primere 5»-GCTGTCAACGATACGCTA-3 «og 5′-CAGTACTGTG ATAACTGAA-3». Dataene ble presentert som et gjennomsnitt av tre eksperimenter og normalisert til ekspresjon av endogene U6 RNA ved hjelp av ΔΔCT metode.
Western blot-analyse
Hele cellelysatene ble fremstilt under anvendelse av RIPA-buffer inneholdende 10 mM Tris -HCI (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,1% natriumdodecylsulfat, 0,8% Triton X-100, og protease-inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Tyskland). Western blotting ble utført som beskrevet i [15]. Kort sagt ble 40 til 100 ug protein per brønn separert ved polyakrylamidgel og deretter elektro-overført til PVDF-membraner. Etter 2 timer med blokkering, ble membranene vasket og analysert med følgende primære antistoffer: kanin anti-LC3, mus anti-P62 og anti-PARP (Cell Signaling Technology, USA), mus anti-GAPDH (KC-5G4) (KANGCHEN Shanghai, Kina), mus AR (sc-816) og mus PSA (sc-7316) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Protein uttrykket ble oppdaget av ECL (PPLYGEN, Beijing, Kina) og visualisert ved hjelp av LI-COR Odyssey 2800 (LI-COR biovitenskap, Lincoln, NE, USA).
luciferaserapportørplasmid analyser
DU145 prostatakreft-celler ble sådd ut i 24-brønners plater (1 x 10
5 per brønn) i 24 timer og ko-transfektert med 300 ng av rapportør konstrukter (pGL3-B-MIR-101-L, pGL3-B-MIR -101-S, pGL3-B-MIR-101-WBS, pGL3-B-MIR-101-MBS eller pGL3-Basic), 300 ng av pEGFP-C1-AR eller pEGFP-C1 plasmider og 10 ng pRLSV40 (Promega , San Luis Obispo, CA, USA) ved hjelp Lipofectamine 2000. Etter transfeksjon ble mediet erstattet med friskt medium innehold R1881 (1 nM) og høstet 24 timer senere. Luciferasepreparater aktiviteter ble analysert ved hjelp av dual-luciferase reporter analysen system (Promega, San Luis Obispo, CA, USA) i en Turner TD20 /20 luminometer og normalisert til Renilla luciferase aktivitet.
chip analyser
brikken ble utført som tidligere rapportert [16]. Kort sagt ble DU145 eller LNCaP-celler transfektert med pEGFP-C1-AR eller pEGFP-C1. Etter 24 timers transfeksjon, ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende 1 nM av R1881 over natten. Celler ble høstet og tverrbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C. Fikserte celler ble vasket med iskald fosfatbufret saltløsning, og resuspendert i iskald hypotonisk buffer (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl
2 og 10 mM KCI), etterfulgt av homogenisering. Oppsamlede kjerner ble resuspendert i hypotonisk buffer og sonikert til en midlere DNA lengde på 200-1000 bp. Alikvoter (1%) av skjærpåvirkede DNA ble fjernet som input, og resten ble anvendt for individuell ChIP reaksjon like. De kromatin oppløsninger ble klaret ved tilsetning av protein A-Sepharose (GE Healthcare, Fairfield, USA) i 2 timer og inkubert med 10 ug av AR-antistoff eller IgG som en negativ kontroll over natten ved 4 ° C. De protein /DNA immunkompleksene ble samlet opp ved sentrifugering ved 4 ° C, vasket med fortynningsbuffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA og protein-inhibitor cocktail), og elueringsbuffer (0,1 M NaHCO
3 og 1% SDS). Protein /DNA-kryssbindinger ble reversert ved tilsetning av NaCl til en sluttkonsentrasjon på 200 mM, fulgt av inkubering ved 65 ° C i 4 timer. Etter DNA-rensing, ble PCR utført for å påvise MIR-101-ekspresjon ved hjelp av de følgende primere: 5′-CGCACGCGTAATGGATTTATTTCCTACCCTA CAT-3 «, og 5′-CCGCTCGAGCTTTCTTCTTTTGTTTTTCATTTTC-3». PCR-produktene ble analysert på agarosegeler (2%) med etidiumbromid.
