Abstract
Bakgrunn
Polymorphism av gener som koder for narkotika-enzymer er kjent for å spille en viktig rolle i økt mottakelighet av tykk- og endetarmskreft. UGT1A gen locus er blitt foreslått for å definere vev-spesifikk aktivitet glukuronidering. Redusert kapasitet på glukuronidering er korrelert med utviklingen av tykktarmskreft. Derfor søkte vi å utforske polymorfisme av UGTlA genet i menneskets tykktarmskreft.
Metoder
Kreft og friskt vev ble oppnådd fra selectedpatients. Blodprøver ble tatt og UGTlA mRNA-transkripsjoner ble analysert. Genomisk DNA ble preparert og UGTlA8 ekson-1 sekvenser ble amplifisert, visualisert og renset. Den ekstraherte DNA ble subklonet og sekvensert. To-tailed Fishers eksakte test, Odds ratio (ORS), konfidensintervall (CIS) og logistikk regresjonsanalyse ble brukt for statistisk analyse.
Resultater
UGTlA mRNA uttrykk ble redusert i kreftvevet i forhold med friskt vev fra den samme pasient. Den UGTlA mRNA uttrykk av friskt vev i studie pasienter var lavere enn kontroll. MRNA uttrykk av kreftvev ble nedregulert i UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6, 1A9 og oppregulert i UGTlA8 og UGTlAl0 UGT1A5 og UGT1A7 ble ikke uttrykt i tarmvevet i noen av gruppene. Allelet frekvens av WT UGTlA8 * 1 var høyere (p = 0,000), hyppighet av UGTlA8 * 3 ble senket i kontrollgruppen (p = 0,000). Ekspresjonen av homozygot UGTlA8 * 1 var høyere i kontrollgruppen (p = 0,000). Høyere frekvens av både heterozygote UGTlA8 * 1 /* 3 og UGTlA8 * 2 /* 3 ble funnet i studiegruppen (p = 0,000; p = 0,000). Forekomsten av tykktarmskreft var hovedsakelig knyttet til tilstedeværelsen av polymorfe UGTlA8 * 3 allelene (p = 0,000).
Konklusjon
Regulering av menneskelige UGT1A gener er vev-spesifikk. Individuell variasjon i polymorfe uttrykk for UGTlA genet locus ble registrert i alle typer colonic vev testet, mens levervev uttrykk var uniform. Den høye forekomsten av UGTlA8 polymorfisme eksisterer i pasienter med kolorektal kreft. UGTlA8 * 1 allelet er en beskyttende faktor og UGTlA8 * 3 allele er en risikofaktor
Citation. Wang M, Sun D-F, Wang S, Qing Y, Chen S, Wu D, et al. (2013) Polymorphic Uttrykk for UDP-Glucuronosyltransferase UGTlA Gene i Human tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (2): e57045. doi: 10,1371 /journal.pone.0057045
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan
mottatt: 16. desember, 2012; Godkjent: 16 januar 2013; Publisert: 27 februar 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Science and Technology Key Prosjekt i Shandong-provinsen (No.2006GG3202050), Science bonusmidler for Unge Forskere i Shandong-provinsen (NO.2007BS03017, ingen URL link), og Science Foundation i Shandong-provinsen (No.Y2008C115 Natural, ingen URL link). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de mest vanlige typer kreft på verdensbasis. Basert på data fra International Agency for Research on Cancer (IARC), tykktarmskreft står for 9,4% av alle
de novo
kreftdiagnose i 2007.Compare til tallene i 2000, nylig diagnostisert kolorektalkreft i 2007 hadde økt med 27%, hadde og dødeligheten økt med 28%; som står for en årlig økning på 3,9% og 4,0%, henholdsvis [1].
