Abstract
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet over hele verden. Mangelen på svulst spesifisitet er fortsatt en stor ulempe for effektive chemotherapies og resultater i dosebegrensende toksisitet. Imidlertid bør en ligand-mediert medikamentavgivelsessystem være i stand til å gjengi kjemoterapi mer spesifikk for tumorceller og mindre giftige for normale vev. I denne studien ble det isolert et nytt peptid-ligand fra en fag-displayed peptid bibliotek som er bundet til ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer. Det målsøkende fag-bundet til flere NSCLC-cellelinjer, men ikke til normale celler. Både rettet mot fag og syntetisk peptid anerkjente kirurgiske eksemplarer av NSCLC med en positiv rate på 75% (27 av 36 prøver). I alvorlige kombinert immunsvikt (SCID) mus med NSCLC xenografter, den måls fag spesifikt bundet til tumormasser. Den tumor målsøkende evne til å målrette fag ble hemmet av beslektet syntetisk peptid, men ikke ved en kontroll eller en WTY-mutert peptid. Når det målsøkende peptid ble koblet til liposomer som bærer doxorubicin eller vinorelbin, den terapeutiske indeks over kjemoterapeutika og overlevelse av mus med menneskelig lungekreft xenografter markant økt. Videre er rettet mot liposomer økt akkumulering av legemidlet i tumorvev med 5,7 ganger sammenlignet med gratis narkotika og økt kreftcelle apoptose som følge av en høyere konsentrasjon av biotilgjengelig doxorubicin. Studien tyder på at dette tumor-spesifikt peptid kan anvendes for å skape kjemoterapier spesifikt målrettet mot tumorceller ved behandling av NSCLC og å utforme målrettet genoverføring vektorer, eller det kan benyttes en i diagnostisering av denne malignitet.
Citation: Chang DK, Lin CT, Wu CH, Wu HC (2009) A Novel Peptide Forbedrer Terapeutisk effekt av Liposomale kreftmedisiner i Mus modeller av menneskelig lungekreft. PLoS ONE 4 (1): E4171. doi: 10,1371 /journal.pone.0004171
Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: 9 juli 2008; Godkjent: 02.12.2008; Publisert: 12 januar 2009
Copyright: © 2009 Chang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av stipend fra Academia Sinica (# 5202402020-0 til HCW) og National Science Council (NSC-96-2323-B-002-015 og NSC96-3114-P-001-006-Y02 til HCW).
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de vanligste diagnosen malignitet i utviklede land, og er et økende problem i utviklings land [1]. Det er to hovedtyper av lungekreft: ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og småcellet lungekreft (SCLC). NSCLC utgjør ca 80% av alle lungekreft tilfeller [2] og har en begrenset svarprosent på nåværende kjemoterapeutika, med svulst krymping i bare 20% av pasientene og en to-års overlevelse mellom 10% og 16% [3] . En viktig årsak til dette utilfredsstillende utfallet av kjemoterapi er kompromittert levering av legemidler til lungekreft vev på grunn av høye interstitielle væsketrykk (IFP) i svulsten [4]. Systemisk behandling med kjemoterapi ikke hensiktsmessig kan leveres til faste tumorer på grunn av den umodne blodkar med unormal arkitektur [5] og utett, heterogene karveggene [6], så vel som den høye IFP i tumorcellene [7], [8]. Videre er en mangel på tumor spesifisitet tillater anti-kreft medikamenter for å fordele ukritisk til normale organer og vev. Således er kreftceller utsettes for en lavere konsentrasjon av medikamentet enn normale celler [9], noe som resulterer i ikke bare redusert effektivitet, men også økt toksisitet. Derfor er det viktig å utvikle en strategi for å forbedre mengden av legemidler som leveres til tumorvev på en målrettet måte skåner normale vev.
arbeides kontinuerlig for å forbedre den terapeutiske indeks av anticancermidler, enten ved å øke legemiddelkonsentrasjonen inne i svulsten eller ved å redusere den normale vertsvev [10]. Sammenlignet med konvensjonelt administrerte kjemoterapeutiske midler, lipid- eller polymer-baserte nano-medisin medikamentleveringssystemer har fordelen av å forbedre de farmakologiske og terapeutiske egenskaper av cytotoksiske medikamenter [11]. De fleste små-molekyl kjemoterapeutiske midler har et stort volum av distribusjon på intravenøs administrering [12] og et smalt terapeutisk vindu på grunn av alvorlig toksisitet for normale vev. Ved å innkapsle legemidler i nanopartikler så som liposomer, kan forskere redusere distribusjonsvolum og øke konsentrasjonen av aktivt legemiddel i tumoren [13]. Pegylert liposomal doksorubicin (med merkenavn av Doxil i USA og Caelyx i Europa) [14] har vist seg å forbedre den terapeutiske indeksen til doksorubicin i både prekliniske [15] – [17] og kliniske studier [18] – [21 ]. Flere stoffet leveringssystemer av denne typen har blitt godkjent for markedsføring [22], [23].