Konfokalmikroskopi
LNCaP-celler med GFP-ekspresjon LC3 ble sådd i 6-brønns plater. Etter celastrol behandling ble cellene fiksert i 4% paraformaldehyd i 15 minutter og vasket med PBS tre ganger. Cellene ble deretter permeabilisert med 0,05% (v /v) Triton X-100, farvet med DAPI (Invitrogen, Eugene, OR, USA) og analysert ved bruk av konfokal mikroskop (Zeiss, LSM510). Antallet GFP-LC3 punktat ble kvantifisert. Positive celler som inneholdt fem eller flere puncta ble valgt. Femti celler pr tilstand per forsøk ble analysert.
MTT-analyser
LNCaP-celler ble sådd i en 96-brønns plate (5000 /brønn). Etter behandling, ble MTT (5 mg /ml) tilsatt og inkubert ved 37 ° C i 4 timer for å tillate fullstendig kløyving av tetrazoliumsaltet av metabolsk aktive celler. Cellelyseringsbuffer (20% SDS, 20 mM HCl) ble tilsatt til hver brønn, fulgt av kolorimetrisk analyse ved anvendelse av en Microplate iMark absorbans Reader (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ved 595 nm.
Colony formasjons analyser
LNCaP celler ble behandlet med celastrol i nærvær eller fravær av Mir-101 etterligne eller negativ kontroll eller bafilomycin A1 (Sangon biotech, Shanghai, Kina) i 24 timer. Etter behandling, ble LNCaP-celler (500 /brønn) podet i seks-brønns plate og dyrket i 15 dager uten forstyrrelse. Cellene ble deretter fiksert med 4% formaldehyd i PBS og farget med krystallfiolett. Kolonier med over 50 celler ble talt opp.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS statistisk programvare. Alle verdier ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD, ble to gruppesammenligninger utført ved anvendelse av parede t-test. Data fra flere grupper ble analysert ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Dunnetts test. For alle testene, ble signifikansnivået definert som * eller #,
P
0,05; **
P
. 0,01
Resultater
Celastrol induserer autofagi i menneskelige prostata kreft celler
Målrette AR med celastrol for prostatakreft behandling har blitt vist av flere grupper [3, 5]. Siden AR hemming er assosiert med autofagi induksjon, enten celastrol kan indusere autofagi i menneskelig prostata kreft celler ble bestemt. Som vist i figur 1, induksjon av autophagy-relaterte gener
ATG5
og
ATG7
ble observert ved tidlige tidspunkter etter celastrol behandling i LNCaP prostatakreftceller (figur 1A). ATG7 fungerer som ubiquitin E1 enzym mens ATG5 virker som ubiquitinering substrat eller en E3-lignende enzym i den to-trinns prosess ubiquitinering [1]. I samsvar med sine funksjoner i autofagi induksjon,
ATG7
viste høyere uttrykk og tidligere respons enn
ATG5
på celastrol behandling (fig 1A). Både ATG5 og ATG7 er nødvendig for rekruttering av LC3, den mikrotubul-assosiert protein som diffunderer i cytoplasma, til autophagosome membran. For å visualisere LC3 rekruttering, ble LNCaP-celler transfektert med et plasmid som koder GFP-merket LC3. GFP-LC3 puncta ble observert å øke betydelig etter 6 timer behandling med celastrol (fig 1B og 1C). I samsvar, konvertering fra LC3-I sin lipid skjema LC3-II, kjennetegnet av autofagi, ble oppdaget etter 3-6 h behandlinger og økt merkbart etter 12-24 timers behandling (Fig 1D). p62 er en reseptor på autophagosome membran, som degraderes i lysosomet etter autophagosome fusjon med det [17]. p62 protein nivået ble redusert etter 6-24 h behandling med celastrol (figur 1D), ytterligere bekrefter at celastrol indusert autofagi i LNCaP celler.
