Abstract
Mål
For å finne ut om tettheten av foxp3
+ lymfocytter i primærsvulster og lymfeknuter i bukspyttkjertelkreft korrelerer med tilstedeværelsen av lymfeknutemetastaser.
Methods
foxp3
+ lymfocytter tetthet i primær kreft i bukspyttkjertelen vev og drenerende lymfeknuter ble målt under anvendelse av immunhistokjemi. Vi analyserte de kliniske og patologiske aspekter forbundet med opphopning av foxp3
+ lymfocytter i bukspyttkjertelkreft. Vi analyserte også korrelasjonen av tettheten av foxp3
+ lymfocytter i lymfeknuter med knutepunkt-status og avstand fra den primære svulsten.
Resultater
foxp3
+ lymfocytter tetthet i bukspyttkjertelen kreft var betydelig høyere enn i paratumoral bukspyttkjertelen vev. Tettheten av foxp3
+ lymfocytter i lokal svulstvev korrelerte signifikant med histologisk grad og generell lymfeknutestatus. Videre foxp3
+ lymfocytter tetthet var betydelig høyere i positive lymfeknuter enn negative, mens det hadde ingen sammenheng med avstanden til lymfeknute fra den primære svulsten.
Konklusjon
foxp3
+ lymfocytter tetthet i grunnskolen svulstvev hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen korrelerer med lymfeknutemetastase. Lymfeknuter som inneholder metastaser med høyere foxp3
+ lymfocytter tettheter enn gjør negative lymfeknuter
Citation. Jiang Y, Du Z, Yang F, Di Y, Li J, Zhou Z, et al. (2014) foxp3
+ lymfocytter Tetthet i bukspyttkjertelen korrelerer med lymfeknutemetastase. PLoS ONE ni (9): e106741. doi: 10,1371 /journal.pone.0106741
Redaktør: Valli De Re, Centro di riferimento Oncologico, IRCCS National Cancer Institute, Italia
mottatt: 25 november 2013; Godkjent: 09.08.2014; Publisert: 05.09.2014
Copyright: © 2014 Jiang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Shanghai Municipal Natural Science Foundation (11ZR1405500) og tilskudd fra Shanghai Science and Technology Commission (13140902401). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
bukspyttkjertel~~POS=TRUNC duktalt adenokarsinom, kjent som kreft i bukspyttkjertelen, er blant de mest aggressive av menneskelige kreftformer. Radikal kirurgisk fjerning av lokalisert sykdom gir en liten sjanse for kur; men det er imidlertid sjelden indikert fordi store vaskulær invasjon og /eller fjernmetastaser blir ofte oppdaget ved diagnose. Selv når kirurgisk fjerning er mulig, metastaser og tilbakefall er spesielt fremtredende i bukspyttkjertelkreft [1].
Mye av den tradisjonelle fokus for kreftforskning har involvert studere genotypiske og fenotypiske endringer som ligger til grunn for utviklingen av kreft, progresjon, og metastasering. I motsetning til disse celle-autonome aspekter av solide svulster, er aktuelle studier belyse andre kritiske elementer av svulsten mikromiljøet [2]. Basert på slike studier, er det blitt klart at immunceller og deres tilknyttede cytokiner er viktige komponenter i svulsten mikromiljøet for kreft i bukspyttkjertelen [3]. Regulatoriske T-celler (treg), som opprinnelig ble definert i sammenheng med autoimmune sykdommer, og er kjent for å undertrykke T-celleformidlet immunresponser, er nå antatt å spille en avgjørende rolle i å forhindre immunovervåkning mot kreft og hindrer utvikling av effektive antitumor immunitet. Det ble rapportert at Treg økte i perifert blod, svulstens mikromiljø og ascites i forskjellige maligniteter og ser ut til å påvirke flere aspekter av anti-tumor immunitet [4] -. [7]
I bukspyttkjertelen kreftpasienter, det er godt dokumentert at forekomsten av treg både i perifert blod og kreft microenvironments er forhøyet, og at treg infiltrasjon korrelerer direkte med svulst patologisk stadium og prognose [8] – [12]. Vi har nylig bekreftet at kreft i bukspyttkjertelen er infiltrert av foxp3
+ antatte treg, og dette fungerte som en potensiell forklaring på den dårlige overlevelsen av pasienter til tross for den høye forekomsten av CD8
+ T-celler [13]. I den studien, har vi også brukt flowcytometri for å bekrefte at foxp3
+ celler var også CD3
+ CD4
+ CD25
+ CD127
-, og dermed styrke forslaget om at foxp3 kan tjene som en nyttig markør for treg i bukspyttkjertelkreft
tilstedeværelse eller fravær av lymfeknutemetastaser er den sterkeste prediktor for utfall etter kirurgisk reseksjon av kreft i bukspyttkjertelen.; Men lite er kjent om forholdet mellom Treg infiltrasjon av kreft i bukspyttkjertelen og lymfeknutemetastase. Derfor testet vi hypotesen om at forhøyede nivåer av foxp3 farging i primærsvulster og regionale lymfeknuter ville forutsi tilstedeværelsen av lymfeknutemetastaser i bukspyttkjertelkreft.
Pasienter og metoder
Pasienter
i denne studien har vi samlet de kliniske og patologiske data fra 50 pasienter som gjennomgikk radikal reseksjon for duktalt adenokarsinom i bukspyttkjertelen hodet mellom april 2005 og desember 2008 på Huashan Hospital, Fudan University. Pasienter med en historie med autoimmun sykdom og kronisk /akutt infeksjon, og de som hadde fått strålebehandling eller cellegift før deres drift ble ekskludert. Nomenklaturen av de hentede lymfeknuter og patologisk staging var basert på
Andre engelske utgaven av Klassifisering av bukspyttkjertelen karsinom
foreslått av den japanske bukspyttkjertelen Society (JPS) [14]. De drenerende lymfeknuter fra de første, andre og tredje grupper er referert til N1, N2 og N3, respektivt. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai, Kina (NO. 2.012.215). Pasientjournaler ble anonymisert og avidentifisert før analysen.
