Abstract
stromal-epitelial samhandling har vist seg å fremme lokal tumorvekst og fjernmetastaser. Vi har søkt å skape en lovende genterapi tilnærming som co-mål kreft og dens støtte stromale celler for bekjempelse av kastrerings-motstandsdyktig prostatakreft. Heri, demonstrerte vi at menneskelig osteonectin er overuttrykt i prostata cancer epitelium og stroma tumor sammenlignet med deres normale motstykke. Vi har konstruert en ny menneskelig osteonectin promoter (HON-522E) som inneholder positive transkripsjonsregulerende elementer identifisert i både arrangøren og ekson en region av den menneskelige osteonectin genet.
In vitro
reporter analyser avslørte at Hon-522E arrangøren er svært aktive i androgen reseptor negative og metastatisk prostatakreft og bein stromale celler i forhold til androgen reseptor-positiv prostatakreftceller. Dessuten
in vivo
prostata-tumor-fremmende aktivitet av Hon-522E-promoteren ble bekreftet ved intravenøs administrering av en adenoviral vektor som inneholder den Hon-522E promoter-drevet luciferase genet (Ad-522E-Luc) i mus bærende ortotopiske menneskelige prostata tumorxenotransplantater. I tillegg er en adenoviral vektor med Hon-522E-promoter-drevet herpes simplex virus tymidin kinase genet (Ad-522E-TK) var meget effektive mot vekst av androgen-uavhengige humane prostata cancer PC3M og ben stromal cellelinje
in vitro
og i pre-etablerte tumorer PC3M
in vivo
ved tilsetning av prodrogen ganciclovir. På grunn av heterogenitet av menneskelige prostatakreft, har Hon-522E promoter-mediert genterapi potensial for behandling av hormon ildfaste og beinmetastatisk prostatakreft
Citation. Sung SY, Chang JL, Chen KC, Yeh SD, Liu YR, Su YH, et al. (2016) Co-målretting Prostate Cancer Epitel og Bone Stroma av Human Osteonectin-arrangøren-mediert Suicide Gene Therapy hemmer effektivt androgen uavhengig prostatakreft vekst. PLoS ONE 11 (4): e0153350. doi: 10,1371 /journal.pone.0153350
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTERRIKE
mottatt: 03.02.2016; Godkjent: 28 mars 2016; Publisert: 07.04.2016
Copyright: © 2016 Sung et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Grant MEST 103-2320-B-038-040-My3 (CLH) og 103-2320-B-038 -039-My3 (SYS) fra departementet for vitenskap og teknologi, MOHW105-TDU-B-212-134001 (SYS) fra departementet for helse og velferd, og TMUTOP103003-6 (CLH), TMUTOP103003-3 (SYS) og 104TMU-SHH-01-3 (YHS) fra Taipei Medical University, Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i både Europa og USA [1]. Androgen deprivasjon (ADT) regnes som en nøkkel behandling som monoterapi eller i kombinasjon med andre regimer. De fleste pasientene i utgangspunktet svare på ADT; imidlertid den iboende natur av heterogeniteten av tumorceller resulterer i motstand til behandling og progresjon inn i høyt morbid sykdom betegnet kastrering motstandsdyktig prostatakreft (CRPC) innen 18-24 måneder [2]. End-scenen CRPC er vanligvis forbundet med osseous metastaser, noe som fører til betydelig dødelighet og sykelighet med utvikling av alvorlige skjelettkomplikasjoner i berørte pasienter. Nye kliniske tilnærminger ved hjelp av agenter som er rettet mot ulike virkningsmekanismer, inkludert tubulin-bindende kjemoterapi (cabazitaxel); immunterapi (sipuleucel-T); CYP-17 hemming (abiraterone); androgen reseptor (AR) blokade (enzalutamide); og radioisotop terapi (radium-223), men har vist lovende resultater i å forsinke skjelettkomplikasjoner og også bedre total overlevelse [3], gjenstår behandling av pasienter med metastatisk CRPC en utfordring, med en gjennomsnittlig overlevelse på mindre enn 19 måneder [4] . Det er således avgjørende for behandling av metastatisk CRPC utvikling av nye midler med mer effektive antitumoraktivitet. Spesielt er narkotika nødvendig at målet hormon-refraktær prostata kreft celler uavhengig av differensiering staten, med ulike nivåer av androgen reseptor (AR) og prostataspesifikt antigen (PSA) uttrykk.
