Abstract
Aberrant uttrykk for MIR-196a har blitt hyppig rapportert i ulike kreftformer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen. Men dens funksjon i kreft i bukspyttkjertelen er ikke fullstendig klarlagt. Her undersøkte vi uttrykket mønsteret og biologiske rolle MIR-196a i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, samt sin interaksjon med en metastase-relatert gen, nukleær faktor-kappa-B-hemmer alfa (NFKBIA). Vi viste at Mir-196a ble oppregulert i humane bukspyttkjertelkreft cellelinjer mot immortaliserte bukspyttkjertelen duktale epitelceller ved hjelp av microRNAs microarray og QRT-PCR. Videre er nedregulering av MIR-196a i PANC-1 trykkes sin proliferasjon og migrering med en økning i G
0 /G
en overgang og redusert ekspresjon av Cyclin D1 CDK4 og /6. I mellomtiden, en økt uttrykk i E-cadherin og redusert uttrykk i N-cadherin og vimentin ble også observert. Vi identifiserte en roman MIR-196a målet, NFKBIA, og nedregulering av MIR-196a forbedret uttrykk for NFKBIA protein. Luciferase assay bekreftet at NFKBIA var en direkte og konkret mål av MIR-196a. Stanse NFKBIA i PANC-1 celler forbedret sin spredning og migrasjon. Til sammen våre funn tyder på at Mir-196a er sterkt uttrykt i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, og kan spille en avgjørende rolle i kreft i bukspyttkjertelen spredning og migrasjon, eventuelt gjennom sin nedstrøms mål, NFKBIA. Dermed kan MIR-196a tjene som en potensiell terapeutisk mål for kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Huang F, Tang J, Zhuang X, Zhuang Y, Cheng W, Chen W, et al. (2014) MiR-196a Fremmer Bukspyttkjertelkreft Progresjon av Targeting Nuclear Factor Kappa-B-hemmer Alpha. PLoS ONE 9 (2): e87897. doi: 10,1371 /journal.pone.0087897
Redaktør: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 09.08.2013; Godkjent: 03.01.2014; Publisert: 04.02.2014
Copyright: © 2014 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (30973505), Foundation Science and Technology i Guangdong-provinsen (2009B030801005), stiftelsen av Guangzhou Science and Technology Bureau (2009Y-C011-1) og Foundation of Departementet utdanning av Kina (20120171110075) til H. Yao. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en aggressiv malignitet med en av de verste utfall blant alle kreftformer. For alle faser kombinert, er 5-års relativ overlevelse bare 5% [1]. Den høye dødeligheten av kreft i bukspyttkjertelen kan være delvis på grunn av muligheten for kreft i bukspyttkjertelen celler til å erverve invasive egenskapene i de tidlige stadier av kreftutvikling. Således er det sannsynlig at selv i den fasen av en tilsynelatende lokalisert sykdom, kan mikrometastaser allerede være til stede i fjerntliggende områder organ [2]. Konvensjonell kjemoterapi er sjelden kurativ for metastatisk kreft i bukspyttkjertelen. Behandlingsstrategier som spesifikt retter og forhindre metastaser kan derfor ha potensial til å forbedre prognosen for denne sturen sykdommen.
Nyere studier har vist at microRNAs (mirnas) spiller en avgjørende rolle i reguleringen av ulike biologiske og patologisk prosesser, inkludert metastaser [3]. Disse små, ikke-kodende molekylene utøver sin regulerende virkning ved å binde seg til det 3′-ikke-translaterte region av mål-mRNA, enten forårsaker degradering av mRNA eller inhibering av deres oversettelse til funksjonelle proteiner. Uttrykket av miRNAs har blitt anerkjent som integrerte komponenter av mange normale biologiske prosesser som involverer celledeling, differensiering, apoptose, og stress motstand [4]. Enda viktigere, har det nylig blitt foreslått at avvikende oppregulering eller nedregulering av bestemte mirnas og deres mål i forskjellige typer av kreft er forbundet med utvikling og progresjon av kreft [5]. Den avvikende ekspresjon av enkelte mirnas har vist seg å være involvert i kreft i bukspyttkjertelen karsinogenese [6], [7]. Dessuten har MIR-196a blitt funnet å være overuttrykt i kreft i bukspyttkjertelen, og signifikant korrelert med dårlig overlevelse [8]. Imidlertid er mekanismen for dets funksjon i kreft i bukspyttkjertelen fortsatt uklar.
