Abstract
histondeacetylase hemmere (HDACi) er lovende terapeutiske midler som i dag brukes i kombinasjon med kjemoterapi i kliniske studier for kreftbehandling inkludert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Men mekanismene bak deres anti-tumor aktivitet forblir unnvikende. Tidligere studier har vist at inhibering av HDAC6 induserer DNA-skade og sensitizes transformerte celler til antitumormidler så som etoposid og doksorubicin. Her viste vi at uttømming av HDAC6 i to NSCLC cellelinjer, H292 og A549, sensibiliserte celler til cisplatin, en av de første linje kjemoterapeutika brukes til å behandle NSCLC. Vi foreslo at uttømming av HDAC6 økt cisplatin-indusert cytotoksisitet skyldes styrking av apoptose via aktivering ATR /Chk1 veien. Videre viste vi at HDAC6 protein nivåer var positivt korrelert med cisplatin IC
50 i 15 NSCLC cellelinjer. Til slutt, uttømming av HDAC6 i H292 xenografter utførte redusert tumor vekt og volum og utstilt økt basal apoptose sammenlignet med kontrollene i en xenograft mus modell. Oppsummert våre funn tyder på at HDAC6 er positivt assosiert med cisplatin motstand i NSCLC og avsløre HDAC6 som en potensiell ny terapeutisk mål for platina ildfast NSCLC
Citation. Wang L, Xiang S, Williams KA, Dong H, Bai W, Nicosia SV, et al. (2012) Nedbryting av HDAC6 Forbedrer Cisplatin-indusert DNA Damage og apoptose i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 7 (9): e44265. doi: 10,1371 /journal.pone.0044265
Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 4 mai 2012; Godkjent: 31 juli 2012; Publisert: 05.09.2012
Copyright: © Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award Number R01CA164147, New Investigator grant (09KN-17) fra Florida James og Esther kong Biomedical Program, Marsha Rivkin Foundation pilot stipend, Ovarian Cancer Research Fund (OCRF ), karriereutvikling stipend fra H. Lee Moffitt kreftsenter Lung Cancer SPORE til XZ og USF Graduate Student suksess mangfold Fellowship til KAW. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft dødsfall for både menn og kvinner i USA, hevder flere liv årlig enn de neste tre årsakene til kreft død (kreft i bryst, tykktarm og prostata) kombinert [1 ]. NSCLC står for mer enn 80% av alle lungekrefttilfellene. Overlevelse for pasienter med NSCLC forbli ekstremt lav, med kun 16% av pasientene i live 5 år etter en lunge kreftdiagnose. Selv om dette dårlig prognose forklares delvis av det store antallet pasienter som har avansert sykdom, selv pasienter identifisert på et tidlig stadium erfaring høy forekomst av tilbakefall til tross for adekvat kirurgisk reseksjon [2].
Flere store randomiserte studier har vist beskjedne forbedringer i langsiktig overlevelse med adjuvans cisplatin-basert kjemoterapi [3] – [6]. På grunnlag av disse studiene har adjuvant kjemoterapi blitt standard på omsorg for pasienter med stadium II og III NSCLC. Gitt at en forholdsvis liten populasjon synes å dra nytte av kjemoterapi, er mange pasienter som utsettes for toksiske behandlingen uten klinisk nytte. En bedre forståelse av mekanismene for resistens til platina-basert kjemoterapi er nødvendig, og strategier for å identifisere pasienter usannsynlig å dra nytte av behandlingen. Nye metoder for å overvinne platina motstand kan være rettet mot disse populasjonene.
HDACs, en klasse av enzymer som fjerner acetyl grupper fra ε-N-acetyl lysin aminosyre på histoner eller andre ikke-histonproteinene, spille viktige roller i cellevekst, apoptose, skade DNA, etc. pattedyr HDACs er delt inn i fire klasser: klasse i (HDACs 1, 2, 3, og 8), klasse II (HDACs 4, 5, 6, 7, 9, og 10 ), klasse III (SIRTs 1, 2, 3, 4, 5, 6, og 7), og klasse IV (HDAC11) [7], [8]. Klasse I HDACs lokalisere hovedsakelig i kjernen og finnes i undertrykkende komplekser som Sin3, Nurd, CoREST, PRC2, N-Cor, og smrt komplekser, som deacetylate histoner og andre kjerneproteiner. Klasse II HDACs er videre delt inn IIa og IIb underklasser, og disse medlemmene utviser vev-spesifikke uttrykk. Klasse III medlemmer er SIR2 relaterte NAD
+ – avhengige deacetylases. HDAC11 er det eneste medlem av klasse IV familien på grunn av sin lave sekvenslikhet til klasse I og klasse II-medlemmer.
