Abstract
Mål
Samspill mellom stromale og kreftceller spiller en dynamisk rolle i å initiere og styrke kreftutvikling. I denne studien undersøkte vi krysstale mellom kolorektal kreft (CRC) celler med stromale fibroblaster og den anti-kreft effekt av curcumin og 5-fluorouracil (5-FU), spesielt i kreft stamcelle (CSC) overlevelse i en 3D-co -Kultur modell som etterligner
in vivo
svulstens mikromiljø.
Metoder
Colon carcinoma celler HCT116 og MRC-5 fibroblaster var co-dyrket i et enkelt lag eller høy tetthet svulstens mikromiljø modellen
in vitro
med /uten curcumin og /eller 5-FU.
Resultater
Ettlagskulturer svulstens mikromiljø co-kulturer støttes intensiv crosstalk mellom kreftceller og fibroblaster og forbedret opp -regulation av metastatiske aktive adhesjonsmolekyler (β1-integrin, ICAM-1), transformerende vekstfaktor-β signalmolekyler (TGF-β3, p-Smad2), spredning assosierte proteiner (cyklin D1, Ki-67) og epitelial-til- mesenchymale overgang (EMT) faktor (vimentin) i HCT116 sammenlignet med kreftmonokulturer. Høy tetthet tumor mikro ko-kulturer synergistisk øket tumorfremmende faktorer (NF-kB, MMP-13), TGF-β3, foretrekkes CSC overlevelse (karakterisert ved oppregulering av CD133, CD44, ALDH1) og EMT-faktorer (økt vimentin og Slug, redusert E-cadherin) i HCT116 sammenliknet med høy tetthet HCT116 monokulturer. Interessant, denne synergistiske crosstalk var enda mer uttalt i nærvær av 5-FU, men dramatisk redusert i nærvær av curcumin, indusere biokjemiske endringer i mesenchymale-epitelial overgang (MET) for derved sensibiliserende cscs til 5-FU-behandling.
Konklusjon
berikelse av cscs, bemerkelsesverdig aktivering av tumorfremmende faktorer og EMT i høy tetthet co-kultur fremhever at crosstalk i svulsten mikromiljøet spiller en avgjørende rolle i tumor utvikling og progresjon, og dette samspillet ser ut til å være formidlet i det minste delvis av TGF-β og EMT. Modulering av denne synergiscrosstalk av curcumin kan være en potensiell behandling for CRC og undertrykke metastase
Citation. Buhrmann C, Kraehe P, Lueders C, Shayan P, Goel A, Shakibaei M (2014) Curcumin Undertrykker Høring mellom Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP stamceller og stromal Fibroblaster i svulstens mikromiljø: potensielle rolle EMT. PLoS ONE ni (9): e107514. doi: 10,1371 /journal.pone.0107514
Redaktør: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore
mottatt: 26 juni 2014; Godkjent: 13 august 2014; Publisert: 19.09.2014
Copyright: © 2014 Buhrmann et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er inkludert i papir
Finansiering:.. Forfatterne fikk ingen spesifikke midler til dette arbeidet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste kreftformen i verden, og utgjør store kliniske problemer på grunn av sin høye metastase og tilbakefall [1], [2]. Samle bevis tyder på at utvikling og progresjon av tykktarmskreft skyldes genetiske og epigenetiske forandringer som er et resultat av komplekse interaksjoner av transformerte celler med sitt mikro [1], [3]. Svulsten mikromiljøet er ansett som den svulsten seng, som består av fastboende komponenter, for eksempel stromale celler og de faktorer som er stabile i miljøet av stroma og utenlandske komponenter som for eksempel ulike immuncellepopulasjoner, som påvirker tumorinvasjon og metastase [4]. Den synergistiske virkningen av mikromiljøet på betennelsesreaksjoner og tumorprogresjon er nå ansett å være en viktig funksjon i kreftutvikling [1], og det er en økende interesse for identifisering av midler som spesifikt retter veien samspillet mellom kreft og stromale celler [5 ].
det er blitt foreslått at CRC dannelsen oppstår fra en liten sub-populasjon av selvfornyende tumor stamceller som ligger innenfor colonic krypten [6], [7]. Faktisk, CRC stamceller (CSC) utviser egenskaper som ligner på fysiologiske stamceller og er ansvarlig for tumorprogresjon [7], [8]. Nylig er det blitt foreslått at cscs er de unike celletype i svulsten mikromiljøet som opprettholder mikromiljøet og forbedre kreft metastase og invasjon [4], [9]. Videre har det vist seg at CSC kan direkte eller indirekte kontakt med flere immuncellepopulasjoner i svulsten mikromiljøet, som er antatt å vesentlig påvirke tumorprogresjon [4].