nukleær faktor KB (NF-kB) spiller en viktig rolle i reguleringen av immunresponsen [9] og inflammasjon [10]. Det består av en familie av transkripsjonsfaktorer som er involvert i regulering av en rekke biologiske prosess, og økende bevis demonstrert dens involvering i tumorgenese [11] – [14]. Det har vært implisert i mange kjennetegnene ved kreftutvikling og progresjon, inkludert vekstfaktor-uavhengig spredning [15], inhibering av apoptose [16], og vev invasjon og metastase [17]. Også nye bevis antyder at NF-kB-aktivering spiller en viktig rolle i utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen [11], [18] – [20]. Hemming av NF-kB sensitizes menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler til apoptose [21]. NFKBIA, også kjent som IκBα, er en av de familiemedlemmer av cellulære proteiner som hemmer NF-kB transkripsjonsfaktor. NFKBIA hemmer NF-kB ved å maskere atomlokaliseringssignaler (NLS) av NF-kB protein og holde den sequestered i en inaktiv tilstand i cytoplasma [22]. I tillegg til NFKBIA blokkerer evnen til NF-kB binder seg til DNA, som er avgjørende for funksjonen av NF-kB [23]. Det er blitt vist at det er en anrikning av spesifikke enkelt-nukleotid polymorfismer og haplotyper av NFKBIA i Hodgkins lymfom, tykktarmskreft og multippel myelom, antyder at NFKBIA kan være en tumor suppressor [24] -. [26]
i denne studien, viser vi at Mir-196a er overexpressed i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer og har undersøkt effekten av nedregulering av MIR-196a på en bukspyttkjertelkreft cellelinje, PANC-en. Vi har belyst at NFKBIA er et mål på miR196a, og MIR-196a spiller en viktig rolle i utvikling og progresjon av kreft i bukspyttkjertelen sannsynlig ved å målrette NFKBIA.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Fire menneskebukspyttkjertelkreft cellelinjer Panc-1, CAPAN-2, BxPC-3 og SW1990 ble kjøpt fra Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og en udødeliggjort i bukspyttkjertelen ductal epitelcellelinje H6C7 var vennlig levert av Prof. Ming-lyd Tsao (Ontario Cancer Institute, Toronto University, Canada), og ble inkubert i denne studien som rapportert tidligere [27]. Fire menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina) ble dyrket i DMEM (Gibco, Grand Island, New York) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, HyClone, Logan, UT), 100 forener /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin. H6C7, oppnådd fra Prof.Ming-lyd Tsao of Ontario Cancer Institute (Ontario, Canada), ble dyrket ved 37 ° C i keratinocytt serumfritt medium (SFM-K) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) inneholdende 100 u /ml penicillin, 100 u /ml streptomycin, 0,2 ng /ml rekombinant, endotelial vekstfaktor (rEGF) og 20 ng /ml bovint hypofyseekstrakt (BPE). I alle forsøkene ble cellene holdt ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 luft atmosfære.
Genechip microarray av miRNAs
miRNA genuttrykk profilen til fire menneskelige kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer og H6C7 ble bestemt av Genechip microarray analyse (Affymetrix, Santa Clare, CA, USA). Syntese av cDNA, hybridisering til flis, og vaskinger ble utført i henhold til fremstillingen protokoll. GeneChips ble skannet på 3 mm tetthet med en GeneArray Scanner (Affymetrix). Bilder ble inspisert for å sikre at alle chips hadde lav bakgrunn, men lyse hybridisering signaler. Mean fluorescens signal intensitet for hver sonde var kvartil normalisert. Gjennomsnittet av tre midlere signaler for hvert miRNA sonde var normalisert til at det for en ekstra kontroll oligonukleotid og var log
2 transformert. Hver miRNA probe ble undersøkt for ekspresjon basert på et Wilcoxon Rank-Sum test av miRNA sonde sett signaler i forhold til fordelingen av signalene fra bakgrunnen. Student «s
t
-test ble anvendt for å bestemme signifikante forskjeller i ekspresjon miRNA mellom human bukspyttkjertelkreft cellelinje og den udødelig pankreatisk duktus epitelcellelinje H6C7, hvor
P
0,05 ble tolket som signifikant.
kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR)
for å analysere uttrykk for MIR-196a, ble QRT-PCR utføres i fire menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (PANC- 1, CAPAN-2, BxPC-3 og SW1990) og en immortalisert bukspyttkjertel ductal epitelcellelinje H6C7. I korthet, ble total RNA ekstrahert fra cellene ved bruk av TRIZOL (Invitrogen, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjon. U6 ble validert som normalizer. Total RNA ble omvendt transkribert ved hjelp av tilsvarende RT Primer og TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR primer for modne MIR-196a er designet som følger: MIR-196a forstand, 5′-GCT CTG GCT CCG TGT CTT CAC TCC C-3 «, revers, 5»-TGC CCC AGC ACA GCC CCC GTC CCT C-3 «. Uttrykket av MIR-196a og dens kontroll U6 ble oppdaget ved hjelp av TaqMan miRNA analysesystem (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Transfeksjon av Panc-1 celler
To par syntetisk, kjemisk modifisert korte enkelt- eller dobbelt-RNA oligonukleotider: anti-MIR-196a og dens egnet negativ kontroll (anti-MIR-NC), ble Mir-196a micmics og dens egnet negativ kontroll (MIR-NC) kjøpt fra GenePharma (Shanghai, Kina). NFKBIA-siRNA (si-NFKBIA) og egnet negativ kontroll (si-NC) ble kjøpt fra GeneChem (Shanghai, P.R. Kina). Transfeksjon ble utført av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. For transfeksjon, 2 x 10
5 PANC-1-celler ble sådd i hver brønn i en 6-brønns plate og inkubert over natten. Uttrykket nivåer ble kvantifisert 24 timer etter transfeksjon.
Celleproliferering analysen
Celleproliferering ble oppdaget av WST-8-metoden. Anti-MIR-196atransfected PANC-1-celler og anti-MIR-NCtransfected PANC-1-celler ble høstet og dissosiert til en enkelt cellesuspensjon, 1,2 x 10
3-celler ble sådd i 96-brønns plate per brønn. Også si-NFKBIA transfektert PANC-1 celler, si-NC transfektert PANC-1 celler, si-NFKBIA + anti-MIR-196a transfektert PANC-1 celler og si-NC + anti-NC PANC-1 celler ble høstet og dissosiert til en enkelt cellesuspensjon, ble 2 x 10
3-celler sådd i 96-brønns plate per brønn. Celleformering ble undersøkt på forskjellige tidspunkter (24 h, 48 h, 72 h). WST-8-reagens (10 ul per brønn) fra Celletelling leder-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) ble tilsatt, inkubert i 4 timer, og absorbansen ble bestemt med en flerbrønn spektrofotometer (BioTek, VT, USA) ved 450 nm og 630 nm.
Cellemigrering migrering~~POS=HEADCOMP assay
Cellemigrering migrering~~POS=HEADCOMP-analysen ble utført ved anvendelse av Transwell kammer (Corning, New York, USA) med porestørrelse på 8,0 um. 72 timer etter transfeksjon, og den totale 10
5-celler ble resuspendert i serumfritt medium og sådd ut i det øvre rom av kammeret. Det nedre kammer er fylt med fulle kulturmedier inneholdende 10% FBS. Etter å ha blitt inkuberes ved 37 ° C i 8 timer, ble kammeret fast, 0,1% krystallfiolett-farget og telles.
Flowcytometri analyse
For å påvise effekten av nedregulering av MIR -196a på cellesyklus og apoptose, flowcytometri analyse ble utført. For cellesyklusanalyse, ble anti-MIR-196a-transfekterte PANC-1cells høstet på forskjellige tidspunkter (24 h, 48 h, 72 h) etter transfeksjon, og ble trypsinert og fiksert med iskald 70% etanol i 18 timer ved 4 ° C. De faste celler ble farget med 50 mg /ml propidiumjodid (BD Pharmingen, San Diego, CA) og 50 mg /ml RNase og deretter analysert ved hjelp av en strømningscytometer (BD Pharmingen, San Diego, California). For apoptose analyse, ble anti-MIR-196a-transfekterte Panc-1cells også høstet på ulike timer (24 timer, 48 timer, 72 timer) etter transfeksjon, farget med FITC-Annexin V og propidiumjodid (PI) og deretter analysert ved hjelp av en flowcytometer (BD Pharmingen, San Diego, California). Anti-MIR-NC-transfekterte Panc-1cells ble utført som kontroll.