HDAC6 tilhører klasse IIb HDACs. Det ble klonet som et pattedyr-homolog av gjær hda1 fra mus og menneske, henholdsvis [9], [10]. Unikt, inneholder HDAC6 to funksjonelle tandem-deacetylase-domener, betegnet DAC1 og DAC2, eller DD1 og DD2, samt et ZNF-UBP domene som er en sink finger inneholdende regionen som er homolog med den ikke-katalytiske domene av flere ubiquitin-spesifikke proteaser (USPS) [11]. HDAC6 ZNF-UBP domene er i stand til å binde mono- eller poly-ubikvitin samt ubiquitinmolekyler [11] – [13]. Substrater av HDAC6 inkluderer cytosoliske proteiner som α-tubulin, HSP90, cortactin, etc [14] – [16]. HDAC6 opptrer også i ubiquitin-avhengig autofagi ved at behandlingen eller nedbrytning av proteinaggregater [17]. I tillegg er HDAC6 involvert i misfolded protein indusert celle-spenning [18]. HDAC6 er nå regnet som en mester regulator av celle respons på cytotoksiske overgrep [19]. En fersk rapport viser at HDAC6 er involvert i DNA-skadende midler indusert gentoksisk spenning [20]. Men de underliggende mekanismene er langt fra klart.
HDACs uttrykk er endret i mange kreftformer. For eksempel har overekspresjon av HDAC1, HDAC2, HDAC3, og HDAC6 blitt observert i tykktarm, bryst, prostata, cervix og gastrisk kreft [21] – [28]. Hemmende HDAC enzymer HDAC hemmere har dukket opp som en lovende metode for behandling av kreft [29] – [31]. HDAC-inhibitorer endrer status acetylering av kromatin og andre ikke-histonproteinene, noe som resulterer i endringer i genekspresjon, induksjon av apoptose, vekststans, og celle-terminal differensiering [31]. Spesielt er HDAC hemmere lovende adjuvant stoffer som brukes i kombinasjon med platinabasert kjemoterapi i flere krefttyper, inkludert lungekreft [32].
I denne studien har vi vist at HDAC6 overfører cisplatin motstand hos NSCLC cellelinjer. Knockdown av HDAC6 eller hemming av HDAC6 aktivitet ved HDAC6-spesifikk hemmer tubastatin A i NSCLC cellelinjer A549 og H292 sensitivisert cellene til cisplatin behandling. I tillegg ble en positiv og signifikant korrelasjon mellom HDAC6 proteinnivå og IC
50 av cisplatin funnet i 15 NSCLC-cellelinjer. Dessuten, H292-xenografter med HDAC6 uttømming vises mindre tumor vekt og volum, samt øket basal apoptose sammenlignet med kontroll-xenografter. Til sammen tyder våre resultater at utviklingen av kliniske relevante HDAC6-selektive inhibitorer vil være fordelaktig for å brukes i kombinasjon med platina-basert terapi i NSCLC.
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
En 10 mM stamløsning av vorinostat (Selleck kjemikalier) ble fremstilt i dimetyl sulfoksid (DMSO) og fortynnet som de nødvendige konsentrasjoner i cellekulturmedium. Tubastatin A ble kjøpt fra BioVision. En 15 mM stamløsning av tubastatin A ble fremstilt i DMSO. Cisplatin og paclitaxel ble kjøpt fra Sigma. Cisplatin ble fremstilt som en 50 mM stamløsning i dimetyl-formamid (DMF) og paclitaxel som en 10 mM stamløsning i DMSO. Antistoffer mot fosforylering av histon H2AX (γH2AX) (20E3), fosforylert ATR (Ser428) (# 2853), fosforylert Chk1 (Ser296) (# 2349), fosforylert p53 (Ser15) (16G8), Anti-ATR (# 2790), anti-caspase 3 (8G10), PARP-1 (# 9524S) og α-tubulin (1h10) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, mens anti-acetylert tubulin og anti-β-aktin var fra Sigma. Anti-Chk1 (2G1D5), anti-p53 (DO-1) og anti-HDAC6 (H-300) antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology.