å identifisere midler som er i stand til å undertrykke krysstale mellom kreft og stromale celler i tumoren mikromiljøet kan være et viktig terapeutisk mål for å undertrykke metastatisk potensial av cscs. For å utvikle nye behandlingsstrategier for CRC, er det derfor viktig å studere nærmere samspillet av cscs med
bosatt Hotell og
ikke-resident
komponenter i sin mikromiljøet å belyse detaljert mekanismer som CRC utvikling og progresjon er under kontroll.
som en stor andel av CRC er knyttet til miljøfaktorer [1], kosttilskudd tilby seg selv som ideelle kandidater til å modulere svulsten mikromiljøet og dermed støtter kjemoterapi. Faktisk er dette viktig fordi mer enn 15% av pasientene utvikler resistens mot konvensjonelle /strøm kjemoterapi med 5-fluorouracil (5-FU) og mer enn 50% av pasientene utvikler tilbakefall [10]. Vi og andre har tidligere vist at kosttilskudd, slik som curcumin, kan direkte påvirke CRC stamceller ved å øke deres kjemosensitivitet for kjemoterapeutisk behandling, og således merkbart øker positivt terapeutisk resultat [11] – [13]. Avledet fra rotstokker av anlegget
curcuma longa
, curcumin (diferuloylmethane) er en naturlig forekommende gul polyphenol som formidler sine effekter ved modulering av flere viktige molekylære mål inkludert transkripsjonsfaktorer (NF-kB, AP-1, β -Catenin), enzymer (for eksempel COX-2, MMP), pro-inflammatoriske cytokiner (for eksempel TNF-a, IL-1 og IL-6), og celleoverflate adhesjonsmolekyler (f.eks Cadherins, Integriner) [14] – [ ,,,0],16]. Modulering av matriks-metalloproteinase (MMP) ekspresjon i tumoren (mikro) -miljø er viktig som MMP’er er kjent markører for CRC progresjon [17] – [19]. Tumormetastase og invasjon er videre påvirket av tumorcelleinteraksjon med epitel og endotel-celler. Vedheft og signalmolekyler, slik som integriner spiller en viktig rolle under CRC progresjon og metastase [20], [21]. Videre intracellulær adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) har vist seg å øke tumorcelle-proliferasjon og invasjon og er blitt identifisert som å være ansvarlig for endotelial adhesjon av cancerceller, og dermed sterkt å påvirke metastatisk potensiale [22], [23]. Svulsten mikromiljøet videre induserer NF-kB aktivering som er kjent for å regulere flere gener som er involvert i startfasen, forfremmelse, og metastase [24], [25], og indusere Wnt aktivitet som spiller en avgjørende rolle i biologi CRC stamceller [ ,,,0],26].