Annet enn PEGylerte liposomer, høyere og mer selektiv anti-kreft aktivitet kan oppnås gjennom ligand-mediert rettet mot liposomer. I denne nye medikamentleveringssystem, er målrettet andeler koplet til overflaten av liposomer for å fremme selektiv binding til tumorspesifikke antigener og lette levering av legemiddelholdige liposomer for de tiltenkte cellulært. Dette systemet har fordelen av en høyere medikament-til-bærer-forhold enn immunkonjugater og det flerverdige presentasjon av ligander som fører til økt binding aviditet [24]. Forskere har allerede produsert liposomer konjugert med ulike peptid ligander som spesifikt retter visse tumorceller eller tumor blodkar [25] -. [29]
På grunn av den gunstige selektivitet og spesifisitet, ligand-konjugert liposomal kreft narkotika er en lovende tilnærming for ny kjemoterapi forskning. Bruk av peptider som ligander for å dirigere liposomene til tumorer representerer et potensielt mulig fremgangsmåte for å øke spesifisiteten og effektiviteten av liposom-inneholdende medikamenter [26], [30]. Fagdisplay er en teknikk for å velge målrettet mot peptider, hvor et peptid blir uttrykt på overflaten av en bakteriofag som et fusjonsprotein med en av virionets egne kappeproteiner [31]. Fag-viste peptid bibliotekene tillater forskere å kartlegge protein-protein kontakter som B-celle epitoper [32] – [35] og reseptor-ligand interaksjoner [36]. Slike peptid-bibliotek kan også brukes til å identifisere orga- og celle-type-spesifikke peptider [26], [27], [37] -. [39]
I denne studien ble det benyttet en fag-displayed peptid-bibliotek for å identifisere et nytt peptid som bandt spesifikt til NSCLC-cellelinjer og kirurgiske prøver fra lungekreftpasienter. Liposomalt doxorubicin og vinorelbin konjugert med dette targeting peptid vist forbedret opphopning av narkotika i tumorvev og forbedret terapeutisk indeks for menneskelig lungekreft transplantater i SCID-mus.
Resultater
Isolering av fager binding til NSCLC celler
Vi brukte en fag-vises tilfeldig peptid biblioteket for å isolere fager som var i stand til å binde seg til NSCLC CL1-5 celler. Etter fem runder med affinitet seleksjon (biopanning) med CL1-5, celler økte titere av fag med 40 ganger (fig. 1A). Beriket fag fra tredje til femte biopanning rundene ble tilfeldig valgt. Vi deretter sekvensert fag-kloner med høyere CL1-5 bindende aktiviteter. Bruke Genetics Computer Group (GCG) programvare analyse, fant vi at disse utvalgte fag (PC3-1, PC4-1, PC4-5, PC5-2 og PC5-4) vises konsensus motiv, tryptofan (W) -threonine ( T) /tyrosin (Y) -tyrosin (Y) (tabell 1). Interessant, fagen PC5-2 dukket opp i den tredje (PC3-1), fjerde (PC4-1) og femte (PC5-2) biopanning runder. Under biopanning rundene, hyppigheten av PC5-2 økt fra 20% (1/5) i den tredje syklus til 90% (27/30) i femte cyklus (tabell 1). Vi valgte å fokusere på romanen peptid vises av PC5-2, TDSILRSYDWTY, for videre studier.