Tidligere genetiske og molekylære studier holdt at tumorceller er heterogene, og deres etterfølgende metastaser er resultatet av ikke-tilfeldige, sekvensiell og flertrinnsprosesser selektive blant forhåndseksisterende cellepopulasjoner. Imidlertid har nyere studier dokumentert intrikate inter kommunikasjonen mellom stromale og kreft epitelceller fører til permanente genetiske og atferdsendringer ikke bare i epitelceller, men også i kreft-assosiert stromale celler som driver videre genetiske og genuttrykk endringer i prostatakreftceller [ ,,,0],5, 6]. Gjennom en rekke komplekse, intime toveis kommunikasjon mellom prostatakreft og verten stroma, kreftcellene få ytterligere vekst og overlevelse fordeler og til slutt spre seg til fjerne organer med dødelig effekt [7-9]. Dermed kan co-målretting av både svulsten og dets støtte stromale celler bedre behandlingstiltak og total overlevelse av pasienter med prostatakreft [10-13]. Gitt at genterapi er blitt identifisert som den foretrukne behandling for metastatiske cancere [14], utvikle en effektiv strategi for levering og ekspresjon av terapeutiske gener i tumor epitel og tilstøtende stroma er avgjørende for å gjøre en slik behandling tilgjengelig.
Osteonectin (også kjent som basalmembran-40 [BM-40] og utskilt protein surt rikt på cystein [SPARC]) er utbredt i flere vev under utvikling og celleskader [15], og spiller en viktig rolle i å regulere celle adhesjon, spredning, migrasjon, og vev ombygging [16]. I benet mikromiljøet, er osteonectin den mest tallrike ikke-collagen matriks-protein som er sterkt uttrykt tidlig i osteoblastisk differensiering og er kritisk for opprettholdelse av benmasse [17]. Rollen osteonectin i prostatakreft har blitt identifisert som en kjemotiltrekkende for bein-invasiv prostatakreftceller [18-20]. Høye nivåer av osteonectin uttrykk har blitt observert hos prostatakreftcellelinjer avledet fra metastaser og i prostata kreft metastaser [21]. I tillegg ble forhøyede osteonectin nivåer i primær prostatakreft i forbindelse med den etterfølgende utvikling av metastase [22], noe som indikerer at prostatakreft celle metastasering til benet er mediert delvis av den osteonectin-mediert fremming av kreftcellemigrering, protease-aktivitet, og invasjon. Fordi osteonectin ekspresjon forekommer i både tumor epitelceller og benceller, kunne osteonectin promoter brukes til å drive et terapeutisk gen co-targeting beinmetastatisk prostata kreft og dens understøttende mikromiljøet, uavhengig av basalnivået av AR og PSA uttrykk.
i denne studien, søkte vi å lage en promoter-mediert terapeutisk middel som co-mål prostatakreft og dets omliggende stromale celler. Vi fant at osteonectin ble oppregulert i prostatakreft epitelceller og kreft-assosiert stromale celler sammenlignet med sine normale kolleger. Vi har konstruert en roman Hon promoter (HON-522E) som inneholder positive transkripsjonsregulerende elementer identifisert i både arrangøren og ekson en region av HON genet. Konstruerte vi også et replikasjons-defekt adenoviral vektor som bærer et herpes simplex virus tymidinkinase (HSV-TK) genet drevet av en høyaktiv 580 bp Hon promoter (Hon-522E). Behandling med denne konstruksjon, Ad-522E-TK, i kombinasjon med prodrogen ganciclovir (GCV) ble funnet for første gang for å drepe både androgen-uavhengig prostata kreft og ben stromal cellelinjer
in vitro
og for å hemme prostata tumorvekst i en xenograft modell. På grunn av heterogenitet av menneskelige prostatakreft, kan Ad-522E-TK brukes som et supplement terapi med andre AR-målretting regler for behandling av hormon ildfast og beinmetastatisk prostatakreft.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
menneskelige prostata kreft cellelinjer LNCaP, c4-2, C4-2B, PC3, DU145 og PC3M, og en menneskelig osteosarkomcellelinje MG63 som har blitt brukt i vår forrige studier [6, 23, 24] ble opprettholdt i T medium og supplert med 5% føtalt kalveserum (FBS). hFOB 1,19 human osteoblast og HS27A human benmarg stroma-cellelinjer ble kjøpt fra ATCC (Manassas, VA, USA) og holdt i en 1: 1 blanding av Hams F12-medium /Dulbeccos modifiserte Eagles medium og RPMI 1640 medium, henholdsvis med 10% FBS. Den adenovirus emballasje 293 cellelinje (Microbix Biosystems Inc., Toronto, Ontario, Canada) ble opprettholdt i Minimal Eagle Medium og supplert med 10% FBS og 2 mM glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Alle cellekulturmedier og reagenser ble kjøpt fra Invitrogen. Alle celler ble dyrket i en 37 ° C inkubator med 5% CO
2 og ble passert ved oppnådd 90% samløpet.