Cellelinjer og generering av Scramble og HDAC6 knockdown H292 Cell Lines
NSCLC cellelinjer ADLC, A549, EPLC, H23, H292, H358, H441, H460, H522, H661, H820, H1650, H1975, H2122 og H2172 ble hentet fra American Type Culture Collection (ATCC ). Celler ble dyrket i RPMI 1640-medium med penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml) og 10% føtalt bovint serum (FBS) og inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2. A549 HDAC6 knockdown (A549-HD6KD) og kontroll (A549-Sup) stabile cellelinjer ble vennlig levert av Dr. Tso-Pang Yao som beskrevet av Kawaguchi et al. [18]. H292 krafse og HDAC6 knockdown stabile cellelinjer ble valgt klonalt med 0,5 ug /ml puromycin. Først, H292-celler ble transient transfektert med kontroll vektor pRS eller shRNA vektor mot HDAC6 (gjenkjenne sekvensen 5-AGGTCTACTGTGGTCGTTACATCAATGGC-3 «, røret-ID: TI349960, ORIGENE) (Cat # TR20003.). Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene splittet til å duplisere plater av 1:20 i RPMI1640 medium inneholdende 0,5 ug /ml puromycin. Puromycin ble etterfylles hver 2 dager for å opprettholde tilstrekkelig nivå av seleksjonstrykk. Den godt isolerte enkeltkloner ble overført til 24-brønners plater. Knockdown effekten ble bekreftet ved Western blotting analyse ved hjelp av anti-HDAC6 antistoffer.
MTT Analyser
Cell vekst og levedyktighet ble evaluert av MTT-analyse. I korthet ble cellene sådd i sextuplet inn i 96-brønners flatbunnede plater ved en tetthet på 5 x 10
3 celler /brønn. Stoffet ble lagt på de angitte konsentrasjoner 24 timer etter seeding mens kjøretøyet ble lagt til som kontroll. På de angitte dager ble cellene inkubert med 3- (4, 5-dimethylthiszol-x-yl) -2, 5-diphenytetrazolium-bromid (MTT) (Sigma) oppløsning i 4 timer, deretter supplert med 100 ul DMSO og rystet i 15 min. Absorbansen av cisplatin-eksponerte kulturer ble målt ved anvendelse av en multi-brønn-spektrofotometer ved 550 nm med en 630 nm referanse. Resultatene ble presentert som prosent absorbans i forhold til bilens kontrollkulturer.
Cell Cycle Analysis
H292-celler ble høstet og forsiktig resuspendert i single cellesuspensjon i Fluorescence Activated Cell Sortering (FACS) buffer (PBS inneholdende 2% FBS). Cellene ble vasket to ganger med PBS og fiksert i kald 70% etanol over natten. Cellene ble deretter vasket to ganger med kald PBS igjen, resuspendert i 50 ul PBS pluss 3,3 ul RNase A oppløsning (30 ug /ml) og inkubert i 30 minutter ved 4 ° C. Suspensjonen ble tilsatt med 450 ul FACS-buffer og 25 ul propidiumjodid (PI, 1 mg /ml), fulgt av inkubering ved 4 ° C i 30 minutter. Cellene ble så analysert med FACS maskinen umiddelbart. Resultatene ble analysert med FlowJo v8.3.3 programvare.
Immunoblotting analyse
Hel-celle-ekstrakter ble fremstilt ved tilsetning av RIPA-buffer (25 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% NP -40, 1% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, og protease-inhibitor cocktail). Proteinkonsentrasjonen av alle prøvene ble bestemt ved Bradford-reagens (Bio-Rad). Proteinene ble gjenoppløst på 8% eller 12% SDS-PAGE-geler og overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble undersøkt med primære antistoffer og pepperrot (HRP) konjugerte sekundære antistoffer (GE Healthcare). Til slutt ble de blotter visualisert ved hjelp Chemiluminescent Detection Kit (Pierce).
Comet Analyser
Etter cisplatin behandling, H292-pRS kontroll eller HD6-KD cellene ble bestrålt med 10 Gy av gammastråling til introdusere tilfeldige enkelttrådbrudd. I utgangspunktet, jo flere tverrbindinger introdusert av cisplatin, jo færre enkelttrådsbrudd vil bli oppdaget i bestrålte celler. Kometen ble utført ved hjelp av en OxiSelect ™ Comet Assay kit (Cell Biolabs, Inc.) i henhold til produsentens protokoll.