(
A
) Et fag-vises tilfeldig peptid biblioteket ble brukt til å velge fag som binder seg til den NSCLC cellelinje CL1-5. (
B
) Visualisering av PC5-2 binding til CL1-5 og PC13 lungekreft celler (pilspisser) med immunhistokjemisk farging. Kontrollen fagen ble ikke bundet til CL1-5 celler. Skala: 10 mikrometer. (
C
) FITC-merket peptid SP5-2 bundet til fem NSCLC cellelinjer, men ikke til NPC-TW01 celler som oppdages av immunofluorescent farging. Skala: 10 mikrometer. (
D
) Representative photomicrographs av kreft seksjoner fra kirurgiske prøver av human lungekreft ble oppdaget ved hjelp av både PC5-2 (a, pilspiss) og biotinylert SP5-2 (c, pilspiss), henholdsvis. Til sammenligning, kan styre fagen eller biotinylert kontroll peptid binder seg ikke til disse kirurgiske prøver (b og d). PC5-2 ble kompetitivt inhibert av det syntetiske peptid SP5-2 (e). Mutert peptid, MP5-2, mistet denne konkurransen evne (f). Skala:. 25 mikrometer
Identifikasjon av fag kloner spesielt binding til NSCLC celler
For å undersøke om PC5-2 ville binde seg til NSCLC celler, brukte vi immunhistokjemi å finne de fagpartikler i ulike celletyper. Våre resultater viste at PC5-2 bundet spesifikt til NSCLC cellelinjer inkludert CL1-5 og PC13 (Fig. 1B, pilspisser). Kontrollen hjelperfagen ble ikke bundet til CL1-5 celler. PC5-2 bundet verken til andre kreftcellelinjer, inkludert kreft i munnhulen (SAS) og nasopharyngeal carcinoma celler (NPC-TW01), og heller ikke til normale epitelceller (NNM) fra neseslimhinnen (Fig. 1B).
den CL1-5-bindingsevnen av PC5-2 ble ytterligere bekreftet ved en peptid-konkurrerende inhibering eksperiment ved hjelp immunofluorescerende farging. Resultatene viste at bindingsaktiviteten av PC5-2 fagen til CL1-5-celler ble hemmet av det syntetiske peptid SP5-2 på en doseavhengig måte. Ved en konsentrasjon på 27 ug /ml, hemmet SP5-2 fullstendig bindingsaktiviteten av PC5-2 (fig. S1). Kontrollen fag ikke binde seg til CL1-5 celler, og PC5-2 ikke binde seg til NPC-TW01 i denne analysen (fig. S1 og tekst S2).
For å ytterligere bekrefte at PC5-2 fag ville binde til en mål-molekyl uttrykt på overflaten av celler CL1-5, målte vi PC5-2-bundne celler ved hjelp av strømningscytometri (fig. S2 og tekst S1, S2). En kontroll fag ble brukt til å estimere ikke-spesifikk bakgrunnsbinding (fig. S2B). Resultatene viste at 42,6% av CL1-5 celler ble bundet av PC5-2 (fig. S2C), og denne bindingen ble fullstendig inhibert med 27 ug /ml SP5-2 peptid (Fig. S2D). PC5-2 ikke binde seg til SAS eller NNM (fig. S2 e og f).
Binding av syntetisk peptid SP5-2 med lungekreft celler og human lungekreft kirurgiske prøver
For å kunne analysere om peptidsekvensene som vises på PC5-2 ville faktisk interagere med NSCLC-celler, anvendte vi fluoresceinisotiocyanat (FITC) -merket SP5-2 peptid (FITC-SP5-2) i stedet for PC5-2 fag for et peptid-bindingsanalyse gjennom immunofluorescent farging. FITC-SP5-2 spesifikt bundet til alle NSCLC cellelinjene vi testet, herunder CL1-5, H460, A549, PC13 og H23, men ikke binde seg til NNM. Den samme konsentrasjon av FITC-merket kontroll peptid (FITC-Con-P) viste ingen slike bindingsaktivitet (fig. 1C). Vi vurderte også omfanget og spesifisitet SP5-2 binding ved hjelp av flowcytometri. Andelene av CL1-5, H460, A549, PC13 og H23 celler bundet av SP5-2 var 43,0%, 45,8%, 44,3%, 20,1% og 44,0%, henholdsvis (fig. S3 og tekst S2).
for å finne ut om denne målgruppe ligand hadde en affinitet for humane lungekreft kirurgiske prøver, testet vi reaktiviteten til PC5-2 og SP5-2 med lunge adenokarcinomceller bruker immunhistokjemi. Både PC5-2 og biotin-merket SP5-2 (B-SP5-2) føres tumorcellene av NSCLC-kirurgiske prøver (fig. 1D a og c, piler), og styre fagen og biotin-merket kontroll peptid (B- con-P) ikke gjorde det (fig. 1D b og d). SP5-2 (TDSILRSYDWTY) konkurrerte med PC5-2 for binding til kirurgiske prøver av lunge adenocarcinoma (fig. 1de), men den samme konsentrasjon av et mutert peptid, MP5-2 (TDSILRSYDGGG) ikke gjorde det (Fig. 1DF). Syttifem prosent (27/36) av lunge adenokarsinom prøver fra 36 pasienter uttrykt et mål molekyl som ble anerkjent av denne peptid (tabell S1). Disse data indikerte at SP5-2 kunne kjenne uidentifiserte molekyler uttrykt på NSCLC cellelinjer og selve kreftceller fra operasjons eksemplarer av lungekreft.