Menneskelig emne og Laser fangst mikrodisseksjon (LCM)
Forsøk med humane prøver ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review board (IRB) ved Taipei Medical University (TMU-JIRB 20131253). En prostata vev microarray (TMA) som inneholder 49 vev kjerner som representerer prøver fra 40 tilfeller av prostatakreft og 9 matchet normale tilstøtende vev ble hentet fra Super Bio Chips (CA4, Seoul, Korea). Frosne menneskelige prostata vevsprøver ble hentet fra TMU Joint Biobank basert på Taipei Medical University og tilknyttet sykehusene fra fag med skriftlig informert samtykke. LCM ble anvendt for å isolere selektivt rene populasjoner av prostatakreftceller og ikke-neoplastiske epitelceller samt stroma tilstøtende til Gleason grad 3 og klasse 4 kjertler og stroma i tilknytning til ikke-maligne kjertler fra frosne snitt av prostatektomi prøver avledet fra fire pasienter . I korte trekk, ble åtte-mikron tykke deler av fryst vev farget med Arcturus HistoGene Frozen § Farging Kit i henhold til produsentens instruksjoner. Områder i de utvalgte cellepopulasjoner ble microdissected fra seksjonene og samlet inn ved hjelp av ArcturusXT system og Media CapSure HS LCM Caps. Innstillingene for laseren var som følger: flekk diameter fastsatt til 30 um, strøm 70 mW, og pulsvarighet 25 millisekunder. Total RNA fra hver microdissected prøve ble ekstrahert ved hjelp av PicoPure RNA Isolation Kit følgende fremstilling protokoll. LCM instrument og alle reagenser som brukes i forsøket ble oppnådd fra Thermo Fisher Scientific Inc. (Madison, WI, USA).
Real-time RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Indianapolis, IN, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Den første-strand gratis DNA ble syntetisert ved hjelp av tilfeldige primere og Moloney murine leukemi virus revers transkriptase (Invitrogen) og utsatt for real-time PCR med LightCycler 480 med lys sykler TaqMan mester kit kombinert med Universal ProbeLibrary probe (Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. Målgener ble forsterket ved hjelp av spesifikke primere for Hon (forover: 5′-GTGCAGAGGAAACCGAAGAG-3 «og omvendt: 5′-TGTTTGCAGTGGTGGTTCTG-3»., Sondere ingen 77), og husholdningsgenet, HSPCB (forover: 5’AGCCTACGTTGCTCACTATTACG-3 «og omvendt: 5′- GAAAGGCAAAAGTCTCCACCT-3», sonde ingen 55).. Den relative genuttrykket av osteonectin i cellelinjene er representert som to
-ΔCT, med ΔCT bestemt ved å trekke den gjennomsnittlige husholdningsgenet HSPCB terskel sykle fra den gjennomsnittlige målet genet verdi.