Transforming growth factor-β (TGF-β) er et multifunksjonelt polypeptid som spiller en viktig rolle i differensiering, spredning og embryoutvikling i normalt vev. Vevceller syntetisere og utskille TGF-β inn i mikromiljøet hvor det binder til spesifikke TGF-p-reseptorer for parakrine og autokrine signalering. Dette ligand og reseptor kompleks stimulerer intracellulære signalkaskader som inkluderer den kanoniske Smad2 signalveien [27], som danner komplekser med Smad4 og akkumuleres og translocates inn i kjernen. I kjernen, aktiverte Smad komplekser regulere transkripsjonen av spesifikke gener og til slutt regulerer cellesyklusen og reparasjon av vev [27]. Det er kjent at TGF-β er en tumor suppressor i normale vevsceller og i tidlige stadier av tumorprogresjon. I tumorceller i veksthemmende virkning av TGF-β signalering er feilregulert og det skifter fra tumor suppressor til tumor-fremmende faktor i forskjellige organer [27], [28]. Videre har det blitt rapportert at stimulering av TGF-β på stromale celler fører til sekresjon av IL-11 og øker evnen til metastasering av CRC-celler, mens dyr som ble behandlet med en spesifikk hemmer av TGF-β reseptor 1 er ettergivende til metastasedannelse [ ,,,0],29]. Interessant nok er det blitt rapportert at sekresjon av cytokiner og vekstfaktorer med stromale celler i en tumor mikromiljøet utløser en epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) som støtter medikamentresistens, tumorresidiv, invasjon og metastase av neoplastiske celler [30]. Videre er E-cadherin ekspresjon nedregulert i løpet av EMT, og dette kan bli blokkert av sinkfingertranskripsjondempere, slik som Slug og denne prosessen er reversibel [31] -. [34]
Karakterisering av molekylære mekanismer som er involvert i tumoren fremme rollen av TGF-β signalering og EMT i en svulst mikromiljøet mellom fibroblaster og tumorceller kan bidra til å utvikle terapeutiske strategier mot tumorutvikling som CRC. Derfor er målet med den presenterte studien var å undersøke nærmere samspillet av CRC celler med stromale fibroblaster, aktivering av kreftfremmende betennelse proteiner, parakrine meklere og moduleringseffekter av curcumin og 5-FU, spesielt på CRC stamceller og EMT i en
in vitro
kreft mikro co-kultur, som simulerer
in vivo
svulstens mikromiljø.
Materialer og metoder
Antistoffer
monoklonale anti-ALDH1 ble oppnådd fra acris Antistoffer GmbH (Herold, Tyskland). Monoklonale anti-CD133 og anti-CD44 ble innkjøpt fra Abcam PLC (Cambridge, UK). Anti-β-aktin, anti-cyclin-D1, anti-ICAM-1, anti-vimentin, anti-E-cadherin, anti-Slug, anti-TGF-β3, anti-TGF-β3R og anti-p-Smad2 var innhentet fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Anti-MMP-1, anti-MMP-9 og anti-MMP-13 ble kjøpt fra R Pierce, Rockford, IL, USA). Som substrater for alkalisk fosfatase
Statistisk analyse
Tall data er uttrykt som middelverdier (+/- SD) for et representativt eksperiment utført i tre eksemplarer. Midlene ble sammenliknet med Student
t
test forutsatt like avvik. Forskjeller ble ansett for å være statistisk signifikant hvis
p
verdien var mindre enn 0,05.
Resultater
For å forstå noen av de viktigste biologiske atferd av stromale og kreftceller, simulere en
in vivo
svulstens mikromiljø,
in vitro
co-kultur systemer ble etablert. Fokuset i denne studien var å undersøke interaksjonen av HCT116 tykktarmskreftceller med human-fibroblast-MRC-5-celler i en høy tetthet ko-kultur mikro modell med eller uten curcumin og /eller 5-FU på tumorcellevekst, tumor-fremmende faktorer , invasjon, EMT og kolorektal cscs.
den intensive crosstalk mellom HCT116 og MRC-5 celler i monolayer co-kultur mikromiljøet påvirker uttrykket av molekyler involvert i heft, invasjon og /eller spredning
HCT116 og MRC-5-celler ble ko-dyrket i et forhold på 01:01 i tre dager i monolaget og evaluert med lysmikroskopi. HCT116-celler bokstavelig akkumulert og klaser i MRC-5-celler som søker og etablering av tett celle-til-celle kontakt med MRC-5-celler i tumoren ko-kultur (fig. 1, PC). Deretter utførte vi immunfluorescens farging av monolags co-kulturer for å undersøke om den observerte celle interaksjonen fører til funksjonelle endringer i cellene. HCT116-celler i monolagskultur eller HCT116 og MRC-5-celler i monolag-ko-kulturer ble merket med β1-inte, ICAM-1, Ki-67, Cyclin D1, TGF-β3, p-Smad2 og vimentin (fig. 1, OM ). Vi observerte sterke uttrykk for vedheft og metastatisk molekyler β1-Inte, ICAM-1, aktive cellesyklusproteiner Ki-67, cyclin D1, av TGF-β3, p-Smad2 og EMT markør vimentin i HCT116 co-kulturer i forhold til HCT116 mono-kultur (fig. 1). Samlet utgjør disse funnene tyder på at stromal celleinteraksjon er avgjørende i tumorvekst, og dermed skape en mobil mikromiljøet som regulerer kreft progresjon.