Mus modeller for studiet av PC5-2 målretting evne
for å undersøke målretting evne PC5-2 fag
in vivo
, injisert vi fager i halevenen av mus med CL1-5-deriverte svulster og deretter gjenopprettet dem etter perfusjon. Vi er fast bestemt på titere av fag i tumormasser og normale kontrollorganer (hjerne, hjerte og lunger) [26], [30]. PC5-2 viste spesifikke homing til tumormasser med konsentrasjoner 15 ganger høyere enn konsentrasjonen i kontrollorganer (Fig. 2A). Kontroll hjelpe fager viste ikke noen spesiell målgruppe for tumorvev (fig. 2A).
(
A
) SCID mus med humane lungekreft xenografter fikk intravenøst injeksjoner av PC5-2, og fag ble gjenfunnet etter perfusjon. Gjenoppretting av PC5-2 fra svulsten var klart høyere enn fra hjerne, hjerte og lunger. (
B
) Targeting aktivitet PC5-2 til tumorvev var konkurranse hemmet av SP5-2 men ikke av kontroll peptid eller mutant peptid. (
C
) Immunhistokjemisk lokalisering av PC5-2 etter intravenøs injeksjon i mus med CL1-5-avledet xenografter. Fagen ble lokalisert på tumorvev (d og e), og ingen lokalisasjon ble observert i normale organer som hjerne (a), hjerte (b), og lungene (c), eller i vevssnittene ble behandlet med kontroll fagen ( f-i). Interaksjonen mellom PC5-2 med tumoren seksjonen ble inhibert med syntetisk peptid SP5-2 (j). Skala: 25 mikrometer
Svulsten-målsøkende evne PC5-2 ble ytterligere bekreftet av et peptid kompetitiv hemming eksperiment, der syntetisk peptid SP5-2, injiseres sammen med PC5-2, markert. inhiberte utvinning av fagen fra tumormasser (fig. 2B). Ett hundre mikrogram SP5-2 inhiberte 92% av PC5-2 binding til tumormasser, men den samme konsentrasjon av en kontroll peptid hadde ingen slik inhiberende effekt (Fig. 2B).
Fra
in vitro
fag skjerm screening, identifiserte vi to kloner (PC5-2 og PC5-4) med en konsensus motiv av WT /YY (tabell 1). Som PC5-2, ble tumormålsøkende evne PC5-4 også kompetitivt inhibert av SP5-2 (fig. S4 og S2 Text), noe som tyder på at disse to fager kan bindes gjennom motivet til det samme målmolekyl på plasmamembranen av lungekreftceller. Vi foreslått at disse tre aminosyrerester kan spille en avgjørende rolle i homing til tumorvev. For å teste denne hypotesen, endret vi disse tre aminosyreresiduer i SP5-2 (TDSILRSYDWTY) til GGG i en mutant peptid, MP5-2 (TDSILRSYDGGG). Selv om tumormålsøkende evne PC5-2 var blitt markert inhibert av peptidet SP5-2 ble denne konkurrerende inhibering tapt i MP5-2, som inneholder det GGG rest i stedet for de WTY rester i SP5-2 (Fig. 2B) . Disse data indikerer at WTY rester var viktig for bindingsevnen av SP5-2 til NSCLC-celler.
vevsfordeling av PC5-2 ble også studert ved bruk av immunfarging. Vi injisert SCID-mus med NSCLC xenografter med PC5-2 og deretter fjernet og faste kreft og kontrollorganer for lokalisering av fagpartikler. PC5-2 ble funnet å lokalisere i tumorvev (fig. 2CD). Ved en høyere forstørrelse, ble immunreaktiviteten av fagen detektert på plasmamembranen med en viss diffusjon i den omgivende cytoplasma av tumorceller (Fig. 2ce). Det var ingen reaksjon produkt detektert på normale organer som hjerne, hjerte og lunge vev (Fig. 2C a-c), og heller ikke i tumorvev behandlet med (fig. 2CI) kontroll fagen. Den spesifikke målrettingen av PC5-2 til NSCLC xenograft ble hemmet av syntetisk peptid SP5-2 i
in vivo
homing eksperiment (Fig. 2Cj).