Plasmid konstruksjon
Alle promotor konstruksjoner ble dannet ved anvendelse av TOPO TA-kloningssystemet (Invitrogen) og deretter spaltet ved hjelp av egnede restriksjonsseter i polylinkeren for å tillate innføring inn i vektoren pGL3-basis (Promega, Madison, WI, USA) inneholdende det kodende område av ildfluen luciferase genet. Alle promotor konstruksjonene hadde den samme 5′-ende. Den spacer mellom GGA-bokser 1 og 2 ble slettet ved rekombinant PCR ved hjelp av følgende primersett: 522-N: (5’ACTAGTAGCAGCTTGTCTTGTC3 «), spdel-C: (5’CTTCTCCCCTGTCTCTGTCTT3»), og spdel-N: (5 «AAGACAGAGACAGGGGAGAAG3») i kombinasjon med nedstrøms primere: Intron-C: (5’TACCTCAGTGGCAGGCAGGCAG3 «), Exon-C: (5’CAGGCAGGCAGGCGGCAG»), og Hafner-C: (5’GCGCGCTCTCCGGGCAGTCTG3 «) for å konstruere Hon-522I, inte- 522E, og Hon-522H, henholdsvis. Genomisk DNA ble isolert fra DU145 celler for malen. Alle konstruksjoner inkludert PCR-genererte DNA-fragmenter ble bekreftet ved sekvensering.
DNA transfeksjon og luciferase assay
Celler ble transfektert med ulike osteonectin promoter luciferaserapportørplasmid plasmider og pCMV-βgal (galaktosidase) i en 5 : 1 molar ratio bruker lipofektamin 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen). Etter 48 timers inkubering, ble celleekstrakter fremstilt for luciferase og β-gal aktivitet vurderinger ved hjelp av Luciferase Assay System og β-galaktosidaseenzym Assay System (Promega), henholdsvis, i henhold til produsentens instruksjoner. Relativ luciferaseaktivitet ble beregnet som ildflue luciferase relative lysenheter (RLU) dividert med den tilsvarende verdi for den β-gal-aktivitet til stede i hver prøve. Tre uavhengige eksperimenter ble utført i tre eksemplarer.
Design av adenovirus vektorer
Ad-522E-TK og Ad-522E-Luc adenovirus vektorer (type 5) ble utformet og masse-produsert i henhold til den etablerte protokollen [25]. I korthet plasmidene p522E-TK og p522E-Luc inneholdende en Hon-522E-promoteren og herpes simplex virus TK-genet og luciferase-genet, respektivt, ble konstruert ved innsetting av ekspresjonskassetten inn i E1A slettet regionen av Ad5 adenoviral shuttle vector pΔ E1sp1B. En replikasjon-defekt rekombinant adenovirus Ad522E-TK ble dannet i 293-celler ved ko-transfeksjon av disse cellene med både uttrykket shuttle-plasmidet og et sirkulært Ad genom plasmid (pJM17) ved bruk av standard kalsiumfosfat-presipiteringsmetoden [26]; Ad-CMV-TK og Ad-CMV-Luc ble konstruert på samme måte.
tymidinkinase aktivitetsanalyse
TK aktivitet i Ad-522E-tk og Ad-CMV-TK-infiserte cellelinjer ble analysert ved fosforylering av [
3H] GCV [27]. I korthet, ble supernatanten fraksjon av rå celleekstrakter blandet med et likt volum av TK analysebuffer inneholdende 0,2 uCi [
3H] GCV (Moravek Biochemicals, CA, USA), 3 mM MgCl
2, 3 mM ATP, 10 pg /mL bovint serumalbumin og 50 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,5). Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37 ° C i 90 min, overført til DE-81-plater (Whatman, Hillsboro, OR, USA), lufttørket, og vasket grundig med 50% etanol. Fosforylert [
3H] GCV bundet til platene ble bestemt med en scintillasjonsteller (Beckman Coulter Inc., Schaumburg, IL, USA). Tre uavhengige eksperimenter ble utført in triplo.
In vitro
cytotoksisitetsanalyser
Cellene ble sådd ut på 24-brønners plater ved en tetthet på 2 x 10
4 celler per brønn. Etter 24 timer ble cellene infisert med Ad-522E-TK i området 0-100 infeksjonsmultiplisitet (MOI). Etter en 2 timers absorpsjon ble den virusinneholdende medium erstattet med friskt medium. Etter 24 timer ble cellene inkubert i nærvær eller fravær av 10 mikrogram /ml GCV i 5 dager etterfulgt av en krystallfiolett farging; Deretter ble det relative celletall vurderes ved en optisk tetthet (OD) på 590 nm etter farging. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.