Immunofluoresence Mikros
Celler dyrket på kammer lysbilder (Chamber Slide System laboratorie TekII) ble vasket med PBS og fiksert i 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur. Fiksering ble stoppet med PBS inneholdende 1% glysin. Celler ble permeabilisert ved anvendelse av 1% glysin /0,5% Triton X-100 oppløsning ved romtemperatur i 15 min. Etter blokkering med 5% bovint serumalbumin (BSA) i en time, ble cellene inkubert i PBS inneholdende 0,2% Triton X-100, 1% BSA, og den anti-γH2AX antistoff (20E3) over natten ved 4 ° C. Cellene ble deretter vasket med PBST (PBS inneholdende 0,1% Tween), etterfulgt av inkubering med sekundært antistoff (i PBS inneholdende 1% BSA) i 45 min. Til slutt, ble cellene vasket med PBS inneholdende 0,1% Tween og deretter PBS alene. Platene ble tørket og montert med Vectashield® monteringsmedium inneholdende DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Colony Forming Assay
I korthet ble celler ble sådd i tre paralleller (1000 celler per 60 mm vev kultur parabol) og inkubert over natten ved 37 ° C slik at cellene til å feste til rettene. Cellene ble deretter behandlet med bærerkontroll eller cisplatin i 8 dager. Etterpå ble cellene vasket med PBS, fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 minutter, og farget med krystallfiolett (0,5% krystallfiolett, 1% paraformaldehyd og 20% metanol i PBS) i 30 min. Kolonier på hver plate ble tellet og celleoverlevelse etter cisplatinbehandling ble uttrykt som en prosentandel av antallet overlevende kolonier på kontrollplatene.
tumorvekst
Alle prosedyrer med mus ble utført i henhold til en protokoll med tittelen: Role of HDAC6 i Platinum Resistance av ikke-småcellet lungekreft som ble godkjent av en Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) i Divisjon for forskning Integritet og Compliance ved University of South Florida på 10/19/2011 (Protocol # R4064). Den 5- til 6 uker gamle kvinnelige atymiske nakne mus (Nu /Nu mus) som veier ~ 20 g ble kjøpt fra National Cancer Institute (NCI). H292-PRS kontrollceller (5 x 10
6 celler /100 ul i RPMI 1640-medium pluss 50% matrigel) ble injisert subkutant inn i venstre flanke og den samme mengde av H292-HD6KD-celler ble injisert inn i den høyre flanke. Tumorene fikk vokse i seks uker. Tumor størrelser ble registrert hver uke. Tumor volum ble beregnet ved hjelp av formelen V = (L × B
2) × 0,5 (V = volum, L = lengde, W = bredde) [33]. Gjennomsnittlig tumorvekt ble også beregnet etter høsting svulster.
immunhistokjemisk farging
H292 kontroll og HDAC6 knockdown xenotransplantater ble høstet og fiksert i formalin, deretter innstøpt i parafin og seksjonert. Tissue microarray av 12 xenografter av H292-pRS og H292-HD6KD parene ble utarbeidet av Moffitt histologi kjernefasilitet ved hjelp Beecher Instrument Tissue Arrayer. Lysbilder ble farget ved hjelp av en Ventana Discovery XT automatisert system (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona) som per produsentens protokoll med proprietære reagenser. Kort, lysbilder ble deparaffinized på automatisert system med EZ Prep-løsning (Ventana). Heat-indusert antigen henting metoden ble brukt i Cell Conditioning 1 (Ventana). Kaninen primære antistoff som reagerer på kløyvde caspase 3, (# 9661, Cell Signaling, Danvers, MA) eller Ki67 (# M3060, Spring Bioscience) ble brukt på en 1:400 eller 1:100 konsentrasjonen i Dako antistoff fortynningsmiddel (Carpenteria, CA) og inkubert i 60 min. Ventana anti-kanin-sekundært antistoff ble brukt for 16 min. Deteksjonssystemet som ble brukt var Ventana OmniMap kit, og lysbilder ble deretter kontra med Hematoxylin. Skinnene var så dehydrert og coverslipped som vanlig laboratorieprotokoll.