Terapeutisk effekt av SP5-2 -mediert målretting av liposomer
å bestemme hvorvidt den lungekreft-målsøkende peptid SP5-2 kunne brukes for å forbedre den kjemoterapeutiske effekten av kreftbehandling, kombinert vi peptidet til liposomer inneholdende anti-kreft medikamenter. SCID-mus med størrelse-matchet, CL1-5-avledede xenotransplantater ble behandlet med (1) SP5-2-konjugert liposomal doksorubicin (SP5-2-LD), (2) mutant peptid-konjugert liposomal doksorubicin (MP5-2-LD) , (3) ikke-målrettede liposomal doksorubicin (LD), (4) fri doksorubicin (FD), eller (5) ekvivalente volumer av fosfatbufret saltoppløsning (PBS). Alle formuleringer ble injisert intravenøst (iv) ved en total doxorubicin dose på 8 mg /kg (1 mg /kg to ganger i uken i totalt åtte injeksjoner).
tumorer i mus som mottok SP5-2 (fig. 3A gruppe a) -ld var betydelig mindre enn de i den MP5-2-LD, LD, FD, og PBS gruppene (
P
0,01) (fig. 3A gruppe b-e) . Tumorstørrelser i LD og MP5-2-LD gruppene var 2,1 og 2,6 ganger større enn de i den SP5-2-LD-gruppe, respektivt. Tumorstørrelser i FD og kontroll PBS gruppene var 7,0 og 8,3 ganger større enn den i den SP5-2-LD-gruppe, henholdsvis (figur 3A.). Interessant, større terapeutisk effekt av SP5-2-LD gikk tapt da WTY motiv i peptid hadde blitt endret til GGG i MP5-2-LD. Fri doksorubicin oppviste liten terapeutisk effekt ved denne konsentrasjonen, som tumorstørrelsen i denne gruppen var bare 16% mindre enn i PBS-gruppen (fig. 3A).
(
A
) Median tumorvolum over tid hos mus behandlet med PBS, FD, LD, MP5-2-LD, eller SP5-2-LD. Tumorvekst ble markert undertrykt i SP5-2-LD behandlede gruppen. SP5-2-LD har høyere terapeutisk effekt enn LD og MP5-2-LD (
n
= 6 i hver gruppe; **
P
0,01). (
B
) mus med størrelse-matchet CL1-5-avledet lungekreft med tumorstørrelse på ca 500 mm
3 ble behandlet med SP5-2-LD, LD, eller PBS (
n
= 6 i hver gruppe, **
P
0,01). (
C
) mus med H460-avledet lungekreft ble behandlet med SP5-2-LD, LD, FD, eller PBS (
n
= 6 i hver gruppe, *
P
0,05). (
D
) Effekten av ulike behandlinger på endring i kroppsvekt i løpet av behandlingsperioden (
n
= 6 i hver gruppe). (
E
) mus med CL1-5-avledet lungekreft ble behandlet med SP5-2-LV, LV, eller PBS (
n
= 6 i hver gruppe; **
P
0,01). (
F
) En Kaplan-Meier overlevelseskurve viste lengre levetid på mus behandlet med SP5-2-LV enn de som ble behandlet med LV og PBS (n = 5 i hver gruppe).
for å verifisere om store xenografter ville svare på SP5-2-LD behandling, mus med store lungekreft xenografter (500 mm
3) ble tildelt tre behandlingsgruppene. Etter forløpet av doksorubicin behandling med en total dose på 16 mg /kg (2 mg /kg to ganger per uke i åtte injeksjoner), tumorstørrelser i kontroll PBS og LD-grupper gradvis økt til 3,3 og 2,1 ganger den tumorstørrelse i SP5-2-LD gruppe (
P
0,01) (figur 3B.). Resultatene viste at SP5-2-LD også økt terapeutisk effekt av doxorubicin i SCID-mus med store lungekreft xenografter.