Immunofluorescensanalyse
For å undersøke fenotype endringer av PANC-en transfektert med anti-MIR-196a, ble utført immunfluorescens analyse . Observasjon av morfologi Blank, anti-MIR-NC og anti-MIR-196a gruppen ble utført av mikroskop. Uttrykket av E-cadherin og vimentin, markører for EMT, ble oppdaget av immunfluorescens på 3
rd dag etter transfeksjon. Cellene ble vasket med PBS og fiksert i 4% paraform i 15 minutter på is. Etter to mer fosfat-bufret oppløsning (PBS) vask ble cellene dekket med 0,5% Triton 100 ° C i 15 minutter på is og deretter vasket med PBS og inkubert med 5% ikke-fettmelk i 1 time ved værelsestemperatur for å blokkere ikke-spesifikk binding av IgG. Cellene ble inkubert med primært antistoff mus anti-human E-cadherin (Abcam, MA, USA) eller vimentin (Abcam) i 2 timer ved romtemperatur, deretter vasket med PBS og inkubert med fluorokromkonjugerte-konjugert sekundært antistoff ved romtemperatur i 30 min i et mørkt kammer. Cellene ble vasket med PBS og dekket med DAPI å farge kjernene. Vi tok tilfeldige bilder med 200 ganger forstørrelse.
Western blot analyse
Konsentrasjonen av total protein hentet fra Blank, anti-MIR-NC og anti-MIR-196a gruppe ble bestemt med en BCA Protein Assay kit (Pierce, USA). Like mengder protein ble separert ved 10% SDS-PAGE og elektroforetisk overført til PVDF-membraner (Millipore, Bedford, MA, USA) ved anvendelse av en mini trans-blot. Mus anti-human cyclin D1 (Abcam), CDK4 (Abcam), CDK6 (Abcam), E-cadherin (Abcam), vimentin (Abcam), Kanin anti-human N-cadherin (Cell Signaling Technology, MA, USA), NFKBIA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), ble anvendt for å detektere ekspresjon av homologe proteiner. GAPDH (Santa Cruz Biotechnology) ble anvendt som en intern kontroll. Elektrokjemiluminescens ble utført med en Chemilmager 5500 bildesystem (San Leandro, CA, USA), i henhold til produsentens instruksjoner.
3’UTR luciferase reporter analysen
Den menneskelige NFKBIA 3’UTR luciferase reporter konstruere (NFKBIA-3’UTR WT) ble generert ved kloning NFKBIA mRNA 3’UTR sekvens i nedstrøms pMIR-Rapport konstruksjon (land, Guangzhou, Kina) av. Mir-196a målområde-mutasjon NFKBIA 3’UTR luciferase reporter (NFKBIA-3’UTR mutasjon) konstruksjon ble generert ved å bruke direkte stedet mutagenese ved hjelp av mutasjon primere som mutere Mir-196a bindingssetet fra ACTACCT til ATCGATC. PANC-1 celler ble ko-transfektert med MIR-196a plasmid og villtype eller mutant NFKBIA 3’UTR luciferase reporter konstruere og luciferase aktiviteter ble målt ved hjelp av Dual-Glo Luciferase. Data ble normalisert ved å dividere Firefly luciferase aktivitet med at av Renilla luciferase.
Statistisk analyse
Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD), beregnet ved hjelp av SPSS programvare, versjon 13.0. Midlene ble deretter sammenlignet ved hjelp av en enveis ANOVA med LSD blant grupper eller student
t
test mellom gruppene.