Animal studie
Alle dyreforsøk ble godkjent av og overholdt reglene i Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra Taipei Medical University (lac- 2013-0047). Seks uker gamle hann atymiske nakne mus BALB /cAnN.Cg-Foxn1nu /CrlNarl mus ble hentet fra National Laboratory Animal senter (Taipei, Taiwan). Dyrene ble holdt under standard patogen-frie forhold og tatt vare på i henhold til kriteriene som er skissert i National Academy of Guide Sciences for omsorg og bruk av forsøksdyr. For analyse av Hon-522E promoter aktivitet
in vivo
, 1 × 10
5 PC3M celler i 10 mL PBS ble injisert i ventral prostata hos mus. Ved 5 dager etter tumorcelle-injeksjon, tumor-bærende eller ubehandlede mus mottok intravenøs administrering av 1 x 10
9 pfu Ad-522E-Luc eller CMV-Ad-Luc gjennom halevenen (n = 5). Muse organer og prostata tumor-xenografter ble høstet for luciferase-aktivitetsanalysen 2 dager etter virus injeksjon. For vurdering av Ad-522E-TK kombinert med GCV-indusert hemming av tumorvekst
in vivo
, 5 × 10
5 PC3M celler i 50 mL PBS ble injisert subkutant i flankene av musene. Når svulsten ble følbar (3-4 mm i diameter) ble dyrene randomisert til 4 forsøksgrupper (n = 8 for hver gruppe): Gruppe 1, PBS behandling; gruppe 2, bare GCV; gruppe 3, Ad-522E-TK kombinert med PBS; og gruppe 4, Ad-522E-TK kombinert med GCV. Ad-522E-TK (50 ul; 2 x 10
9 pfu) i PBS ble administrert ved intratumoral injeksjon hver annen dag i 3 ganger. GCV (100 ul) ble administrert daglig via intraperitoneal injeksjon i en dose på 40 mg /kg kroppsvekt i 2 uker. Todimensjonale tumormålinger ble utført to ganger i uken med calipers, og svulsten volum ble beregnet ved hjelp av den forenklede formelen for en rotasjons ellipsoide (L × w
2 × 0,5236). Dyrene ble avlivet 5 uker etter behandling ved hjelp av CO
2 for aktiv dødshjelp, og svulster var glade for histopathologic eksamen.
Immunohistochemistry (IHC)
IHC farging ble utført ved hjelp av Novolink Polymer Detection System (Leica Microsystems, Newcastle Upon Tyne, UK) som tidligere beskrevet [28]. Ki-67 protein ble påvist i tumorxenotransplantater med musen antihuman Ki-67 monoklonalt antistoff (1: 100; NCL-Ki67-MM1, Leica Biosystems). Apoptose ble evaluert ved bruk av Apo-BrdU-IHC In Situ DNA Fragmentering Assay Kit (BioVision, Inc., Milpitas, CA, USA) som beskrevet [28]. IHC-farging for osteonectin ble utført på prostata TMA hjelp av en anti-human-osteonectin monoklonalt antistoff (1:50; NCL-O-NECTIN, Leica Biosystems). Hver TMA stedet ble undersøkt av en patolog (J.L.C.) med Allred scoring system [29]. Den numeriske verdien for generelle intensiteten (intensitet score) er basert på en 4-punkts system: 0, 1, 2 og 3 (for ingen, lys, medium eller mørk flekker). Den numeriske verdi for prosent farget (proporsjon score) bestemmes av en geometrisk fordeling; ingen flekk = 0; ≤1 /100 celler farget = 1; ≤1 /10 celler farget = 2; ≤1 /3 celler farget = 3, ≤2 /3 celler farget = 4; alle celler farget = 5. Tilsetning av de to verdiene gir den totale Allred ballen [30].