HCT116-celler (piler) var enten dyrket alene eller samtidig var dyrket med MRC-5 -celler (*) i et forhold på 1:01 til tre dager på glassplater i monolag og fiksert med metanol. For immunolabeling celler ble inkubert med primære antistoffer mot β1-inte, ICAM-1, Ki-67, cyclin D1, TGF-β3, p-Smad2 og vimentin) etterfulgt av inkubering med rhodamin-coupled sekundære antistoffer og kontra med DAPI å visualisere celle kjerner. Bilder vist er representative for tre ulike eksperimenter. PC: fasekontrast; IF: immunfluorescens; Forstørrelse 400 ×; bar = 30 nm.
curcumin og /eller 5-FU sterkt påvirke celle integritet i høy tetthet svulstens mikromiljø co-kulturer
Neste, vi evaluert høy tetthet svulstens mikromiljø co-kulturer , HCT116 i høy tetthet ko-dyrket med MRC-5 i monolaget, som etterligner
in vivo
situasjon for å undersøke påvirkning av parakrine terapeutiske midler på krysstale mellom cellene og på tumorcelle-proliferasjon, tumor-fremmende faktorer, invasjon og dannelsen av tumor-sfærer, et fremtredende trekk ved kreft stamceller. Faktisk er det blitt rapportert at normale fibroblast-celler er i stand til å indusere differensiering av tumorceller, for eksempel fra et human colon carcinoma cellelinje [38], [39]. Effekten av 5-FU og /eller curcumin på cellulær integritet og colonosphere dannelse i tumor-mikromiljøet kulturer ble evaluert i HCT116-celler etter 10 dager. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av curcumin eller 5-FU (0, 0,1, 1, 5 og 10 uM) og colonosphere Dannelse ble evaluert ved lysmikroskopi, som beskrevet i Materialer og Metoder. Den enkelte IC
50 av curcumin eller 5-FU var tilnærmet 5 pm eller fra -3,5 ym, henholdsvis (p 0,05). For å evaluere effekten av kombinert behandling ble HCT116-celler forbehandlet med 5 uM curcumin i 4 timer og deretter ko-behandlet med forskjellige konsentrasjoner av 5-FU (0, 0,1, 1, 5 og 10 uM) i 10 dager. Interessant, forbehandling med curcumin redusert IC
50-verdier for 5-FU til 0,1 gM i HCT116 (p 0,05) (figur 2A.). Dette tyder på at curcumin sensitizes HCT116 cellene til 5-FU. Videre, toluidin blå farging i kontrollkulturer viste at cellene dannet godt utviklet sfæroide kolonier i løpet av dyrkningsperioden (Fig 2B: a.). Behandling av HCT116 kulturer med 5-FU (5 uM) eller curcumin (5 uM) alene eller sammen med curcumin og 5-FU (5 uM /0,1 gM) ble vist å være meget effektive i å hemme colonosphere dannelse og øke oppløsningen av høy densitet tumor kuler i forhold til de tilsvarende kontroller (figur 2B: a.). Denne effekten var høyere i med curcumin eller curcumin /5-FU-behandlede ko-kulturer (figur 2B: a.). Deretter undersøkte vi cellulært opptak av curcumin ved HCT116 i tumor-mikromiljøet ko-kulturer med fluoriserende mikroskopi. Resultatene viste klart at curcumin ble tatt opp av alle HCT116-celler i curcumin behandlede mikromiljøet ko-kulturer (figur 2B.: B). For å undersøke, om monolags MRC-5-celler i mikromiljøet som ko-kulturer overlever behandling med 5-FU, curcumin og /eller 5-FU, farget vi cellene med toluidinblått. Som vist på fig. 2C: en, de MRC-5 celler er godt farget som er et tegn på vitalitet. Videre curcumin ble tatt av alle MRC-5-celler i curcumin behandlede tumor mikro ko-kulturer (figur 2C.: B).