P
. 0,05 indikerte statistisk signifikans
Resultater
MiR-196a er overuttrykt i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer
For å undersøke hvilken rolle speil 196a i bukspyttkjertelkreft utvikling, det første vi undersøkte uttrykk for MIR-196a i fire bukspyttkjertelkreft cellelinjer (CAPAN-2, BxPC-3, Panc-1 og SW1990) og udødeliggjort i bukspyttkjertelen duktalt epitel cellelinje H6C7 av mirnas microarray og real- time RT-PCR. Den hierarkiske klynge avdekket at Mir-196a uttrykk i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer var mye høyere enn i H6C7 (figur 1A). I mellomtiden, resultatet av real-time RT-PCR var i samsvar med microarray. Uttrykk av MIR-196a var (706,4 ± 9,4) fold i Panc-1 celler, (310,1 ± 7,5) fold i SW1990 celler (7,6 ± 1,1) fold i BxPC-3 celler og (204,9 ± 4,8) fold i CAPAN-2 celler, sammenlignet med H6C7 (
P
0,05) (figur 1B). Det er underforstått at Mir-196a kan spille en rolle i utviklingen av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen.
(A) Hierarkisk clustering analyse av miRNAs som enten var forskjellig opp- eller nedregulert i bukspyttkjertelkreft cellelinjer og H6C7. Mirnas som scoret en differensial verdi på 1 eller større ble kategorisert som forskjellig oppregulert, og mirnas som scoret en verdi på -1 eller mindre ble kategorisert som forskjellig nedregulert. Skalaen linjen over bunnen av heatmap viser SD endring fra gjennomsnittet. MiR-196a uttrykk var betydelig høyere i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer i microarray. (B) Validering av MIR-196a uttrykk nivå i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ved QRT-PCR. MiR-196a var signifikant oppregulert i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. Uttrykk av MIR-196a var (706,4 ± 9,4) fold i Panc-1 celler, (310,1 ± 7,5) fold i SW1990 celler (7,6 ± 1,1) fold i BxPC-3 celler og (204,9 ± 4,8) fold i CAPAN-2 celler, sammenlignet med H6C7 (*,
P
0,05).
Effekt av MIR-196a på spredning og apoptose av PANC-1 celler
Som vist i figur 1, MIR-196a ekspresjon var mye høyere i bukspyttkjertelcancercellelinjer sammenlignet med udødelig pankreatisk duktus epitelcellelinje, spesielt i PANC-1. For å vurdere den biologiske rollen MIR-196a i bukspyttkjertelkreft ytterligere, valgte vi PANC-en for den følge eksperimenter for sin høye uttrykk for MIR-196a og undersøkte effekten av målrettet knockdown av MIR-196a på celleproliferasjon og apoptose. Det ble vist at anti-MIR-196a ble effektivt innføres i cellene (figur 2A, figur 2B) og nedregulert MIR-196a ekspresjonsnivået (figur 2C). WST-8-analysen viste at celleproliferasjon ble betydelig svekket i Panc-1 celler transfektert med anti-MIR-196a på 72 timer sammenlignet med kontrollgruppen anti-MIR-NC (
P
0,05) (Figur 2D), mens endring av MIR-196a uttrykk hadde ingen signifikant effekt på celleproliferasjon sammenlignet med kontrollgruppen anti-MIR-NC på 24 timer (
P
= 0,987) og 48 timer (
P
= 0,241).
(A) Transfeksjon av anti-MIR-196a og anti-MIR-NC i PANC-en. (B) sammenlignings av transfeksjon hastighet mellom anti-MIR-196a og anti-MIR-NC i PANC-en. Transfeksjon frekvensen av anti-MIR-196a var (88,76 ± 2,25)%, mens transfeksjon frekvensen av anti-MIR-NC var (91,09 ± 1,77)% (
P
0,05). (C) Uttrykk for MIR-196a ved QRT-PCR. (D) Vekstkurve blant anti-MIR-196a, anti-MIR-NC og foreldre PANC-1 celler. Celleproliferasjon ble betydelig redusert i anti-MIR-196a gruppen sammenlignet med den anti-MIR-NC gruppe på 72 timer (*,
P 0,05
).