Selv om etiologien av tykktarmskreft ikke er fullt ut forstått, er Polymorphism av gener som koder for narkotika-enzymer kjent for å spille en viktig rolle i økt mottakelighet for tykktarmskreft [2]. En myriade av enzymer er involvert i fase I og fase II metabolske veier, herunder medlemmer av cytokrom P450 (P450) og UDP-(UGT) familiene. UGTs kata glukuronidering reaksjon, noe som er viktig for xenobiotisk metabolisme. Glukuronidering kan for utnyttelse av visse næringsstoffer, så vel som avgiftning og utskillelse av potensielt skadelige forbindelser og metabolitter, slik som steroider, bilirubins, eksogene legemidler, toksiske kjemikalier og mutagene stoffer [3]. Over 50 typer UGTs hadde blitt identifisert i mange organer og vev av dyr og menneske, inkludert lever, intestinal mucosa, lunger, hjerne, placenta og livmor [4] – [8]. Menneske UGTs har blitt delt inn i UGT1, 2, 3 og 8 multigen familier basert på evolusjonære divergens [4]. Hittil har 21 forskjellige UGTs [9] blitt funnet hos mennesker. Det humane UGT1A gen locus befinner seg på kromosom II. Det består av tretten forskjellige første eksoner på 5′-enden bundet, ved alternativ spleising, til fire forskjellige vanlige eksoner på 3′-enden. UGT1A gen locus koder for minst ni funksjonelle proteiner (UGT1A1, UGT1A3-UGT1A10) og fire pseudogener (UGT1A2, UGT1A11-UGT1A13) [10].
vevsspesifikke ekspresjon av genet UGT1A locus har blitt godt karakterisert. Genet hadde blitt foreslått for å definere vev-spesifikk glukuronidering aktivitet i menneskets fordøyelsessystemet. Lever UGT1A proteiner (UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6 og UGT1A9) har blitt studert og identifisert i detalj. Studier som undersøkte fordøyelsessystem har ført til identifisering av tre ekstrahepatiske UGT1A transkripsjoner: UGT1A7, UGT1A8 og UGT1A10 [11], [12]. Ved å bruke revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR), lavere genekspresjon av UGT1A8 ble notert i spiserøret [13]. En mer omfattende studie viste ingen påvisbar UGT1A8 RNA i tynntarmen, men rikelig nivåer av UGT1A8 mRNA i tykktarmen [12]. For tiden data om ekspresjonen av UGT1A8 i leveren eller andre humane vev har vært mangelvare. Den selektive ekspresjon av UGT1A8 i tykktarmen kan indikere at UGT1A8 spiller en viktig rolle i cellulær homeostase og disponeringen av endogene og eksogene forbindelser. Det ble rapportert at humane UGT1A8 protein kata glukuronidering av kumariner, fenoliske forbindelser, antrakinoner, flavonoider og en rekke steroider, på transfekterte humane embryonale nyre 293 (HEK293) celler [14]. Tenk at tykktarmen inneholder en betydelig mengde UGT1A proteiner [12], en redusert kapasitet på glucuronidating spesifikke stoffer kan være skadelig for homeostatiske balansen i tykktarmen.
I løpet av de siste årene, genotyping og sekvense data hadde førte til oppdagelsen av over 100 varianter innenfor promotorområdene og den kodende sekvens av UGT1A gener. Spesielt mange av variantene utviser allel frekvenser på opp til 40-50% i den generelle populasjonen, som er funnet å være i koblingsulikevekt. Men, noen varianter av tilstrekkelig frekvens i den generelle befolkningen å bli klassifisert som polymorfismer [15], [16]. Polymorfisme er best representert ved UGT1A1-genet, som er kjent for å inneholde 113-varianten allel genotyper av UGT1A1 (UGT1A1 * 1-UGT1A1 * 113). Mange av UGT1A1 gener har høye allelfrekvenser [17], [18]. Genetisk polymorfisme hadde også blitt funnet i UGT1A3 [19], [20], UGT1A4 [21], [22], UGT1A6 [23], [24], UGT1A7 [16], [25], [26], UGT1A8 [12 ], [14], [21], [27], [28], og UGT1A9 [29]. Polymorfisme fører til ulike grader av transkripsjonen samt funksjonelle endringer, noe som kan redusere UGTs aktivitet og resultater i patologi av de berørte personer. Analysen av en case-kontrollert studie viste økt risiko for å utvikle tykktarmskreft (CRC) hos personer som bærer UGT1A1 * 6 og UGT1A7 * 3 varianter [30]. Analysen av genetisk polymorfisme av UGT1A3 gener (UGT1A3 * 2, UGT1A3 * 3) viste at ikke bare aktiviteten av det uttrykte proteinet UGT1A3 hadde endret seg, men spesifisiteten for forskjellige substrater er påvirket, så vel [20]. Omfattende studier har blitt utført på UGT1A7 genvarianter. Med sin lave kreftfremkallende metabolizing aktivitet, er UGT1A7 genet en risikofaktor for leverkreft (HCC) utvikling i, kinesisk (OR = 3,06) [31], fransk (OR = 3,4) [32], japansk (OR = 2,33) [33 ], og koreanere (OR = 1,45) [34]. I tillegg UGT1A4 * 2 og UGT1A4 * 3 ble også ansett som en risikofaktor for HCC i en allel forening studie [21].