Foreldre LNCaP celler (A, D) eller celler transfektert med GFP-LC3 (B, C) ble behandlet med celastrol på 2,0 pM for angitte tidspunkter. mRNA uttrykk for Autophagy relaterte gener ble målt ved qPCR (A). RQ, relative mengden. GFP-LC3 transfekterte celler ble farget med DAPI etter behandlingene. GFP-LC3 puncta ble observert i henhold til konfokalt mikroskop (B) og kvantifisert i C. Cellene som inneholdt over 5 puncta ble utvalgt og femti celler ble analysert for hver behandling. D, protein ekstrakter ble immunoblottet med antistoffer mot LC3, p62 og GAPDH (lasting kontroll). Stjernene betegner betydning sammenlignet med kontrollen (0 timer). *,
P
0,05; **
P
. 0,01
AR uttrykk nivåer inverst korrelert med celastrol-indusert autofagi
I de samme prøvene fra oven, AR protein ble redusert av celastrol under autofagi induserende prosesser. Celastrol behandling forårsaket en betydelig nedgang i AR uttrykk nivåer på 3-6 h tidspunkter og en nesten fullstendig utarming på 12-24 h tidspunkter (Fig 2A). I tråd med ovennevnte funn, siRNA knockdown av AR i AR positive LNCaP celler førte til ~ 2 ganger økning av LC3-I til LC3-II konvertering (figur 2B). Sammenlignet med kontrollgruppen, ble p62-protein ble redusert med AR siRNA (figur 2B), hvilket indikerer at AR negativt regulert autophagy. Syntetisk androgen R1881 ble anvendt for å aktivere endogent AR signalisering i LNCaP-celler, som ble dokumentert av den økte protein nivåer av AR og dens target PSA (figur 2C). Med AR signaleringsaktivering, ble autophagy hemmet som vist ved økning i p62-nivå og en halv ganger reduksjon av LC3-II /LC3-I-forholdet (figur 2C), noe som ytterligere bekrefter at AR spiller en negativ rolle i autophagy regulering. I tillegg ble pEGFP-AR transfektert inn i LNCaP-celler. Etter celastrol behandling, redusert konvertering av LC3-I til LC3-II ble påvist i pEGFP-AR transfekterte celler sammenlignet med modell transfeksjon (figur 2D), noe som indikerer at tvang AR overekspresjon hemmet autofagi utløst av celastrol. Celastrol også indusert autophagy i AR negative DU145-celler, som kan undertrykkes ved eksogent AR (figur 2E).
a, LNCaP-celler ble behandlet med celastrol på 2,0 pM for angitte tider, proteinnivået av AR ble avslørt ved Western blotting ved anvendelse GAPDH som en lasting kontroll. B, LNCaP-celler ble transfektert med AR siRNA eller tak siRNA i 24 timer, ble effekt på AR knockdown og autofagi induksjon verifisert ved Western blotting ved anvendelse AR, LC3, p62 og GAPDH (lasting kontroll) antistoffer. C, LNCaP-celler ble underkastet androgen sult, som beskrevet i «Materialer og metoder», etterfulgt av 1 nM av R1881 behandling i 24 timer. AR og dens mål PSA, samt autophagic maskin LC3 og p62 ble påvist ved Western blotting ved anvendelse GAPDH som en lasting kontroll. LnCap (D) eller DU145 (E) celler ble transfektert med pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) eller tom vektor (EGFP-V). D, Etter transfeksjon, LNCaP-celler ble dyrket i medium inneholdende R1881 (1 nM) og behandlet med eller uten celastrol (CEL) med 2,0 uM i 24 timer (D). E, DU145 stabilt transfekterte celler ble forbehandlet med R1881 (1 nM) i 24 timer før celastrol behandling som D. LC3 ble påvist ved Western blotting ved anvendelse GAPDH som en lasting kontroll.