En Tissue microarray (TMA) lysbilde farget mot kløyvde caspase 3 har vært digitalt skannet med Aperio ™ (Vista, CA) ScanScope XT med en 200x /0,75 NA objektiv med en hastighet på 4 minutter per lysbilde via Basler tri-lineær-array. Bildeanalyse ble utført ved hjelp av en optimalisert Aperio PositivePixelCount ® v9.0 algoritme med følgende optimaliserte terskler [HueValue = 0,1; HueWidth = 0,5; Iwp (High) = 220; Iwp (Lav) /Ip (High) = 175; Ip (Lav) /ISP (High) = 100; Isp (lav) = 0; INP (High) = -1] til segmentet positive piksler av forskjellige intensiteter. Den prosentvise positivitet er kvantifisert med antall celler som utviser positiv flekk som en prosentandel av den totale tumorcelletall. Den fargeintensitet ble terskel som parametertized ovenfor inn negative (0), lav (1+), moderat (2+) og sterk positiv (3+) av gjennomsnittlig flekk tetthet (0-255 dynamic range) for hver TMA kjerne. Treningen algoritme utviklet ble kvalitetssikret av en praktiserende patolog.
Statistical Analysis
Alle analyser ble utført i minst tre uavhengige forsøk. Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± SEM, og statistiske sammenligninger mellom grupper ble utført ved hjelp av en enveis ANOVA fulgt av Dunnet test. En
p
-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Spearman koeffisient og
p
-verdi for sammenhengen mellom HDAC6 nivå og cisplatin IC
50 ble beregnet ved SAS programvare.
Resultater
HDAC6 er assosiert med Cisplatin- indusert Cytotoksisitet hos NSCLC cellelinjer
for å karakterisere rollen HDAC6 i cisplatin motstand, to par HDAC6 knockdown cellelinjer fra H292 og A549 ble etablert (figur 1A og 1D). Cytotoksisitet av cisplatin i kontroll og HDAC6 knockdown parene (H292-PRS og H292-HD6KD, A549-Sup og A549-HD6KD) ble målt ved MTT-analyser. Som vist i figur 1B og 1E, vises A549 og H292-celler utarmet av HDAC6 forsterket cytotoksisitet etter behandling med cisplatin i 3 dager, sammenlignet med de fra kontrollceller. For å bestemme den langsiktige effekten av HDAC6 knockdown på celleoverlevelse, utførte vi kolonidannelse analyser. Som vist på figur 1G og 1H, uttømming av HDAC6 signifikant redusert antallet av kolonidannelse i H292-celler ved behandling med cisplatin. Interessant, knockdown av HDAC6 ikke forbedre paclitaxel-indusert cytotoksisitet i A549 og H292-celler, noe som tyder på at økt følsomhet for cisplatin ved uttømming av HDAC6 var narkotika spesifikke (figur 1C og 1F). For å undersøke om uttømming av HDAC6 kan re-sensitiv cisplatin resistente celler, C13 cellelinje, en cisplatin resistent eggstokkreft cellelinje avledet fra OV2008 [34], ble stabilt transfektert med kontroll eller HDAC6 shRNA å etablere kontroll og HDAC6 knockdown cellelinjer. Som vist i fig S1, uttømming av HDAC6 i C13-celler dramatisk redusert cisplatin IC
50 sammenlignet med kontrollceller. For å kunne utvide våre funn, målte vi HDAC6 nivå og cisplatin IC
50 i 15 NSCLC-cellelinjer. Som vist i fig 1I og S2, HDAC6 proteinnivå positivt korrelert med cisplatin IC
50. Den Spearman koeffisient (0,64875) og
p
-verdi (0,0089) antydet at denne korrelasjonen var statistisk signifikant. Vi neste spurt om uttømming av HDAC6 i ikke-transformerte celler kan bevisstgjøre celler til cisplatin. Som vist i fig S3, ble cisplatin IC
50 signifikant redusert i HDAC6 knockout embryoniske fibroblaster (MEFs) sammenlignet med villtype MEFs. Samlet våre resultater indikerte at HDAC6 overfører cisplatin motstand.