LM
. Lysmikroskop
Videre fant vi ut om cellesyklus eller apoptose ville bidra til hemming av spredning. Flow-cytometri analyse ble utført. Etter stanse MIR-196a av anti-MIR-196a på 72 timer, prosent av G
0 /G
1 var signifikant økt sammenlignet med kontrollgruppen anti-MIR-NC, (67.20 ± 3.12)% (anti- MIR-196a) vs (56,07 ± 7,93)% (anti-MIR-NC) (
P
0,05), mens det var ingen statistisk signifikans i G
0 /G
1between anti -miR-196a gruppe og anti-MIR-NC gruppe på 24 timer (
P
= 0,825) og 48 h (
P
= 0,785) (figur 3A, Figur 3B). Dessuten har vi oppdaget at ekspresjonen av Cyclin D1 CDK4 og /6 protein. Det var interessant at redusert uttrykk for cyclin D1 og CDK4 /6 ble observert etter stanse MIR-196a (Figur 3C). I mellomtiden var det ingen signifikant forskjell på apoptose blant Blank, MIR-NC og anti-MIR-196a gruppe i PANC-1 celler (Figur 3D). Til sammen tyder resultatene på at knockdown av MIR-196a undertrykker celleproliferasjon, delvis på grunn av G
0 /G
en arrestasjon med Cyclin D1 og CDK4 /6 uttrykk redusert, men det er ikke forbundet med induksjon av apoptose .
(A) representant flowcytometri analyse av cellesyklus i PANC-en med og uttak stanse MIR-196a på 24 timer, 48 timer og 72 timer. (B) Sammenligning av cellesyklus blant anti-MIR-196a, anti-MIR-NC og Blank. Prosentandelen av celler i G
0 /G
en fase på 72 timer ble øket fra (56,07 ± 7,93)% (anti-MIR-NC) til (67,20 ± 3,12)% (anti-MIR-196a) (*,
P
0,05), mens det var ingen statistisk signifikans i G
0 /G
1between anti-MIR-196a gruppe og anti-MIR-NC gruppe på 24 timer og 48 timer. (C) Representative western blot-analyse viste at nedregulering av Cyclin D1 CDK4 og /6 uttrykk etter undertrykkelse av MIR-196a i PANC-1-celler ved 72 timer. (D) Sammenligning av apoptose blant anti-MIR-196a, anti-MIR-NC og Blank.
nedregulering av MIR-196a undertrykker PANC-en celle migrasjon
For å undersøke om MIR-196a hatt en effekt på tilrettelegging bukspyttkjertelkreft cellemigrasjon, utførte vi Transwell-analyse ved hjelp PANC-1 celler. PANC-1 celle ble valgt på grunn av dets overekspresjon av MIR-196a og etterligning av kreft i bukspyttkjertelen biologi bedre enn andre cellelinjer, spesielt i cellemigrasjon analyse [28]. Transwell-analyse avslørte at migreringen evnen til PANC-1-celler ble merkbart redusert ved nedregulering av MIR-196a, omtrent 28% sammenlignet med kontroll (
P
0,05) (figur 4A, 4B). I mellomtiden, vi lurte på om mesenchymale-epitel overgang (MET) bidratt til undertrykkelse av PANC-en celle migrasjon etter stanse MIR-196a, vi først observert morfologi PANC-en før og etter transfeksjon med anti-MIR-196a. Til vår interesse, cellen morfologi endret bemerkelsesverdig etter transfeksjon. I blank og anti-MIR-NC gruppe, noen celler var delvis spindel form, mens anti-MIR-196a celler ble tett bundet, polygon celler med en epitelial fenotype. I mellomtiden, vi har oppdaget MET markører (vimentin og E-cadherin) uttrykk ved immunfluorescens. Økt uttrykk av E-cadherin ble observert etter stanse MIR-196a, med uttrykk av vimentin redusert (figur 4C). Videre undersøkte vi proteinet uttrykket forbundet med MET. Påfallende, med reduksjon av PANC-1 cellemigrasjon etter stanse MIR-196a, økt ekspresjon av E-cadherin-protein ble observert, så vel som redusert ekspresjon av N-cadherin og vimentin (figur 4D). Disse resultatene indikerer at MIR-196a faktisk medvirker til den vandrende fenotypen av kreft i bukspyttkjertelen celler, dels gjennom MET.
(A) Representative transwell-analysen indikerte at migreringen evnen til PANC-1-celler ble merkbart redusert ved ned- regulering av MIR-196a. (B) Sammenligning av trans celler blant anti-MIR-196a, anti-MIR-NC og Blank (*,
P
0,05). (C) Morfologiske endringer og immunfluorescens farging av MET markører blant anti-MIR-196a, anti-MIR-NC og blank. (D) Representant western blot analyse viste at mesenchymale-epitelial overgang bidratt til undertrykkelse av PANC-en celle migrasjon etter stanse MIR-196a. Etter stanse MIR-196a, økt E-cadherin uttrykk, samt uttrykk for N-cadherin og vimentin redusert.