Den katalytiske effektivitet av UGT1A8 * 3 (C277Y) og UGT1A9 * 3 (M33T ) allozyme mot mykofenolsyre ble drastisk redusert [29]. Allel variasjon i en av de mange UGT loci kan fører til betydelige biokjemiske forandringer i metaboliserende potensial. Disse UGT-enzymer er kjent for å nedbrytes kreftfremkallende; manglende funksjon kan spille en viktig rolle i etiologien av et kreftfremkallende episode som tykktarmskreft.
For å oppnå en bedre forståelse av hvilken rolle UGT1A i mage-tarmkanalen, hadde denne studien fokusert på UGT1A8 i mage-tarmkanalen. Basert på tidligere rapporter [35], gjenkjente vi endringer i uttrykk og funksjon av UGT1A8 kan være en risikofaktor for tykktarmskreft. I denne studien ble polymorfe uttrykk for UGT1A gener undersøkt. Vi testet genotype av UGTlA8 hos pasienter med tykktarmskreft og utforsket forholdet mellom polymorfisme av UGTlA8 gener og tykktarmskreft.
Materialer og metoder
2,1 klinisk materiale
(1) tykktarmskreft gruppe, 150 pasienter (90 kvinner og 60 menn, gjennomsnittsalder 56,8 ± 11,3 år) ble vist i vår generell kirurgi avdeling, Qilu Hospital, Shandong University, Shandong-provinsen, Kina. Disse pasientene ble valgt i henhold til standarden på Amsterdam II [36], utelukker arvelig nonpolyposis tykktarmskreft (HNPCC) og familiær adenomatøs polypose (FAP). Kvalifikasjon ble bestemt hvis primærdiagnose skjedde opptil seks måneder før studie påmelding, med endelig diagnose bekreftet gjennom Pathology avdeling.
Ingen av pasientene fikk kjemoterapi, strålebehandling eller biotherapy før prøvene samlingen. 120 normale personer (48 kvinner og 72 menn, gjennomsnittsalder 57,2 ± 11,9 år) ble vist fra Institutt for Intervensjons Gastroenterology i Qilu Hospital, Shandong University. 72 normale lever vevsprøver fra frivillige (30 kvinner og 42 menn, gjennomsnittsalder 56,5 ± 10,2 år) ble innhentet gjennom Department of General Surgery, Qilu Hospital of Shandong University. Serie markører for serum hepatitt virus var negative i disse 72 fagene. Ti personer ble henvist til lever hemangiomer og fjorten ble henvist til lever cyste. Gjennomgang av pasientjournaler i alle nevnte fagene viste fravær av kroniske rusmiddel ta atferd, samt fravær av røyking og alkoholmisbruk. Tilleggsprøvenormaliseringstiltak, inkludert røykeslutt 6 måneder før vevsprøve innsamling og faste i minst 12 timer før kirurgiske prosedyrer og samling vev.
(2) 327 pasienter (123 kvinner og 204 menn , gjennomsnittsalder 56,4 ± 11,0 år) med kolorektal kreft ble vist i Institutt for generell kirurgi og Department of Gastroenterology, Qilu Hospital, Shandong University. Disse pasientene ble valgt basert på standarder for Amsterdam II kriterier som før [36]. I kontrollgruppen var det 327 kjønns matchet frivillige (gjennomsnittsalder 54,2 ± 10,3 år). I gjennomsnitt, frivillige var to år yngre enn pasienter med kolorektal kreft (p 0,05). Alle fag var Han-folk som kommer fra fellesområdet i Shandong-provinsen i Kina, uten consanguinous forholdet. Spørreskjemaer ble administrert av spesialtrente sykepleiere å studere fag i-person. Spørreskjemaet samlet informasjon om livsstilsfaktorer som fysisk aktivitet; alkohol og tobakk bruk; medisinsk, familie og arbeid historie; og anvendelse av over-the-counter medisiner. I tillegg, for å bevare epidemiologiske arkiver og vurdere individuell eksponering for kosttilskudd kreftfremkallende, ble detaljert spørreskjema som brukes til å måle gjennomsnittlig inntak ett år før diagnosen tykktarmskreft, eller ett år før datoen for valget for kontroller. Det var ingen andre signifikante forskjeller (for eksempel, etter alder, familiehistorie med tykktarmskreft, røykestatus totale kjøttinntaket, utdanningsnivå og inntekt) mellom individer som har gitt blodprøve og befolkningen generelt. Informert samtykke ble innhentet, og studien ble godkjent av etisk komité i Shandong University.