, H292-celler ble transfektert med rykke shRNA eller shRNA mot HDAC6 å generere H292-pRS eller H292-HD6KD stabil klone, henholdsvis. HDAC6 uttrykk i kontroll (H292-PRS) eller HDAC6 knockdown (H292-HD6KD) celler ble oppdaget av anti-HDAC6 Western blotting-analyse (øvre panel). Anti-β-actin Western blotting ble utført for å sikre lik belastning av protein (nedre panel). B, knockdown av HDAC6 sensibilisert H292-celler til cisplatin behandling. MTT-analyser ble utført ved anvendelse av H292-H292 eller pRS-HD6KD celler eksponert for bærerkontrollen (0 uM cisplatin) eller indikerte konsentrasjoner av cisplatin i 3 dager. C, knockdown av HDAC6 ikke sensitiv H292-celler til paclitaxel behandling. MTT-analyser ble utført ved anvendelse av H292-H292 eller pRS-HD6KD celler behandlet med vehikkel-kontroll (0 nM paclitaxel) eller indikerte konsentrasjoner av paclitaxel i 3 dager. D, HDAC6 ble effektivt tømt i A549 celler. HDAC6 uttrykk i kontroll (A549-Sup) eller HDAC6 knockdown celler (A549-HD6KD) ble oppdaget av anti-HDAC6 Western blotting-analyse (øvre panel). Den anti-β-actin Western blotting-analyse ble også utført for å sikre lik belastning (nedre panel). E, knockdown av HDAC6 sensibiliserte A549 celler til cisplatin behandling. MTT-analyser ble utført ved anvendelse av A549-Sup eller A549-HD6KD celler behandlet med vehikkel-kontroll eller indikerte konsentrasjoner av cisplatin i 3 dager. F, knockdown av HDAC6 ikke bevisst A549 celler til paclitaxel behandling. MTT-analyser ble utført ved anvendelse av A549-Sup eller A549-HD6KD celler behandlet med vehikkel-kontroll eller indikerte konsentrasjoner av paclitaxel i 3 dager. G, kolonidannelse analyser ble utført med H292-PRS og H292-HD6KD celler i 8 dager med kjøretøykontroll (0 mikrometer cisplatin) eller indikerte konsentrasjoner av cisplatin. H, De kvantitative resultatene ble oppnådd ved å beregne kolonier fra G.
Kolonner, mener fra tre eller seks duplikater; barer, SEM (*, P 0,05, **, P 0,01; ***, P 0,001)
. Jeg, HDAC6 nivåer positivt korrelert med cisplatin IC
50 i et panel av NSCLC cellelinjer. HDAC6 protein nivåer ble oppnådd ved Western blotting analyser av 15 NSCLC linjer (ADLC, A549, EPLC, H23, H292, H358, H441, H460, H522, H661, H820, H1650, H1975, H2122 og H2172) og kvantifisert ved nummer én programvare. Cisplatin IC
50 ble beregnet fra MTT-analyser etter behandling av disse cellene i 3 dager. Korrelasjonen mellom HDAC6 protein nivå og cisplatin IC
50 ble analysert ved SAS programvare. En prikk tomten ble brukt til å illustrere positiv korrelasjon mellom HDAC6 nivå og cisplatin IC
50. Spearman koeffisient var 0,64875 og
p
-verdi var 0,0089.
Nedbryting av HDAC6 komplementerer Cisplatin-indusert apoptose
For å avgjøre om knockdown av HDAC6 forbedret cisplatin cytotoksisitet er grunn til celle apoptose, undersøkte vi PARP1 spalting i H292-pRS og H292-HD6KD par. Som vist i figur 2A, ble spaltet PARP1 forhøyet i H292-HD6KD celler sammenlignet med den i H292-PRS-celler etter 5 uM eller 10 uM cisplatin behandling. I tillegg, som vist i figur 2B, den spaltes PARP1 båndet først på tidligere (dag 1) i H292-HD6KD-celler sammenlignet med kontrollceller (dag 2). Lignende resultater ble også oppnådd ved anvendelse av HDAC6 villtype og knockout MEFs par (fig S4) og A549-Sup og A549-HD6KD par (data ikke vist). For å bekrefte våre resultater, flowcytometri analyse ble brukt for å påvise apoptotisk befolkningen i celler eksponert for cisplatin. Som vist i figur 2C og 2D, sub-populasjon G1, noe som indikerer apoptotiske celler [35], ble dramatisk økt i H292-HD6KD-celler sammenlignet med H292-PRS celler eksponert til 5 eller 10 uM cisplatin. Derfor uttømming av HDAC6 økt cisplatin-indusert apoptose. For å undersøke om apoptose var caspase 3 avhengige, vi har oppdaget nivåene av kløyvde caspase 3 i H292-pRS eller H292-HD6KD celler eksponert for cisplatin. Som vist i figur 2E, ble nivåene av spaltede kaspase 3 økte i HD6KD celler når de utsettes for en, 5 eller 10 uM cisplatin, sammenlignet med kontrollceller. Total, våre resultater tyder på at uttømming av HDAC6 øker caspase-avhengig apoptose etter behandling med cisplatin i NSCLC-celler.