NFKBIA er et mål på MIR-196a i bukspyttkjertelkreft
Vi undersøkte de molekylære mekanismer som MIR-196a regulerer den vandrende fenotype. De mulige MIR-196a målgener av database analyse er oppsummert i tabell S1. Online søk etter MIR-196a targeting gener ved TargetScan, Miranda og PicTar avslørte at NFKBIA, en proto-onkogen forbundet med migrasjon og invasjon, kan være et potensielt mål for miR196a (figur 5A). Vi neste fastslått hvorvidt NFKBIA uttrykk var negativt assosiert med Mir-196a nivå i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. Som vist i figur 1, uttrykket av MIR-196a var den høyeste i PANC-1 celler, og lavest i BxPC-3 celler. Derfor valgte vi de to cellelinjene for videre NFKBIA protein uttrykk. Til vår interesse, NFKBIA protein uttrykk var høyere i BxPC-3 celler enn at i PANC-1 celler. Videre økte NFKBIA etter nedregulering av MIR-196a i PANC-1-celler, og ble redusert etter oppregulering av MIR-196a i BxPC-3-celler (Figur 5B). For å fastslå direkte miRNA-target interaksjon, setter vi opp et luciferase reporter analysen. Som vist i figur 5C, luciferaseaktiviteten i PANC-1-celler ble redusert med WT konstruere ved nedregulering av MIR-196a-nivå, noe som kan være delvis gjenopprettes med mutante konstrukter. Disse resultatene tyder på at 3’UTR av NFKBIA er et direkte mål på MIR-196a.
(A) NFKBIA er et potensielt mål gen av MIR-196a spådd av matematisk analyse. (B) Representant western blot analyse viste sammenhengen mellom MIR-196a uttrykk og endogene NFKBIA proteinnivå. Hemming av MIR-196a i Panc-1 celler økt endogen NFKBIA protein nivå, mens overekspresjon av MIR-196a i BxPC-3 celler svekkede endogent NFKBIA protein nivå. (C) Innlegging av NFKBIA3’UTR målsekvenser i en luciferase reporter vektor blyholdig til redusert luciferase aktivitet i nærvær av MIR-196a i PANC-1 celler 24 timer etter ko-transfeksjon. Histogrammer viste verdiene resulterer som gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige co-transfections (*,
P
0,05).
lyddemping NFKBIA fremmer spredning og migrasjon av PANC-en celler
for å finne den biologiske rollen NFKBIA i bukspyttkjertelkreft videre undersøkte vi effekten av målrettet knockdown av NFKBIA i PANC-1 celler. Samtidig som bevist før, er NFKBIA et mål av MIR-196a, for å oppheve effekten av anti-MIR-196a, vi co-transfektert siNFKBIA og anti-MIR-196a i PANC-1 celler. Vi utførte WST-8-analysen for å påvise celleformering. Det ble avslørt at den celleproliferasjon ble signifikant økt i PANC-1-celler transfektert med si-NFKBIA i 72 timer sammenlignet med kontrollgruppen si-NC (
P
0,05), i mellomtiden, ble celleformering betydelig økt i PANC-1 celler transfektert med si-NFKBIA + anti-MIR-196a på 72 timer sammenlignet med kontrollgruppen si-NC + anti-NC (
P
0,05). Det var ingen statistisk signifikant sammenheng mellom SI-NFKBIA og si-NFKBIA + anti-MIR-196a (
P
0,05) (Figur 6A). Som vist før, uttrykk for cyclin D1 og CDK4 /6 sank etter å kneble MIR-196a. Vi undersøkt videre protein uttrykk for cyclin D1 og CDK4 /6 etter tie NFKBIA. Til vår interesse, økt uttrykk for cyclin D1 og CDK4 /6 ble observert etter stanse NFKBIA (figur 6B). Deretter foreslo transwell analysen hemming av NFKBIA forfremmet celler migrasjon. Videre dual hemming av NFKBIA og MIR-196a forfremmet celler migrasjon (figur 6C, figur 6D), som innebar at hemming av NFKBIA blokkert effekten av anti-MIR-196a på celle migrasjon. Disse dataene antyder at hemming av NFKBIA fremmer kreft i bukspyttkjertelen celle markedsføring og migrasjon.