Statistisk analyse
Alle data presenteres som gjennomsnittet (standardavvik [SD]), med mindre annet spesifisert. Analysene ble utført ved hjelp av to-tailed t-test. P 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Uttrykk av osteonectin i prostata kreft og stromale celler
Foreningen for osteonectin uttrykk med menneskelig kreft progresjon ble først evaluert gjennom real-time RT -PCR på androgen-responsive LNCaP og androgen-insensitive PC3 prostata kreft cellelinjer. I serien av LNCaP avstamning cellelinjer, ekspresjonen av osteonectin korrelert med økt beinmetastatisk potensial, karakterisert ved at hormonet ildfaste og beinmetastatisk C4-2B uttrykte et høyere nivå av osteonectin enn gjorde dets paren androgen-avhengige LNCaP og androgen-uavhengig C4- -2 celler. Tilsvarende PC3M, den svært metastatisk derivat uttrykt 18 ganger høyere nivåer av osteonectin sammenlignet med foreldre PC3 celler som opprinnelig ble avledet fra benmetastaser fra prostatakreft (fig 1A). Resultatene viste en sammenheng mellom forhøyet osteonectin uttrykk og metastatisk CRPC progresjon. Som prostatakreft benmetastase er ansett som en mikromiljøet-drevet sykdom, høyere nivåer av osteonectin uttrykt av humane ben stromale celler enn for prostata kreftceller ble observert ved anvendelse av hFOB osteoblast og HS27A benmarg-avledede fibroblast cellelinjer (figur 1A). For å vurdere differensial uttrykk for osteonectin mellom noncancerous og kreft prostata epitelceller samt normale og kreftassosierte stromale celler i samme individene, LCM dissekert prøver fra primær prostatakreft ble brukt. Blant parene av de normale og maligne vev prostata, 3 av 4 pasientprøver viste en signifikant økt ekspresjon av osteonectin i kreftceller og kreft-tilstøtende stromale celler i forhold til deres normale motstykke; og den andre viste en redusert ekspresjon mønster i tumorvev (figur 1B).
Kvantitativ RT-PCR-analyse av mRNA-ekspresjon i osteonectin (A) en serie av human prostatakreft og ben stromal (hFOB og HS27A) cellelinjer og i (B) LCM-isolert prostata epitelceller og stromale celler fra tilpassede par av primærprostatatumor (T) og normal prostata (N) vev avledet fra 4 pasienter (Pt s 1 ~ 4). Den relative genuttrykket av osteonectin ble representert som to
-ΔCT, med ΔCT bestemt ved å trekke den gjennomsnittlige husholdningsgenet HSPCB terskel sykle fra den gjennomsnittlige målet genet verdi. Dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter og er vist som gjennomsnitt ± SD. * P 0,05, ** p 0,001 versus normale celler. (C) Punktdiagram av IHC-farging poengsum for osteonectin i prostata epitel og stroma i de delene av humant prostatavev mikromatrise inneholdende primære prostata tumor (n = 40) og normale prostata prøver (n = 9). Representative bilder av IHC farging av osteonectin i paret prostata svulst og normal prostata vev fra to individuelle pasienter ved en forstørrelse på 40 × og 100 × ble vist til høyre. Pilen og pilspiss indikerer positiv farging i stromale og epitelceller, henholdsvis.
For ytterligere å bekrefte tilknytningen mellom overekspresjon av osteonectin og prostata kreftutvikling i kliniske prøver, immunhistokjemisk (IHC) analyse ble utført på en prostata vev microarray som inneholder 40 primære prostatakreft og 9 matchet normale prostataprøver. I hver kjerne, ble immunreaktivitet for osteonectin målt i seksjoner som inneholder normal stroma, normalt epitel, tumor stroma, og tumor epitel. Selv om disse forskjellene var ikke statistisk signifikant (p = 0,2654 og 0,4042), rekkene av total Allred poengsum i de samlede prøver av svulsten epitel og tumor stroma var høyere i forhold til normal epitel og normal stroma, henholdsvis (figur 1C). Forskjellen var mer signifikant når det bare tilpassede par av prostata tumor og normal prostata prøvene ble analysert (P = 0,085 og 0,2165 for epitelisk og stromal farging farging, henholdsvis). Mangelen på statistisk signifikans kan være på grunn av den lille prøvestørrelsen. I tillegg kan sterke farging av osteonectin detekteres i prøven av prostatakreft benmetastaser (S1 Fig). Retningen på effekten antyder autokrine og parakrine handlinger osteonectin av svulsten og svulstens mikromiljø forårsaker prostata kreft og metastasering.