, H292-H292 eller pRS-HD6KD-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av cisplatin i 24 timer. Anti-PARP1 og anti-p-aktin Western blotting analyser ble utført. B, H292-PRS og H292-HD6KD celler ble behandlet med 5 mikrometer cisplatin for de angitte dagene. Anti-PARP1 og anti-p-aktin Western blotting analyser ble utført. C, Sub-G1 befolkningen ble bestemt i H292-pRS eller H292-HD6KD celler behandlet med kjøretøy (0 mikrometer cisplatin) eller cisplatin ved FACS analyse. CDDP representerer cisplatin. D, Kvantitativ presentasjon av prosentandelene av sub-G1 faseceller fra C. E, H292-H292 eller pRS-HD6KD-celler ble behandlet med den angitte dose av cisplatin, og anti-spaltet kaspase 3 og anti-β-aktin Western blotting analyser var utføres.
knockdown av HDAC6 forverrer cisplatin-indusert DNA Damage
for å utforske funksjonene HDAC6 i cisplatin-indusert DNA skade, ble H292-PRS og H292-HD6KD celler undersøkes av enkelt celle kometmetoden, en standard teknikk for å evaluere DNA-skader. Etter cisplatin behandling, ble begge cellene eksponert for 10 Gy av ioniserende stråling for å indusere tilfeldige enkelttrådbrudd (angitt med komethaler). Effekten av cisplatin-indusert tverrbinding ble vist ved å forkorte av komethaler [36]. Som vist i figur 3A, til venstre to paneler, etter bestrålings lignende distinkte komet ble observert i både kontroll- og HD6KD celler eksponert for kjøretøykontroll. Men ved cisplatin behandling, ble mer forkortede haler observert i HD6KD celler sammenlignet med kontrollceller (figur 3A, høyre to paneler), noe som tyder på at uttømming av HDAC6 sensibilisert H292-celler til cisplatin-indusert DNA skade. Kvantitativ analyse av kometen analysen ble vist i figur 3B. Cisplatin kan også stimulere H2AX fosforylering av serin 139 (γH2AX) hvis brennpunkter dannelse kan anvendes for å analysere DNA-skade [37] – [39]. Vi brukte derfor immunfluorescens farging for å bestemme γH2AX foci formasjon. Etter cisplatin behandling, ble flere γH2AX foci identifisert i H292-HD6KD celler sammenlignet med kontrollceller (Figur 3C). Foci i kjernen ble kategorisert i tre grupper: Foci 20, Foci = 1~20 og Foci = 0. Den prosentandelen av celler som faller inn i de ovennevnte tre grupper ble kvantifisert. Som vist i figur 3D, høyere prosentandeler av cisplatin-behandlede celler HD6KD tilhørte den Foci 20 gruppe, sammenlignet med den til kontrollceller, tyder på at uttømming av HDAC6 stimulert cisplatin-indusert DNA-skade. Tilsvarende, i A549-Sup og HD6KD eller C13-pRS og HD6KD par, flere brennpunkter 20 gruppe ble funnet i HDAC6 knockdown-celler (data ikke vist). Konsekvent, Western blot-analyse viste at nivåene av γH2AX ved 5 eller 10 mM cisplatin behandlinger var høyere i H292-HD6KD-celler sammenlignet med H292-pRS kontrollceller (figur 3E). I tillegg γH2AX nivåene var høyere i H292 HDAC6 knockdown celler eksponert til 5 uM cisplatin for 1, 2 og 3 dager sammenlignet med kontrollceller (figur 3F). Lignende resultater ble også observert i kontroll A549 og A549 HDAC6 knockdown par (fig S5). Vi neste brukte farmakologiske hemmere som vorinostat (pan-HDAC hemmer) og tubastatin A (HDAC6-selektiv hemmer) for å validere at undertrykkelse av HDAC6 aktivitet øker cisplatin-indusert DNA-skader i NSCLC celler. Som vist i figur 4A og 4B, co-behandling av vorinostat og cisplatin drastisk økte nivåene av γH2AX i A549 eller H292-celler sammenlignet med celler behandlet med enten cisplatin eller vorinostat alene. De tilsvarende resultater ble også oppnådd i A549 og H292-celler ved hjelp av tubastatin A å erstatte vorinostat (figur 4C og 4D). Både vorinostat og tubastain En kan dramatisk øke nivåene av acetylert tubulin, noe som tyder på at HDAC6 aktivitet var effektivt hemmet. Interessant, apoptose ble påvist som det spaltede PARP1 i H292-celler behandlet med cisplatin og vorinostat i kombinasjon eller cisplatin og tubastatin A i kombinasjon, men ikke i A549-celler (figur 4). Disse dataene tyder på at H292-celler er mer sensitive overfor disse medikamenter enn A549-celler. HDAC6 protein nivåer var upåvirket av medikamentell behandling (figur 4). Til sammen tyder våre resultater at inhibering av HDAC6 aktivitet sensitizes cisplatin-indusert DNA-skade.