2.2 Vevsprøver og reagenser
(1) I tykktarmskreft gruppe, 150 par prøver (1 cm × 1 cm x 1 cm) ble høstet ved drifts kirurger fra 150 pasienter med kolorektal kreft ved delvis colectomy. Prøvene ble så avkjølt i 0 ° C saltoppløsning. Hvert par av Utvalget besto av ondartet vev og omkringliggende friskt vev. Friskt vev ble høstet i en avstand på mer enn 5 cm fra reseksjon margin av tykk- og endetarmskreft. 120 sunne kolon slimhinneprøver fra kontrollgruppen ble høstet gjennom elektrisk enteroscope. Makroskopisk undersøkelse av sunn slimhinnen fra studiegruppen og kontrollpersoner viste ingen tegn til forringelse som nekrose. Mikroskopisk undersøkelse med lysmikroskop dokumentert normal histologi. Vev var fri for tumor og ingen påviselig samtidig sykdom så som kolitt, dysplasi. Colonic slimhinnene ble dissekert og få vevsprøver uten kolon muskularis og de fleste av submucosa. Dette er tillatt for en direkte sammenligning med den hepatiske epitel ved å minimalisere tilstedeværelsen av nonepithelial celletyper. 72 lever vevsprøver av frivillige ble innhentet gjennom laparoscope i en avstand på mer enn 5 cm fra kanten av kirurgisk ablasjon. Prøvene ble valgt for fraværet av histologisk synlig sykdom, slik som hepatitt og levercirrhose å minimalisere prøve skjevhet. Etter å ha blitt innkapslet i tinnfoliehylster og merket ble alle vevsprøver skylles i kaldt 0,9% NaCl, og umiddelbart frosset i flytende nitrogen i løpet av 10 minutter etter kirurgisk fjerning og ble kontinuerlig lagret ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
reverstranskriptase MMLV ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. TaqDNA polymerase ble kjøpt fra Shanghai Shengong Co reagenser som trengs i reaksjonssystemer av omvendt transkripsjon (RT) og polymerase Chain Reaction (PCR) ble gitt av Kreft Immunityand genteknologi Nøkkel Laboratories. UGTlA kit ble kjøpt fra Gentest Corp.
(2) 5 ml perifere venøse fullblodprøver ble samlet inn fra 327 av pasienter med kolorektal kreft og 327 saker fra friske voksne. Begge gruppene ble fastet i minst 12 timer før prøvetakingen. Syresitratdekstrose (ACD) ble anvendt for å hindre at blodet koagulerer inntil analyse. Reagenser av erytrocytt lysat, leukocytter lysat, protein nedbør og DNA hydrering ble gitt fra Medical Genetics Institute of Medical College i Shandong University. Reagenser som trengs i reaksjonssystemer av RT-PCR og TaqDNA endonuklease ble kjøpt fra Promega CO. PCR produktene gelatin henting kit ble kjøpt fra BioTek CO. Alle andre reagenser ble hentet fra kommersielle kilder og analytisk kvalitet.
2,3 Detection av UGTlA mRNA-ekspresjon i forskjellige vev
nærværet av UGT1A transkripter i total RNA vev ble analysert ved hjelp av PCR-amplifikasjon, utført som en dobbeltsidig RT-PCR ko-amplifisering med β-actin-cDNA som en kontroll. RT-PCR deteksjon av alle transkripter UGT1A predikert av det humane locus UGT1A ble utført ved anvendelse av ekson 1 spesifikk sense primere og antisens primere, som ligger innenfor exoner 2-5 eller innenfor et felles parti av 3’end av de første eksoner. Alle primere ble biosynthesized fra Shenggong CO., Shanghai, etter henting i genomisk laboratorium, som vist i tabell S1.