AR medierer undertrykkelse av MIR-101 uttrykk ved celastrol behandlinger
for å se miRNA involvering i prosessen med celastrol-indusert autofagi, ble LNCaP celler behandlet med celastrol for 12 timer for å indusere autofagi. Mirna utvalg ble utført og viste at uttrykket av MIR-101, en autofagi inhibitor, ble redusert med celastrol (data ikke vist). Undertrykkelse av MIR-101 uttrykk ved celastrol ble bekreftet ved RT-PCR, som avslørte et ~ 3 ganger reduksjon av pri-MIR-101 og modne MIR-101 i LNCaP celler legge celastrol behandling (figur 3A, venstre og i midten). Dette ble fulgt av en nesten fullstendig nedbryting av AR (figur 3A, høyre), noe som tyder på en positiv korrelasjon mellom AR og Mir-101 uttrykk etter celastrol behandling. AR er en transkripsjonsfaktor og dets bindingssete har blitt spådd i oppstrømsområdet av
MIR-101
genet [13]. Dermed kan det tenkes at AR er mellommann for undertrykkelse av MIR-101 uttrykk ved celastrol. For å teste denne muligheten, må vi først bestemt om AR kunne binde seg til den anslåtte AR bindingssetet i oppstrømsområdet av
MIR-101
genet ved luciferaserapportørplasmid analyser. Luciferase reporter-konstruksjoner ble generert som vist i figur 3B. pGL3-B-Mir-101-S (uten spådd AR bindingssetet) viste omtrent fem ganger nedsatt luciferase aktivitet sammenlignet med pGL3-B-MIR-101-L (med fragmenter som omfatter den anslåtte AR bindingssetet) (Fig 3C ). I tillegg pGL3-B-MIR 101-MBS-der AR-bindingssetet ble mutert viste ~ 5 ganger nedsatt luciferase aktivitet sammenlignet med pGL3-B-MIR-101-WBS som inneholdt villtypen bindingssetet (fig 3C) , noe som indikerer at denne spesifikke sekvens er ansvarlig for AR identifikasjon. Deretter brukte vi chip analyser for å fastslå om AR kunne binde seg til denne sekvensen. DU145-celler ble transfektert med pEGFP-AR eller pEGFP-V. Kjerneproteiner ble isolert og immunopresipitert med enten AR-antistoff eller kontroll mus IgG. Som ventet ble MIR-101 fragment som inneholder bindingsstedet spesielt forsterket i celler transfektert med pEGFP-AR (Fig 3D øvre), som viser at AR kan bli rekruttert til dette nettstedet. I LNCaP celler,
MIR-101
fragmentet ble forsterket etter mock transfeksjon (Fig 3D nederst), som viser at endogen AR kan bli rekruttert til ARE av
MIR-101
. Til slutt, AR overekspresjon helt reddet pri-MIR-101 og modne Mir-101 uttrykk etter celastrol behandling, viser AR formidling
MIR-101
transkripsjon reduksjon på celastrol behandling (figur 3E).