For ytterligere å teste om SP5-2 vil optimalisere den terapeutiske indeksen i lungekreft behandling, SP5- 2-LD ble brukt til å behandle en annen type lungekreft xenograft (H460-avledet tumor). SCID-mus med størrelse-matchet, H460-avledet xenotransplantater ble behandlet med SP5-2-LD, LD, FD, eller tilsvarende volumer av PBS, gjennom intravenøs injeksjon ved et totalt doksorubicin dose på 8 mg /kg (1 mg /kg to ganger per uke i åtte injeksjoner). Den endelige tumorstørrelse i de SP5-2-LD gruppe var signifikant mindre enn de i LD, FD og PBS gruppene (
P
0,05). Mus i LD, FD og PBS gruppene hadde tumorer med størrelser 2.0-, 8.6- og 10,0 ganger større enn den i den SP5-52-LD gruppe (Fig. 3C). Fri doksorubicin ved denne konsentrasjonen redusert tumorstørrelsen med bare 14% sammenlignet med PBS-grupper. Ikke bare var tumorvekst markert undertrykket i den SP5-2-LD gruppe (Fig. 3C), kroppsvekt av musene i denne gruppen økte med 10,3% (2,38 g) ved slutten av behandlingsperioden. I motsetning hadde LD-behandlede mus en mindre økning i kroppsvekt på 2,4% (0,59 g) (Fig. 3D).
For ytterligere å bekrefte SP5-2 kunne øke den terapeutiske indeks for lungekreft, vi knyttet den SP5-2 peptid til en annen anti-kreft narkotika, liposomal vinorelbin (SP5-2-LV) og testet sin effekt mot lungekreft xenografter. SCID-mus med størrelse-matchet CL1-5-avledet xenotransplantater ble gitt intravenøst injeksjoner av SP5-2-LV, liposomal vinorelbin (LV), eller ekvivalente volumer av PBS til en samlet vinorelbin dose på 24 mg /kg (2 mg /kg to ganger per uke i tolv injeksjoner). Tumorbærende mus behandlet med SP5-2-LV (Fig. 3E, gruppe a) hadde signifikant mindre svulster enn LV og PBS grupper (
P
0,01). (Fig 3E, gruppe b og c). Svulsten størrelse i LV gruppen var 6,75 ganger større enn SP5-2-LV-gruppen. Den gjennomsnittlige tumorstørrelse i kontrollgruppen PBS gruppen var 25 ganger større enn den SP5-2-LV gruppe (fig. 3E). For å vurdere bivirkninger av behandlingene ble musene veid to ganger i uken. Kroppsvekten til musene økte med 5,7% (1,37 g) i SP5-2-LV gruppen og med 2,4% (0,58 g) i LV gruppe ved slutten av behandlingsperioden (data ikke vist).
til slutt, vi sammenlignet overlevelse av tumorbærende mus etter behandling med SP5-2-LV, LV, eller PBS i løpet av 102 dager. Alle fem dyr i PBS-behandlede gruppen døde (overlevelse 0%). Tre mus døde i LV-behandlede gruppen (overlevelsesrate 40%). I SP5-2-LV-behandlede gruppen, men overlevelsesraten var 80%, signifikant høyere enn de to andre gruppene (fig. 3F). Disse eksperimentene viser at SP5-2 økt terapeutisk effektivitet av liposominnkapslet doksorubicin og vinorelbin med mindre toksisitet.
Tumor lokalisering og biodistribusjon av SP5-2-konjugert målretting liposomer
biodistribusjon og tumor lokalisering av SP5-2-LD, MP5-2-LD LD, og FD ble estimert ved å måle den indre auto-fluorescens-signal av doksorubicin i mus med NSCLC xenografter. Doksorubicin (
M
r 543,54), en liten molekyl kjemoterapeutisk middel som sin
M
r er 1000, har en dårlig farmakokinetisk profil, og dens blodkonsentrasjon synker til bakgrunnsnivået innen en time etter administrering (fig. s5a og tekst S2). Den farmakokinetiske profilen av ulike liposomalt doxorubicin formuleringer, inkludert SP5-2-LD, MP5-2-LD og LD, var betydelig større enn FD (Fig. S5a). Arealet under konsentrasjonskurven (AUC
0-48 timer) til doksorubicin i tumorvev var 10,4 ug · time /g, 31,5 ug · time /g, 29,0 ug · time /g, og 59,9 ug · t /g i FD, LD, MP5-2-LD, og SP5-2-LD grupper, henholdsvis (tabell S2). Gjennomsnittlig intra-tumor doxorubicin konsentrasjon i SP5-2-LD-behandlede gruppen var 5.7-, 1.9- og 2.1 ganger høyere enn doxorubicin konsentrasjon intra-svulst i FD, LD, og MP5-2-LD grupper (Fig . 4A og tabell S2).