RNA isolering ble fremstilt i henhold til Guanidinium isothiocyanate metoder. Omtrent 200 mg av frosne vev ble pulverisert i en morter fylt med flytende nitrogen. Tissue pulver ble umiddelbart lysert i sure fenol-guanidinium isotiocyanat løsning. UGT1A cDNA ble co-synthesizd med β-actin cDNA i Eppendorf rør som inneholder en mikrogram RNA, 1 ul MMLV, 7 mL RT-PCR system, 1 μ1 nedstrøms primere .UGT1A cDNA ble co-forsterket med β-actin cDNA i en startvolum av 98 mikroliter inneholder 20 mL reversere transkripsjonsprodukter, 19 mL PCR system, 1 mL oppstrøms primere, 58 mL ultra-rent vann. Etter inkubering ved 94 ° C i 3 minutter, ble PCR-syklus startet ved tilsetning av 2 ul TaqDNA polymerase etterfulgt av sentrifugere. Totalt trettifem sykluser ble utført. Hver PCR-syklus består av amplifikasjonsreaksjoner ved 94 i 1 minutt, 58 ° C i 1 min, og 72 ° C i 1 minutt, etterfulgt av forlengelsesreaksjoner med utvidet forlengelse tid av 7 minutter ved 72 ° C. Analytisk agarosegel-elektroforese ble utført for å identifisere PCR-produkter. Kodak Gelatin Analysis System ble anvendt for å vurdere ekspresjon intensiteten av UGT1A og UGT1A isoformer i henhold til følgende formel:
Eksperimenter ble utført med flere nivåer av kontroller, inkludert kontrollene uten cDNA, primere eller termofile polymerase. Spesifisitet av denne analysen ble bestemt ved PCR ved anvendelse av alle primerpar på hver klonet templat cDNA for å utelukke kryssreaktivitet. For å bekrefte påvisning av spesifikke UGT1A cDNA ved anvendelse av denne analyse, PCR-produktene ble delvis sekvensert for å dokumentere identiteten til disse spesifikke genprodukter.
2,4-DNA isolert fra fullblodprøver
300 ul blodprøver ble tilført i 1,5 ml Eppendorf-rør. 900 ul av erytrocytt-lysat ble tilsatt til prøven. Fordøyelsen ble tillatt i 10 minutter ved romtemperatur. Prøven ble deretter sentrifugert ved 12 000 g i 20 sekunder, og den klare supernatantene ble fjernet. 50 ul av erytrocytt-lysat og 300 ul av leukocytt-lysat ble tilsatt for å resuspendere pelleten, etterfulgt av 30 minutter av fordøyelse ved romtemperatur. Protein ble utfelt ved tilsetning av 100 ul proteinutfelling og prøven ble så sentrifugert ved 12.000 g i 20 sekunder. Supernatanten ble overført til et nytt 1,5 ml Eppendorf-rør, etterfulgt av langsom drypping med dobbel-volumed forhånd avkjølt dehydratisert etanol. Prøven ble vinglet litt før DNA nedbør. Prøven ble deretter sentrifugering ved 9000 g i 1 minutt, og det klare supernatantene ble fjernet. 500 ul av 75% etanol ble tilsatt til bunnfallet, etterfulgt av sentrifugering ved 9000 g i 1 minutt, Supernatantene ble fjernet og DNA-utfellingen ble tillatt å lufttørke. DNA hydrering ble tilsatt for å rehydrere DNA og fortynnet DNA-oppløsningen til en konsentrasjon på 20 mg /l for videre bruk, etter kvantifisering av DNA ved hjelp av ultrafiolett spektrofotometer. DNA ble rehydrert med rent vann til en konsentrasjon på 20 mg /l. Konsentrasjonen ble verifisert med ultrafiolett spektrofotometer før videre bruk.
2,5 Amplifisering av UGT1A8 ekson-en ved hjelp av PCR
Exon-1, som ligger i 5′-ende av human UGT1A8, presenterer enkelte variasjon i sin regulering. Primerne ble utformet basert på rekke UGT1A genet locus (tiltredelse antall AF297093). Forward primer (prlA8F, bases34175-34198): 5′-TGG GGT CAG GTT TTG TGC CTG TAG-3 «, revers primer (prlA8F, baser 35175-35208): 5»-GAA ATT GTC AAA TCA CAA TTC AGT AAG GAA TCT -3 «. Reaksjonsbetingelsene ble justert til 4 pl 5 × PCR reaksjon, 4 pl 5 × dNTP, 0,5 mL av forover primer, 0,5 mL av revers primer, 5 mL av Taq DNA endonuklease, 2 mL av DNA mal, og supplerende optisk volum sterilt tre ganger destillert vann, noe som gjorde et totalt volum på 100 ul. 35 amplifikasjonssykluser Reaksjonen ble utført. Hver syklus besto av denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing reaksjon ved 57 ° C i 30 sekunder, og forlengelse ved 72 ° C i 30 sekunder. Hele syklusen ble innledet av en 3 minutter inkubering av reaksjonsblandingen ved 95 ° C og etterfulgt av 10 minutters forlengelse ved 72 ° C. Identitet av PCR-produktene ble bekreftet med gel electrophrosis.