A: Kvantifisering av antall colonosheres ble oppnådd ved å telle antallet av sfæroide kolonier fra 10 mikroskopiske felt i høy tetthet mikro co-kulturer. Kulturer ble enten ubehandlet (Co) eller ble behandlet med 5-FU (0,1, 1, 5 eller 10 uM), curcumin (0,1, 1, 5 eller 10 uM) eller ble forbehandlet med curcumin (5 uM) i 4 timer, og deretter eksponert til 5-FU (0,1, 1, 5 eller 10 uM) i 10 dager og undersøkt ved lysmikroskopi. Verdier ble sammenlignet med kontrollgruppen og statistisk signifikante verdier med
p
0,05 ble utpekt av en stjerne (*) og
p
0,01 ble utpekt av en stjerne (**). Toluidin blå farging profil (2B /C, a) og cellulær curcumin opptak (2B /C, b) HCT116 (B) med høy tetthet og i MRC-5 (C) i monolag ko-kulturen. Svulstens mikro ko-kulturer ble enten ubehandlet (Co) eller ble behandlet med 5-FU (5 uM) (5-FU), curcumin (5 uM) (Cur) eller ble forbehandlet med curcumin (5 uM) i 4 timer, og deretter eksponert til 5-FU (0,1 gM) (Cur + 5-FU) i 10 dager og undersøkt under et lys eller fluoriserende mikroskop. Bilder vist er representative for tre uavhengige eksperimenter. F = Filter. (*) = HCT116 colonosheres. Forstørrelse 4B, 4CA: 200x, 4Cb: 400x; bar = 30 nm.
Colon cscs i CRC cellepopulasjoner er målrettet i høy tetthet svulstens mikromiljø co-kulturer med 5-FU, curcumin og den kombinerte behandlingen
Det har blitt rapportert at svulsten mikromiljøet spiller en avgjørende rolle i opprettholdelse av cscs fremme i påvirket av stroma, betennelsesceller, cytokiner og vekstfaktorer som skilles ut av stromale fibroblaster [26], [40]. Derfor undersøkte vi oppførselen cscs innenfor CRC cellepopulasjonen, ble høy tetthet monokulturer av HCT116 cellene forblir ubehandlet. Svulstens mikro ko-kulturer av HCT116 /MRC-5-celler var enten ubehandlet eller behandlet med 5-FU (5 uM), curcumin (5 uM) eller forbehandlet med curcumin (5 uM) i 4 timer og deretter eksponert for 5-FU (0,1 uM) i 10 dager. Kulturene ble utsatt for immunofluorescens merking med primære antistoffer for CSC markør (CD133). Svakt ekspresjon av CD133 ble detektert i basale kontrollmonokulturer (fig. 3A). Interessant, i motsetning, CD133-positive celler fra de HCT116-celler i mikro ko-kulturer ble høyere sammenlignet med den i kontrollen mono-kultur (fig. 3A), som indikerer den viktige synergistiske rolle til krysstale mellom HCT116 og MRC-5-celler i å støtte tumorvekst. Videre CD133-positive celler fra HCT116-cellelinjen populasjonen viste signifikant økt overlevelse etter behandling med 5-FU, sammenlignet med curcumin og /eller 5-FU (fig. 3A). I nærvær av curcumin og /eller 5-FU, oppviste de markert nedregulering av CD133-positive celler (Fig. 3A og 3B), noe som viser den fremtredende kjemosensibiliserende effekt av curcumin på cscs. Ved kvantifisering vi bekreftet at antall CD133-merkede celler økte i HCT116 mikromiljøet ko-kulturer sammenlignet med kontroll tumor mono-kultur (Fig. 3A), og CD133 positive celler økte i den overlevende cellepopulasjon ved behandling med 5-FU , men ikke med curcumin eller den kombinerte behandlingen (fig 3B.)
A:. høy tetthet monokulturer av HCT116 cellene ble ubehandlet (A, Co.HD-mono-kultur), høy tetthet svulstens mikromiljø ko-kultur av HCT116 /MRC-5-celler var enten ubehandlet (A, Co.Microenv-HD-Co-culture), eller behandlet med 5-FU (5 uM) (A, 5-FU-Microenv-HD-Co- kultur), curcumin (5 pm) (A, Cur-Microenv-HD-Co-kultur) eller forbehandlet med curcumin (5 pm) i 4 timer, og deretter utsatt for 5-FU (0,1 gM) (A, Cur + 5-FU -Microenv-HD-Co-kultur) i 10 dager. Immunolabeling ble utført med primære antistoffer for tykktarms CSC markør (CD133) etterfulgt av inkubasjon med rhodamin-coupled sekundære antistoffer og kontra med DAPI å visualisere cellekjerner. Bilder vist er representative for tre ulike eksperimenter. Forstørrelse 400 ×. bar 30 nm. B: For å kvantifisere mengden av CD133-positive celler i kulturer med høy tetthet som er beskrevet ovenfor, ble 100 celler fra 15 mikroskopiske felt telles. Undersøkelsen ble utført i tre paralleller, og resultatene er gitt som middelverdier med S.D. fra tre uavhengige eksperimenter. Verdier ble sammenlignet med kontrollgruppen og statistisk signifikante verdier med
p
0,05 ble utpekt av en stjerne (*) og
p.