Identifikasjon av ytterligere transkripsjonsregulerende elementer i menneske osteonectin promoter omegn
GGA-box 1 i menneske osteonectin (HON) promoter regionen er avgjørende for maksimal transkripsjonen aktivitet, mens pyrimidin rike spacer mellom GGA-bokser 1 og 2 utøver en nedregulerende effekt [31]. Sammenligning av storfe, mus og humane osteonectin ekson 1 DNA-sekvenser viste en bemerkelsesverdig multiplum gjentakelse av sekvensen CCTG i alle arter, med en konsekvent klynge på 7-8 baser oppstrøms fra starten av ekson 1 [32]. Vi undersøkte derfor 2 Hon-promoter-reporter konstruksjoner, p522E-Luc og p522H-Luc, for å undersøke hvilken rolle den CCTG sekvens i Hon promoter funksjon. Den promoterfragmentet i p522H-Luc er identisk med det i pGL2-spdel, som har potensial transkripsjonen aktivitet i humane cellelinjer [31]. p522E-Luc har en 5′-region av hon promotersekvenser lik den for p522H-Luc, men 3′-enden strekker seg til bp + 62, i hvilke 4 CCTG heter er inkludert (figur 2A). Transfeksjon av disse konstruksjonene og PGL-3-TATA (som fungerer som en referanse av promoter aktivitet) inn i menneskelige bein stromal cellelinjer, inkludert hFOB, HS27A, og osteosarkom MG63 viste en markant økning i luciferase aktivitet ved p522E-Luc sammenlignet med p522H- Luc (figur 2B). Ytterligere 3 «forlengelse av arrangøren i bp 73 ligger på intron en region (p522I-Luc) resulterte i redusert luciferase aktivitet, tydelig viser at området mellom bp 39 og bp 62 er ansvarlig for den ekstra oppregulering av HON promoter aktivitet i humane beinceller, mens området mellom bp 63 og bp 73 inneholder en negativ regulerende element.
(A) Schema av ulike osteonectin-promoter-drevet luciferase konstruksjoner. Alle sekvensene er nummerert i forhold til en (transkripsjonsstart stedet). Delvis sekvens av osteonectin promoter fra baser 40-62 inneholder 4 CCGT motiver (understreket). En modifisert konstruksjon pGL3 (pGL3-TATA) med en kunstig TATA-boksen er satt inn oppstrøms for luciferase reporter-genet ble anvendt som en kontroll av basalnivået promoteraktivitet. (B, C) Sammenligning av luciferase-rapportøraktivitet av Hon-promoter-konstruksjonene i humane ben stromale cellelinjer og humane prostatacancercellelinjer ved
in vitro
transfeksjon, og i (D) mus organer ved
i vivo
genet levering. (B, C) Den relative luciferase-aktivitet av forskjellige konstruksjoner ble dividert med den normaliserte aktiviteten av den tomme vektoren (pGL3-TATA) og uttrykt som fold-endring over kontrollen. * P ≤ 0,05 vs. p522H-Luc. (D) luciferase aktiviteter (i relative lysenheter [RLU] per milligram protein) ble bestemt i de representative organer 2 dager etter intravenøs injeksjon av 1 x 10
9 pfu av Ad-522E-TK eller Ad-CMV-TK til voksne mus (n = 5).
Vi har evaluert ved transkripsjonen aktivitet av Hon-522E promoter i ulike prostatakreft cellelinjer som gjenspeiler ulike stadier av prostatakreft progresjon. Transfeksjonsagensene data viste at Hon-522E promoter aktivitet ble påvist i alle cellelinjene som ble testet. Imidlertid sammenligning av luciferase-aktiviteten til disse transfekterte prostatakreftcellelinjer og de med endogen osteonectin RNA-ekspresjon (Fig 1 A) viste at Hon-522E promoter-aktivitet er relativt høyere i AR-negativ, mer aggressiv, og metastatisk cellelinjer, blant annet DU145 , PC3 og PC3M celler i forhold til AR-uttrykke LNCaP, c4-2 og C4-2B cellelinjer (figur 2C).