2,6 Purication og sekvensering av PCR-produkter
PCR-produktene ble farget med etidiumbromid i 15 minutter, og isolert med 20 g /l agarosegel ved en spenning på 120 V i en time. De amplifiserte DNA-bånd ble skåret ut under ultrafiolett lampe ved 320 nm og plassert i 1,5 ml Eppendorf-rør. Firedoblet volum av bindingsbuffer ble tilsatt til de DNA-stropper. Etter inkubasjon med vannbad ved 65 ° C i 7 minutter, ble blandingen overført til kolonnene og sentrifugert ved 12000 g i 1 minutt. 300 ul av bindingsbuffer ble brukt til å rense kolonnen etter uttømming av løsningen. Ytterligere 750 pl av DNA vaskebuffer ble tilsatt til prøven, og sentrifugeringen ble gjentatt ved 10.000 g i 1 minutt. Den blandede oppløsning ble sentrifugert ved 12000 g i 1 minutt før kassering av supernatantene. Etter fjerning av supernatanten, ble prøver overført fra 1,5 ml Eppendorf-rør inn i kolonnen. Deretter ble 30 pl av DNA-vann-buffer tilsatt til kolonnen, blandingen ble deretter sentrifugert ved 12000 g i 1 minutt. Oppløsningen ble oppsamlet for kvantifisering og videre analyse. De innsamlede DNA-fragmenter av ulike genotyper ble overført til TOPO TA plasmid DNA prøver ble sekvensert i medisinsk genetikk Institute of Medical College of Shandong University med en helautomatisk sequencer (Prism 377, ABI CO., USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Denne studien brukte de samme kvalitetskontroll tiltak beskrevet av Lesley M. Butler, et al. [37]. For det første, positive og negative kontroller ble inkludert i hver PCR og Taqman eksperiment. Homozygot vill-type, heterozygot, og homozygote varianter for hver UGT1A8 genotype fra genomiske DNA-prøver av UGT1A8 genotype ble inkludert. For det andre ble gjentatte analyser gjennomført på tre tilfeldig utvalgte prøver fra hvert forsøk, og det var 100% enighet. For det tredje, ble ytterligere tre tilfeldig valgte prøver bekreftet ved direkte DNA-sekvensering. Til slutt ble laboratoriepersonell blindet til saken status av prøvene.
2.7 Statistisk analyse
Programvarepakken fra SPSS11.0 ble brukt til å analysere data i denne studien. Kvantitative data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (χ ± s). Sammenligninger mellom hjelp av to grupper av prøvene ble gjort med Student
t
-test, mens flere gruppe midler ble analysert ved ANOVA. Resultater fra case-control studier ble analysert ved hjelp av tosidige Fishers eksakte test for å bestemme fordelingen forskjell på flere alleler mellom saker og kontroller. Justerte ORS og 95% CI’er for tykktarmskreft ble beregnet ved hjelp av logistiske regresjonsmodeller. Konfigurasjons av 95% ble brukt mindre annet er oppgitt. Justerte Ors og 95% CI’er ble brukt for å evaluere effektene av UGT1A8 alleler, genotype og kjønn på resistens i tykk- og endetarmskreft. En p-verdi på 0,05 eller mindre ble definert som statistisk signifikant.
Resultater
3.1 Variasjon av uttrykk for UGT lA mRNA
Alle menneskelige UGT1A genet transkripsjoner vise et unikt 5 «terminus karakteristisk for hver av individets transferase og en felles tre-del er kodet av eksonene 2-5. 3»-regionen er identisk i alle medlemmer kodet av UGT1A lokuset, og kan derfor utnyttes til å analysere generelle UGT1A uttrykk. Ko-amplifisering av det 487-bp UGT1A og 317-bp humane β-aktin PCR-produkter, separert på en 2% agarosegel og farget med etidiumbromid, er demonstrert ved bruk av cancervev, dets omkringliggende friskt vev, normale colonic vev fra kontrollpasienter og levervevet. Bredde og intensitet av β-aktin (317-bp) i paneler var konsistente som forventet. Bredden og intensiteten av UGT1A mRNA (487 bp) var mye mer variabel. Kvantifisering av DRT-PCR produktene ble oppnådd ved å beregne relativ koeffisient ved hjelp av Kodak Gelatin Analysis System. Men kvantifisering viste signifikante forskjeller i steady state-nivåer mellom tre extrahepatic kilde og levervevet.