(A) Vekstkurve blant si-NFKBIA, si-NFKBIA + anti-MIR-196a og deres hensiktsmessige kontroller. WST-8-analysen viste hemming av NFKBIA forbedret PANC-1 celler spredning (*,
P
0,05). I mellomtiden, dual hemming av NFKBIA og MIR-196a forfremmet celler spredning. (B) Representative western blot-analyse viste oppregulering av Cyclin D1 CDK4 og /6 uttrykk etter undertrykkelse av NFKBIA i PANC-1-celler ved 72 timer. (C) Representative transwell-analysen indikerte at migreringen evnen til PANC-1-celler ble markert dempet ved nedregulering av NFKBIA. Videre hemming av NFKBIA blokkerte effekten av anti-MIR-196a på cellemigrering. (D) Sammenligning av trans celler blant si-NFKBIA, si-NC, si-NFKBIA + anti-MIR-196a, og si-NC + anti-MIR-NC (*,
P
0,05) .
Diskusjoner
mikroRNA profilering studier indikerer at MIR-196a er over-uttrykt i flere kreftformer, som brystkreft [29], tykktarmskreft [30], magekreft [ ,,,0],31], og kreft i bukspyttkjertelen [6], [7]. Interessant, et økende antall rapporter tyder på at Mir-196a spiller viktige roller i utvikling og progresjon av kreft. Overekspresjon av MIR-196a er forbundet med høy risiko klasse, metastasering og dårlig overlevelse blant gastrointestinal stromal tumor [32]. MiR-196a har blitt funnet å fremme proliferasjon og invasjon av ikke-liten celle kreft-celle lunge, noe som indikerer dens viktigste biologiske rolle i tumorprogresjon [33]. Det er rapportert at MIR-196a er identifisert med økt ekspresjon i fullstendig skille kreft i bukspyttkjertelen fra godartet pankreatisk vev, og høy ekspresjon av MIR-196a er funnet å forutsi dårlig overlevelse [6]. Samtidig er det rapportert at serum MIR-196a uttrykk nivåer i unresectable kreft i bukspyttkjertelen (faser III og IV) pasienter er betydelig høyere enn i resektable (trinn I og II) pasienter [7]. Videre er serum MIR-196a ekspresjonsnivået funnet å ha en potensiell verdi i å forutsi median overlevelsestid for kreft i bukspyttkjertelen pasienter. I vår forskning, vi belyst at Mir-196a var over-uttrykt i kreft i bukspyttkjertelen og dens oppregulering var signifikant assosiert med migrasjon potensial, som kan fremme kreft i bukspyttkjertelen progresjon og føre til dårlig prognose. EMT er antatt å være et viktig trinn for kreftinvasjon og metastase [34], [35]. Med redusert migrasjon potensial etter stanse MIR-196a, forhøyet uttrykk av E-cadherin og redusert uttrykk for N-cadherin og vimentin ble observert, noe som innebar at mesenchymale-epitelial overgang bidratt til undertrykkelse av PANC-en celle migrasjon etter stanse MIR-196a. Videre har vi vist at Mir-196a forfremmet kreft i bukspyttkjertelen spredning gjennom G
0 /G
1 arrest og redusert Cyclin D1 uttrykk og CDK4 /6 uttrykk, men ikke apoptose.
Videre vi undersøkt molekylære mekanismen av MIR-196a i bukspyttkjertelkreft tumorigenesis. Emerging bevis antyder at Mir-196a bidrar til tumor patogenesen via målretting av spesifikke gener [36] – [39]. Våre data viste at Mir-196a bidratt til proliferativ og vandrende potensialet for kreft i bukspyttkjertelen, som fremmet vår undersøkelse på målgener forbundet med spredning og migrasjon. Nukleær faktor-kappa B (NF-kB), et kjennetegn på den inflammatoriske respons, utløses ofte i svulster og kan spille en avgjørende rolle i å knytte betennelse til tumorutvikling og progresjon [40]. Tidligere studier har vist at NF-kB undertrykkelse i kreft inhiberer celleproliferasjon, forårsaker cellesyklus-stans, noe som tyder på at NF-kB kan spille en viktig rolle i celleproliferasjon.