for å vurdere potensialet nytten av Hon-522E promoter i å uttrykke et transgen i en vev-spesifikk måte
in vivo
, et adenovirus vektor som inneholder Hon-522E arrangøren eller den allestedsnærværende cytomegalovirus (CMV) promoter kjører luciferasereportergenet (Ad-522E-Luc eller Ad-CMV-Luc) ble administrert intravenøst til mannlige atymiske mus enten friske eller bærer ortotopiske PC3M svulster. Etter 2 dager med viral administrering store organer, inklusive lever, lunge, nyre, milt, tarm, hjerte, hjerne, tarm, testikler, prostata, og muskler, og PC3M tumorxenografter ble høstet for å måle luciferase-ekspresjon (Fig 2D) . Det ble observert at i den normale organer, Ad-522E-Luc mediert luciferase transgen ekspresjon i lever, milt og lunge var signifikant lavere enn den til Ad-CMV-Luc, med reduksjonshastigheter på 16%, 41%, og 1%, respektivt. I samsvar med en tidligere undersøkelse avslørende øket ekspresjon av osteonectin mRNA i bukspyttkjertel ductal epitelceller [33], luciferaseaktiviteten transduseres ved Ad-522E-Luc i bukspyttkjertelen var 34 ganger høyere enn det indusert av Ad-CMV-Luc. Mens luciferaseaktivitet ble knapt detektert i normale mus prostata, uavhengig av Ad vektor administrering, var ekstremt høy luciferase-ekspresjon ved Ad-522E-Luc observert i PC3M prostata xenotransplantater, med ekspresjon 5 ganger større enn ved Ad-CMV-Luc. Disse resultatene tyder på at Hon-522E promoter er egnet med hensyn til effektiv og selektiv transgene uttrykk for transkripsjonen målretting av AR-negative og metastatisk prostata kreft celler.
Evaluering av
in vitro
cytotoksisitet rekombinant Ad-522E-TK i prostata kreft og bein stromale celler
for å vurdere muligheten for hon promoter-rettet co-målretting genterapi for prostatakreft, vi utformet en replikering-mangel adenovirusvektor, Ad-522E- TK, bærer Hon-522E promoter-drevet herpes simplex virus TK genet. Effektiviteten av TK-genet levering i prostatakreft og ben stromale cellelinjer ble bestemt ved anvendelse av TK enzymatiske aktivitetsanalysen etter eksponering av disse cellene til Ad-522E-TK og normalisert til den ytre styre Ad-CMV-TK for viral infektivitet. Cellelinjene testet, inkludert prostata kreft og bein stromal cellelinjer, avslørte vellykket TK genet transduksjon av Ad-522E-TK med minst to ganger sterkere aktivitet i AR-negative prostatakreftceller DU145, PC3 og PC3M samt bein stromaceller MG63 og HS27A sammenlignet med AR-positive LNCaP avstamning cellelinjer (figur 3A), som var lik produktet av luciferase reporter-aktivitet ved p522E-Luc (figur 2C). Mer påfallende, Ad-522E-TK-infiserte PC3M celler utstilt en høyere snarere enn lavere i TK aktivitet enn de celler infisert med Ad-CMV-TK; Dette resultatet var i overensstemmelse med det av Ad-522E-Luc transgen aktivitet i PC3M xenograft tumorer (figur 2D). Ved ekstra prodrug ganciklovir (GCV) behandling, Ad-522E-TK markant og doseavhengig redusert vekst av PC3M celler med en høyere effekt enn for Ad-CMV-Luc; Ad-522E-TK eller GCV alene utøvde ingen cytotoksiske effekter på PC3M celler (figur 3B). I tillegg infeksjon av MG63 og HS27A med Ad-522E-TK også indusert betydelig celledød når den kombineres med GCV (Fig 3C). Disse resultatene demonstrerte evnen til Ad-522E-TK for påvirkning både prostatakreft og ben stromale celler.
(A). Sammenligning av TK transgene uttrykk i menneskelig prostata kreft celler celler og bein stromal cellelinjer ved Ad-522E-TK og Ad-CMA-TK. * P