En , MIR-101 og AR uttrykk etter celastrol (CEL) behandling. **
P
0,01, sammenlignet med DMSO. B, Skjematisk fremstilling av luciferase reporter konstruerer som beskrevet i «Materialer og metoder». Villtype og mutant AR bindingsseter ble angitt med kursiv dash og kryss, henholdsvis. C, DU145-celler ble transfektert med angitte reporter-konstruksjoner, i nærvær av pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) eller pEGFP-C1 (EGFP-V) plasmid i 24 timer, og deretter luciferase-aktivitet ble detektert. pRLSV40 plasmid ble co-transfektert for normalisering. **
P
0,01, mellom EGFP-AR og EGFP-V trans. D, ChIP analysen. Celleekstrakter fra DU145 eller LNCaP celler transfektert med pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) eller pEGFP-C1 (EGFP-V) ble immunoutfelt med AR antistoff eller vanlig mus IgG. Input var 1/100 av ultralydbehandlet kromatin før immunoprecipitation. PCR ble utført som beskrevet i avsnittet «Materialer og metoder». E, LNCaP-celler transfektert med pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) eller tom vektor (EGFP-V) ble behandlet med celastrol (CEL, 2,0 pM) eller DMSO i 3 timer, pri-MIR-101 og modne MIR-101 nivåer ble bestemt ved qPCR. Stjernene betegne betydning mellom EGFP-AR og EGFP-V trans. *,
P
0,05; **
P
. 0,01
AR regulerer Mir-101 uttrykk i menneskelige prostata kreft celler
AR status kan påvirke Mir-101 uttrykk i menneskelig prostata kreft celler. Real-Time PCR viste at uttrykket nivåer av pri-MIR-101 samt modne MIR-101 var betydelig høyere i AR-positive LNCaP og 22Rv1 celler enn i AR-negative DU145 og PC3 celler (figur 4A). AR ble slått ned av siRNA i LNCaP (figur 4B, venstre) eller 22Rv1 celler (fig 4B, høyre). AR knockdown resulterte i redusert uttrykk for moden MIR-101, som var sammenlignbare med reduksjon av pri-MIR-101 i både LNCaP og 22Rv1 celler (figur 4C). Tvunget AR uttrykk forårsaket MIR-101 nivåer økt i AR-negative DU145 og PC3 celler (figur 4D). Tilsvarende eksogene AR også økt Mir-101 uttrykk etter celastrol behandling (figur 4D). I LNCaP celler, endogen AR ble re-aktiveres ved R1881 etter androgen deprivasjon. Med AR aktivering (figur 4E, øvre), ble uttrykket nivåer av MIR-101 oppregulert (Fig 4E). Disse resultatene viser at AR hovedsak regulerer
MIR-101
transkripsjon, men ikke modning.
A, Uttrykk for pri-MIR-101 og modne MIR-101 ble bestemt i AR positiv eller negativ celle linjer ved qPCR. **
P
0,01 mellom to forhold grupper. B, LNCaP eller 22Rv1 celler ble transfektert med AR siRNA eller kontrollere siRNA (ctrl siRNA). AR knockdown effekter ble bekreftet ved Western blotting. Uttrykk for pri-MIR-101 og modne MIR-101 ble bestemt ved qPCR (C). *,
P
0,05
versus
kontroll siRNA. D, DU145 eller PC-3-celler ble transfektert med pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) eller tom vektor (EGFP-V) og behandlet med DMSO eller celastrol (CEL, 2 uM) i 24 timer. Uttrykk for modne MIR-101 ble bestemt av qPCR. *,
P
0,05 mellom EGFP-AR og EGFP-V trans. E, LNCaP-celler ble behandlet med R1881 (1 nM) i 24 t etter androgen sult, som beskrevet i figur 2C. AR proteinnivåer ble bestemt ved Western blotting ved anvendelse GAPDH som en lasting kontroll. MiR-101 uttrykk ble bestemt av qPCR. **, P. 0,01
versus
DMSO
AR hemmer celastrol-indusert autofagi via regulering av
Mir-101
i prostatakreftceller