A, H292-H292-PRS eller HD6KD-celler ble behandlet med vehikkel (0 uM cisplatin) eller cisplatin i 24 timer, deretter bestrålt med 10 Gy av gammastråling for å introdusere tilfeldige enkelttrådbrudd. Comet analyser ble utført som beskrevet i Metoder. B, uncrosslinked DNA ble scoret av høy kapasitet som favoritt Analysis System (HCSA) programvare (Coats Associates, Inc.).
Kolonner, mener fra 40 enkeltceller; barer, SE (***, P 0,001)
C, immunfluorescens farging av γH2AX foci i H292-pRS eller H292-HD6KD celler behandlet med kjøretøy (0 mikrometer cisplatin) eller cisplatin som angitt.. D, Kvantitativ representasjon av γH2AX foci i ovennevnte celler.
kolonner, mener fra 600-celler.
E, ble H292-H292 og PRS-HD6KD-celler behandlet med de angitte konsentrasjoner av cisplatin i 24 timer, og anti-γH2AX og anti-β-aktin Western blotting analyser ble deretter utført. F, De ovenfor angitte celler ble behandlet med bærer eller 5 uM cisplatin for de angitte dagene og anti-γH2AX og anti-β-aktin Western blotting analyser ble utført.
, A549-celler ble behandlet med bærerkontrollen , cisplatin alene, vorinostat alene, eller cisplatin og vorinostat i kombinasjon i 24 timer, deretter anti-γH2AX, anti-acetylert tubulin, anti-PARP1, anti-HDAC6, og anti-p-aktin Western blotting analyser ble utført. B, H292-celler ble behandlet med bærer-kontroll, cisplatin alene, vorinostat alene eller cisplatin og vorinostat i kombinasjon i 24 timer, deretter anti-γH2AX, anti-acetylert tubulin, anti-PARP1, anti-HDAC6, og anti-β-actin Western blotting analyser ble utført. Pilspissen indikerte spaltede PARP1 band. C, A549-celler ble behandlet med bærer-kontroll, cisplatin alene, tubastatin A alene eller cisplatin og tubastatin A i kombinasjon i 24 timer, deretter anti-γH2AX, anti-acetylert tubulin, anti-PARP1, anti-HDAC6 og anti-β-aktin Western blotting analyser ble utført. D, H292-celler ble behandlet med bærer-kontroll, cisplatin alene, tubastatin A alene eller cisplatin og tubastatin A i kombinasjon i 24 timer, og anti-γH2AX, anti-acetylert tubulin, anti-PARP1, anti-HDAC6 og anti-β-actin Western blotting analyser ble utført. Pilspissen indikerte spaltet PARP1 bandet.
knockdown av HDAC6 Øker Fosforylering av DNA Damage Signa Proteiner Ved Cisplatin Behandling
De store molekylære sensorer av DNA-skade inkluderer ATM (ataxia telangiectasia mutert) og ATR (ataksi telangiectasia og Rad3-relatert) [40], [41]. I respons til DNA-skade, vil disse kinaser rekruttere og aktivere andre signaliseringsproteiner, så som Chk1 og Chk2, induserer cellesyklus-stans eller apoptose. Alle disse kinaser, kan ATM, ATR, Chk1 og Chk2 fosforylere og aktivere p53 som fører til cellene gjennomgår apoptose etter DNA-skader. For å avgjøre om HDAC6 reduksjon kan forbedre DNA skader signaliserer etter cisplatin behandling, ble de viktigste proteinene testet. H292-H292 og PRS-HD6KD-celler ble behandlet med vehikkel (0 uM cisplatin) eller cisplatin i 24 timer.