på utvalgte tidspunkter (1, 4, 24 og 48 timer) etter injeksjon, doxorubicin konsentrasjon i tumorvev (
A
) og kjerner av kreftceller (
B
) ble målt. Doxorubicin konsentrasjon inne tumorvev og kjerner i SP5-2-LD gruppen var høyere enn i FD, LD, og MP5-2-LD grupper (n = 3 på hvert tidspunkt, *
P
0,05, **
P
0,01)
for å vurdere biotilgjengeligheten av liposomale narkotika, har vi brukt atom doxorubicin opphopning som en indikator på narkotika cytotoksisitet [40].. AUC
0-48 timer biotilgjengelig doxorubicin (dvs. bundet til kjerner) for FD, LD, MP5-2-LD, og SP5-2-LD var 3,7 mikrogram · time /g, 6,7 mikrogram · time /g , 7,5 ug · time /g, og 17,7 ug · time /g, henholdsvis (tabell S2). Den intra-tumor atom doxorubicin konsentrasjon i SP5-2-LD gruppe var 4.8-, 2.6- og 2.4 ganger høyere enn den kjernefysiske doxorubicin konsentrasjon i FD, LD, og MP5-2-LD grupper (Fig. 4B og Tabell S2). Doxorubicin konsentrasjon inne tumorvev og kjernen var ikke signifikant forskjellig mellom LD og MP5-2-LD grupper (Fig. 4 og tabell S2).
Enhanced svulst levering av legemidler og terapeutisk effekt av SP5-2-konjugerte liposomer
for å sammenligne stoffet levering profilen av de fire doxorubicin formuleringer, prøvde vi å påvise stoffet i tumorvev ved hjelp av fluorescens mikroskop. Bilder fra alle tumorer viste at doksorubicin ble visualisert i tumorcellekjerner en time etter SP5-2-LD ble administrert, men ikke etter andre formuleringer ble injisert (Fig. 5A). Over tid områder av tumorsnitt med målbart doxorubicin økt. Områdene med detekterbar doxorubicin var signifikant større i SP5-2-LD-behandlede tumorer enn det i FD, LD, og MP5-2-LD-behandlede tumorer ved hvert tidspunkt (Fig. 5A). Den MP5-2-LD formulering hadde samme fordelingsmønster som LD, men regionene i FD-behandlede svulster viste ingen påvisbare doxorubicin (Fig. 5A).
(
A
) Representant to -Color bilder som viser fordelingen av doksorubicin (rød) i forhold til kjerner (blå) i vevssnitt. Akkumulering av doksorubicin i tumorvev ble vist ved 1, 4 og 24 timer etter injeksjon. Bar, 50 mikrometer. (
B
) Histopatologi og fluorescerende farging av tumorvev i hver behandlingsgruppe undersøkt etter farging med H E, TUNEL (grønn), lektin (rød), og DAPI (blå). Bar, 50 mikrometer. Enhancement på akkumulering av legemidlet i tumorvev korrelert med økt terapeutisk effekt
Når tumorvev i hver behandlingsgruppe (figur 3C.) Ble undersøkt ved H . E farging, markert spres nekrotiske /apoptotiske områder var til stede i hele delene av SP5-2-LD-behandlede xenotransplantater (fig. 5B). I tillegg ble terminal deoksynukleotidyl transferase-mediert dUTP nick ende merking (TUNEL) som brukes til å identifisere apoptotiske celler og tomat lectin ble brukt for å påvise tumorblodkarene. Svulstene hadde større apoptotiske områder og en lavere tetthet av tumorblodkarene i den SP5-2-LD-behandlede gruppen enn i LD- og PBS-behandlede grupper (fig. 5B og S6).
Jo større akkumulering av anti-kreftlegemidler i tumorvev og mer biotilgjengelig doxorubicin i kreftcellekjerner fra de ligand-konjugerte liposomer ytterligere demonstrert at SP5-2 peptidet gjenkjent mål-molekylet på overflaten av lungekreftceller og dermed økt direkte levering av legemidler til svulst.
diskusjon
den terapeutiske effekt av anticancer medikamenter kan oppnås ved å øke medikamentformuleringen med molekyler som binder preferensielt til tumorvev, [22], [26], [37], [ ,,,0],41]. Fagdisplay biopanning på intakt celle tillater isolering av svært spesifikke peptider som er rettet mot tumorassosierte antigener. Anti-cancer regimer bevæpnet med disse peptidene kan brukes som «kryssermissiler» som er nøyaktig ledet til kreftceller og levere høye doser tilstrekkelig til å drepe disse cellene med minimal skade på normalt vev.