Deretter bestemmes vi om AR negativt regulerer celastrol-indusert autofagi gjennom hemming av Mir-101 uttrykk i prostatakreftceller. MiR-101 etterligne ble brukt til å øke den MIR-101-nivå i LNCaP-celler. Med MIR-101 oppregulering av tilsetning av Mir-101 etterligne (figur 5A, øvre), basal nivå autofagi ble hemmet (LC3-II /LC3-I ratio redusert til det halve) (figur 5A, nederst). Selv om AR reduksjon av celastrol var gunstig for autophagy induksjon, tilsetning av MIR-101 etterligne resulterte i autofagi inhibering som vist ved den halv-gangers reduksjon av LC3-II /LC3-I-forhold og økning av p62 nivå (figur 5A, nederst). I DU145 cellene, kunne stabil uttrykk for eksogene AR oppregulere Mir-101 uttrykk og kunne undertrykke autofagi utløst av celastrol. Når MIR-101 ble inhibert ved tilsetning av MIR-101-inhibitor, som bestemt ved qPCR (figur 5B, øvre del), ble autophagy reddet uavhengig av AR overekspresjon (figur 5B, nederst). Disse dataene tyder på at den negative rollen AR spilt i reguleringen av autophagy avhenger nedstrøms mål. Videre er et par av MIR-101 uttrykk konstruerer, pGL3-B-MIR-101-W som inneholder villtypen er, og pGL3-B-MIR-101-M som har mutert ARE ble generert. pGL3-B-MIR-101-W betydelig forbedret Mir-101 uttrykk enn pGL3-B-MIR-101-M i kotransfeksjonen med eksogen AR i DU145 celler med eller uten celastrol behandling (figur 5C). I henhold til mir-101 nivåer, co-transfeksjon med pGL3-B-MIR-101-W som kan transactivated av AR viste mer suppresjon på autofagi på basalnivået eller celastrol indusert i forhold til pGL3-B-MIR-101- M som ikke kunne bli gjenkjent av AR (fig 5C), noe som indikerer at AR hemmer celastrol-indusert autofagi via trans av MIR-101.
for å se om MIR-101 kan påvirke AR undertrykkelse på celastrol-indusert autofagi, AR positive LNCaP-celler ble transfektert med MIR-101 etterligne eller negativ kontroll (NC) i 24 timer (A), etterfulgt av ytterligere 24 timers behandling med celastrol (2,0 uM, CEL). MiR-101-nivåer ble bestemt ved RT-PCR. #
P
0,05
versus
NC transfeksjon uten celastrol treament. **
P
0,01 mellom MIR-101 og NC transfections med celastrol behandling. Protein nivåer av LC3 og p62 samt AR ble bestemt ved Western blotting ved anvendelse GAPDH som en lasting kontroll. B, AR negativ DU145-celler ble transfektert med pEGFP-C1-AR (EGFP-AR) eller tom vektor (EGFP-V) i nærvær av MIR-101 inhibitor (MIR-101 Inh) eller negativ kontroll (NC). Celler ble inkubert i celastrol (2,0 uM, CEL) i ytterligere 24 timer. MiR-101-nivåer ble bestemt ved RT-PCR. #
P
0,05
versus
EGFP-V plus NC trans. *,
P
0,05 mellom EGFP-V og EGFP-AR i nærvær av MIR-101-hemmer. Protein nivåer av AR, ble LC3and p62 oppdaget av Western blotting. C, DU145 cellene ble transfektert med pGL3-B-MIR-101-W (med villtype AR bindingssetet) eller pGL3-B-MIR-101-M (med mutant AR bindingssete), sammen med AR uttrykk vektor (EGFP- AR) eller tom vektor (EGFP-V) i 24 timer, deretter behandlet med DMSO eller celastrol (CEL, 2,0 mM) i ytterligere 24 timer. MiR-101-nivåer ble bestemt ved RT-PCR. #
P
0,05
versus
EGFP-V plus pGL3-B-MIR-101-M trans. *,
P
0,05 mellom pGL3-B-MIR-101-M og pGL3-B-MIR-101-W trans. Protein nivåer av AR, LC3 og p62 ble påvist ved Western blotting ved anvendelse GAPDH som en lasting kontroll.
AR modulerer Mir-101 uttrykk uten at det påvirker celledød
Siden AR reduksjon også resulterer i redusert cellelevedyktighet, hvorvidt den observerte MIR-101 undertrykkelse og autofagi induksjonen skyldtes celledød ble bestemt. LNCaP celler ble behandlet med AR antagonist MDV3100 (Enzalutamide) for ulike tider. Som forventet, ble AR-protein ble redusert (figur 6A).