I pasienter med kolorektal kreft, UGTlA mRNA uttrykk ble betydelig redusert i patologisk vev sammenlignet med de omkringliggende friskt vev høstet sammen. UGT1A mRNA ekspresjon i friskt vev høstet fra pasienter med kolorektal kreft var signifikant lavere enn friske tarmvev høstet fra normal kontroll. Det høyeste nivået av UGT1A mRNA uttrykk ble påvist i levervevet, som var betydelig høyere enn normalt colonic vev fra friske kontrollpersoner (P 0,01), (Table.1). Kolon UGTlA genekspresjon ble preget av betydelig individuell variasjon, mens lever UGTlA mRNA uttrykk var mer ensartet.
3,2 Polymorphic uttrykk for UGT1A isoformer i ulike vev
Analyse av UGT1A genekspresjon var utføres på mRNA-nivå ved anvendelse av UGT1A exon 1-spesifikke DRT-PCR. Som rapportert tidligere, er menneskelig lever og colonic vev preget av en unik og vev-spesifikk differensial uttrykk for UGT1A locus [11], [12]. Produkter av exon 1 spesifikke DRT-PCR påviser spesifikt transkripsjoner av alle kjente UGT1A isoformer. DNA-stropper ble separert i 2% agarose og farget med etidiumbromid (figur 1). Av de UGT1A familie isoformene analysert, ble UGT1A5 og 1A7 mRNA ikke påvist i alle vevsprøver, og antall prøver uttrykt UGT1A isoformer var forskjellig i ulike vev. Analyse av 150 forskjellige UGT1A transkripsjoner av kreftvevet viste følgende: UGT1A1, 1A8 og 1A10 mRNA ble uttrykt i 102 prøver (Fig.1.a). UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6, 1A8, 1A9 og 1A10 mRNA ble uttrykt i 54 prøver (Fig.1.b). UGTlAl, 1A3, 1A6, 1A8 og 1A10 mRNA ble uttrykt i 66 prøver (Fig.1.c). UGTlA3, 1A4, 1A8, 1A9 og 1A10 mRNA ble uttrykt i 108 prøver (Fig.1.d). Den polymorfe uttrykk for UGTlA isoformer i ulike vev ble vist i table.2 og fig.2. I motsetning til kreft vev, ble UGTlA8 og UGTlAl0 mRNA uttrykkes ikke i 72 forskjellige lever vevsprøver. Det var liten variasjon i mengden av UGTlA isoformer transkripter når hver ble sammenlignet med p-aktin ekspresjonsnivåer. UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6 og 1A9 mRNA nivåene var forskjellig nedregulert i kreftvevet i forhold til omkringliggende normal slimhinne (P 0,01), men UGTlA8 og UGTlAl0 mRNA nivåene var oppregulert (P 0,01).
AT: Tykktarms kreft vev; N: Rundt sunn slimhinne; M: Marker
A.PCR produkter av UGTlA8 ekson-en (1 033 bp). 1,2,3: PCR-produkter av UGTlA8; M: Marker. B.Sequenced resultatene av uGTlA8 alleler. a: UGTlA8 * 1, b: UGTlA8 * 2; c: UGTlA8 * 3
Disse data viser at UGT1A locus er uttrykt i fordøyelsessystem.. Dataene også oppmerksom polymorfe regulering og individuell variasjon av UGTl Et gen locus på RNA transkript. I tillegg identifisering av vev-spesifikk ekspresjon av UGT1A8 innebærer at de regulatoriske mekanismer kan være en indikasjon på den evolusjonære utvikling og biologisk grunnlag å bestemme individuelle variasjoner i kreftrisiko.