0,01 ble utpekt av en stjerne (**)
Curcumin har potent chemosensitization effekt på tykktarmskreft stamceller i CRC cellepopulasjoner i høy tetthet svulstens mikromiljø co-kulturer
Deretter CSC markører (CD133, CD44 og ALDH1) uttrykk ble undersøkt for svulstdannelse kapasitet og chemosensitization effekten av curcumin på CSC markører i HCT116 3D høy tetthet svulstens mikromiljø co-kulturer. De ko-kulturene var enten ubehandlet, behandlet med curcumin (5 uM), 5-FU (1, 5 og 10 uM) alene eller ble forbehandlet i 4 timer med curcumin (5 uM), etterfulgt av behandling med 5-FU (0,1, 1 , 2, 3 um) i 10 dager (fig. 4). I tillegg, i et annet sett med eksperimenter ble HCT116-celler inkubert i høy tetthet monokulturer, uten fibroblaster som en basal kontroll. Kontroll høy tetthet monokulturer av HCT116 viste basal ekspresjon av CSC markører (Fig. 4: a, b, c). I motsetning til dette, viste immunblotting-analyse av helcellelysater merket oppregulering av CD133, CD44 og ALDH1 i HCT116 i kontroll og i 5-FU-behandlede høy densitet svulstens mikro ko-kulturer i en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 4 : a, b, c). Men interessant forbehandling med curcumin etterfulgt av behandling med 5-FU signifikant nedregulert CSC markør ekspresjon i en konsentrasjonsavhengig måte på HCT116-celler i høy tetthet tumor ko-kulturer (Fig. 4: a, b, c). Densitometrisk analyse av typiske western blot eksperimenter viser nedregulering av CSC markører i HCT116-celler i kulturer behandlet med enten 5-FU, curcumin og /eller 5-FU curcumin (Fig. 4: a, b, c). Tatt sammen indikerer disse resultatene at den parakrine interaksjonen mellom tumor og stromale celler er viktig for å fremme cscs og at det er en sterk kjemosensibiliserende effekt av curcumin på colon CSC i høy tetthet svulstens mikro ko-kulturer.
HCT116 høy tetthet monokulturer ble enten ubehandlet (HCT, Co.) eller samtidig var dyrket med MRC-5 i svulstens mikromiljø. Svulstens mikro ko-kulturer ble enten ubehandlet (Co), behandlet med curcumin alene (5 uM), 5-FU alene (1, 5 og 10 uM) eller ble forbehandlet i 4 timer med curcumin (5 uM), etterfulgt av behandling med 5 -FU (0,1, 1, 2, 3 um). Etter 10 dagers dyrking, ble de totale cellelysatene av kulturer HCT116 med høy densitet fremstilt og analysert ved western blotting og kvantitativ densitometri for CSC markør ALDH1 (a), CD133 (b) og CD44 (c). Densitometrisk evaluering av protein uttrykk som avslørt av western blot analyse ble utført i tre eksemplarer. Rengjøring protein β-actin fungerte som en lasting kontroll i alle forsøkene. Verdier ble sammenlignet med kontrollen og statistisk signifikante verdier med
p
0,05. Betydelige verdier er merket med (*).
Curcumin og /eller 5-FU blande seg inn i den synergistiske crosstalk mellom CRC /CSC-celler og fibroblaster i høy tetthet svulstens mikromiljø co-kulturer
for å undersøke samspillet mellom CRC /CSC-celler og fibroblaster og å evaluere effekten av curcumin og /eller 5-FU på denne synergiscrosstalk, på tumorcellevekst, invasjon og tumor-fremme faktorer (MMP, NF -κB) ekspresjon i mer detalj, utførte vi western blotting analyse av høy densitet tumor mikro ko-kulturer.