I denne studien vi identifisert en NSCLC målretting peptid og demonstrert sin forbedret terapeutisk effektivitet i dyremodeller. Vi fant spesielt en fag klone PC5-2 som består 90% av de utvalgte fagene binding til CL1-5 celler etter fem runder med biopanning (tabell 1). Immunhistokjemi og flowcytometri analyser bekreftet at PC5-2 bundet til NSCLC celleoverflaten. De samme bindings resultater ble observert i den beslektede syntetiske peptid SP5-2, som erstattet PC5-2 (fig. 1 og fig. S1, S2, S3). Disse forsøk understøttet at denne rettet mot peptidet kan spesifikt bindes til celleoverflaten av NSCLC-cellelinjer.
In vivo
eksperimenter også konsolidert den homing evne til peptidet. Ekspresjonen av den SP5-2 peptid (TDSILRSYDWTY) styrer fagen til å akkumulere i NSCLC-xenografter, men ikke i normale organer (fig. 2). Bindingsaktiviteten til PC5-2 til tumorvev ble inhibert av det syntetiske peptid SP5-2 (Fig. 2B), som indikerer at PC5-2 interaksjon med NSCLC-celler ved dets vises peptid og ikke av en annen del av fagpartikkelen. At den muterte syntetisk peptid, MP5-2, ikke inhiberer bindingen PC5-2 vist betydningen av den WTY motiv i bindingsaktiviteten (Fig. 2B). Dessuten ble dette fenomenet observert i immunhistokjemisk farging av kirurgiske prøver fra humane lungekreft (fig. 1D e og f), i dyremodeller for ligand rettet kjemoterapi (Fig. 3A) og i tumorlokalisering av doksorubicin levert av SP5-2- konjugerte rettet mot liposomer (fig. 4 og 5A).
immunhistokjemi vurderinger på lunge adenokarsinom kirurgiske prøver viste at SP5-2 har en klinisk potensial som bilde prober for å identifisere NSCLC eller stoffet leveringsmidler for behandling av NSCLC. Både PC5-2 og biotin-merket SP5-2 oppdaget lunge adenokarsinom kirurgiske prøver i våre eksperimenter (Fig. 1 D). Syttifem prosent (27/36) av lunge adenokarsinom prøver fra 36 pasienter uttrykt et mål molekyl som ble anerkjent av peptid (tabell S1). SP5-2, men ikke MP5-2, konkurrerte med PC5-2 for binding til lunge adenokarsinom kirurgiske prøver (Fig. 1D), noe som ytterligere bekreftet spesifisiteten av denne målretting ligand.
I tidligere studier har doxorubicin i stor grad blitt anvendt i behandling av kreft på grunn av sitt brede spektrum av antitumoraktivitet. Men effekten av doksorubicin i behandling av NSCLC er fortsatt ikke tilfredsstillende med en svarprosent på 15% [42]. Dette er delvis et resultat av suboptimale doser innen tumoren på grunn av vilkårlige medikament fordeling i hele kroppen og alvorlig toksisitet for normale vev og organer. Liposomal innkapsling med et målsøkende ligand kan være en effektiv strategi for å levere legemiddelet direkte til tumorceller. Våre data viser at dette peptid markant økt terapeutisk effekt av liposomale chemotherapies og resulterte i høyere overlevelse hos mus med humane lungekreft xenografter, og produsert begrensede bivirkninger på dyr (Fig. 3). Dette peptid økt terapeutisk indeks for ikke bare doksorubicin, men også av vinorelbin, et vinca alkaloid som brukes til å behandle avansert NSCLC [3]. Videre har vi observert redusert fartøy tetthet og vesentlig økt celle apoptose i tumorvevet etter targeting liposom behandling (fig. 5B og S6). Dette ligand-mediert liposomal formulering er potensielt bedre enn konvensjonelle anti-kreft terapi for NSCLC.
in vivo
farmakokinetiske studier på mus viste at liposomal doxorubicin dramatisk endret transport og distribusjon av doxorubicin i hjerte, lunger, nyrer og lever i mus (fig. 4 og S5).