3.3 Identifikasjon av matrise DNA hentet fra fullblodprøver
SeqMan av DNASTAR Programvare for Molecular Biology ble brukt til å analysere sekvenser av PCR produktene. Oppdages sekvenser ble sammenlignet med pre-spesifiserte standardiserte kriterier av Human Genome Project [HGP] for å bestemme områder av SNP og hyppigheten av alleler, etter samlet analyse av sekvensert resultater og ulike unntakene av ghost topper og dårlige sektorer. Befolknings distribusjon av alleler møtte Hardy-Weinberg likevekt av χ2 test (frihetsgrader = antall alleler-1). Lengden av PCR-produktene ble 1,033bp (Fig.2.A). Sekvensert resultatene av renset PCR-produkt indikerte at det var tre SNP’er ved basepar 518 (CG), basepar 765 (AG), og basepar 830 (GA) innenfor den kodende regionen av UGT1A8 ekson-1 (Fig.2.B, tabell S2) sikret mutasjon ved nukleotid 518 fører til missense mutasjon ved kodon 173, som et resultat, er alanin erstattet med glycin. Mutasjonen ved nukleotid 830 resulterer i substitusjon av tyrosin for cystein blir kodet av kodon 277. mutasjon ved nukleotid 765 er taus mutasjon. De funksjonelle polymorfismer er vist i Tabell S2. For de fleste av prøvene med en heterozygot mutasjon, bare en enkelt mutasjon var tilstede, indikerer de tre punktmutasjoner er ikke knyttet (tabell S2, S3). For å forbedre nøyaktigheten, ble de innsamlede DNA-fragmenter av ulike genotyper overført til TOPO TA kloning plasmider. Flere kloner fra hver DNA-prøve ble karakterisert ved hjelp av DNA-sekvensanalyse. I alle tilfeller, mutasjonsmønstre matchet identiteten lene som er skissert i tabell S2 og Table.S3. Genotype av prøver kan verifiseres ved hjelp av TOPO kloning av DNA-fragmenter, i dette tilfelle UGTlA8 * 2 og * 3 UGTlA8 alleler ble identifisert ved hjelp av TOPO kloning.
3.4 Analyse av frekvensen av alleler og genotype av UGT1A8
i kontrollgruppen, allelet hyppigheten av UGTlA8 * 1 (villtype) og UGTlA8 * 1a var dominerende (79%), etterfulgt av 18,8% for UGTlA8 * 2. Identiteten til UGTlA8 * 3 var faktisk sjelden, med bare 2,3% av kontrollene hensyn til for å bære denne genotypen (Table.3, Figure.3). UGTlA8 * la er en stille mutasjon og koder UGTlA8 * l. En homozygot mønster av UGTlA8 * 1 (UGTlA8 * 1 /* 1, UGTlA8 * 1 /* 1a, UGTIA8 * 1a /* 1a) utgjorde om lag 65,21% av normale voksne (Table.4). Det ble funnet at genotypen av UGTlA8 * 1 /* 2 og UGTlA8 * 1a /* 2 var ved en frekvens på 24,64%, genotype UGTlA8 * 1 /* 3 og UGTlA8 * 2 /* 3 var ved en frekvens på 4,35%, UGTlA8 * 2 /* 2 var ved en frekvens på 5,8% i kontrollene. Interessant nok var det ingen homozygot UGTlA8 * 3. I tilfelle av pasienter med kolorektal kreft, allelet hyppigheten av UGTlA8 * 1 og * UGTlA8 1a, UGTlA8 * 2, UGTlA8 * 3 bestående av omtrent 61,5%, 22,0% og 16,5% (Figure.3), respektivt. Den heterozygot ekspresjon av UGTlA8 * 1 /UGTlA8 * 2, består av de med en genotype av UGTlA8 * 1 /UGTlA8 * 2 og * UGTlA8 1a /* 2, ble ved en frekvens på omtrent 18,84%. 28.98% av personer med tykktarmskreft uttrykt UGTlA8 * 1 /* 3 og UGTlA8 * 2 /* 3. Homozygot genotype av UGT1A8 (UGTlA8 * 1 /UGTlA8 * 1, * 2 UGTlA8 /UGTlA8 * 2) bestående av 46,38%, 4,35% av kreft tilfellene, respektivt. Ett tilfelle av homozygot UGT1A8 * 3 også bemerket (Table.3). Det var statistisk signifikante forskjeller i allelfrekvenser og genotyper mellom studiegruppen og kontrollgruppen. Villtype-allelet (UGTlA8 * 1) frekvensen var lavere blant studiegruppen enn kontrollgruppen [P = 0.000, OR = 0,45, CI (0,28 til 0,79)]. Det samme betydning kan være merket med genotype UGTlA8 * 1 /* l [P = 0.000, OR = 0,28, CI (0,19 til 0,41)] og UGTlA8 * 2 /* 3 [P = 0.000, OR = 10,58, CI (4.48- 24.98)] (Table.4 og fig.4). De motsatte resultater ble notert i allel UGTlA8 * 3 [P = 0.000, OR = 6,99, CI (3,39 til 14,42)] (Table.3 og fig.4) og genotype UGTlA8 * 1 /* 3 [P = 0.000, OR =