Immunohistochemistry
Vi gjennomgikk hematoksylin-eosin-farget deler av bukspyttkjertelen tumor og paratumoral (tilstøtende ikke-neoplastisk bukspyttkjertelen parenchyma) vev, og samplede lymfeknuter, fra pasienter med histologisk bekreftet pancreatic ductal adenokarsinom. De tilsvarende formalinfikserte, parafininnstøpte vev ble oppsamlet, og 5 um tykke seksjoner ble fremstilt. Immunhistokjemisk farging av foxp3 ble utført ved å bruke avidin-biotin kompleks pepperrot-peroksidase-metoden. I korthet, parafinsnitt ble først deparaffinized og hydrert, og deretter underkastet en varmeinduserte antigen gjenfinning trinn (EDTA ved pH 7,8). Endogen peroksidase aktivitet ble blokkert, og lysbildene inkubert i 0,3% H
2o
2. De uspesifikke bindingsseter ble blokkert med Protein Block (RE7102, Novocastra). Platene ble deretter inkubert med primære monoklonale antistoffer mot foxp3 protein (klone ab10563, 1:50; Abcam). De bundne sekundære antistoffer ble visualisert med diaminobenzidin (Dako) og kontra med Harris hematoxylin. Negativ kontroll farging ble utført med den primære antistoff utelatt.
foxp3
+ lymfocytter opplisting
Hver seksjon ble vurdert uavhengig av to patologer (Du ZG, Zhou ZW) som ble blindet av pasientenes kliniske og patologiske profiler. Celler positive for foxp3 ble talt opp i fem tilfeldig utvalgte områder under høy forstørrelse (× 400) (Olympus, Japan) og uttrykt som gjennomsnittlig antall positive celler per høy effekt felt (/HP). Uoverensstemmelser mellom de to patologer ble anmeldt i fellesskap å komme fram til en enighet.
Dataanalyse
Kontinuerlige variabler er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD), og kategoriske variabler er uttrykt som frekvenser (% ). Pearson χ
2 og flere logistikk regresjoner ble brukt for univariate og multivariate analysen. Total overlevelse ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden. The Log-rank test og Cox-modeller ble brukt for univariate og multivariate analyser av risikofaktorer for overlevelse, henholdsvis. Alle p-verdier og 95% konfidensintervall [CI] ble estimert i en to-tailed mote. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant ved P 0,05. Data ble analysert ved hjelp av SAS versjon 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).
Resultater
Generelle data
Vi identifiserte 50 pasienter (29 menn og 21 kvinner, median alder 61 år, range. 20-79 år) med adenokarsinom i bukspyttkjertelen hodet som gjennomgikk pancreaticoduodenectomy (n = 48) eller total pancreatectomy (n = 2). I tillegg til primærsvulster, vi analysert totalt 157 lymfeknuter, med 70 lymfeknuter fra N1 (inkludert 24 positive og 46 negative lymfeknuter fra bakre og fremre deler av hodet i bukspyttkjertelen), 46 lymfeknuter fra N2 ( inkludert 11 positive og 35 negative lymfeknuter fra områdene rundt den store mesenteriske arterie eller hepatoduodenal ligament), og 41 lymfeknuter fra N3 (inkludert 3 positive og 38 negative lymfeknuter fra området som omgir den abdominale aorta).
Tetthet av foxp3
+ lymfocytter i svulsten og paratumoral bukspyttkjertelen vev
i samsvar med tidligere rapporter, foxp3
+ lymfocytter infiltrert de primære svulster, og ble funnet spredt utover interstitiell områder av svulsten ( Figur 1A B). Noen foxp3
+ lymfocytter ble observert infiltrerer pankreasvevet paratumoral (figur 1C 0,001, figur 1E).
Immunhistokjemisk farging av foxp3
+ lymfocytter i bukspyttkjertelkreft (A: lav forstørrelse, × 100; B: høy forstørrelse, × 400) og paratumoral bukspyttkjertelen vev (C: lav forstørrelse, × 100; D: høy forstørrelse, × 400): den foxp3
+ lymfocytter ble definert som cellene med brun-flekker kjerner i mononukleære lymfocytter. (E) Forskjeller i foxp3
+ lymfocytter tetthet mellom kreft i bukspyttkjertelen vev og paratumoral bukspyttkjertelen vev. (P 0,01).
foxp3
+ lymfocytter tetthet ikke korrelerer med alder, kjønn eller T scenen (inkludert tumorstørrelse og lokal infiltrasjon) av kreft i bukspyttkjertelen (tabell 1). Tettheten av foxp3
+ lymfocytter var høyere i svulster med høyere histologisk grad (godt differensiert: 1.3 ± 1.0 /HP; vs. moderat differensiert: 4.3 ± 4.5 /HP vs. dårlig /udifferensiert: 7.9 ± 7.8 /HP, p = 0,014). Tettheten av foxp3
+ lymfocytter var signifikant høyere i bukspyttkjertel kreft med lymfeknutemetastase sammenliknet med de uten lymfeknutemetastaser (6,7 ± 5,9 /HP vs. 2,3 ± 2,6 /HP, p = 0,002). Tilsvarende var det en trend mot høyere tetthet av foxp3
+ lymfocytter i avansert stadium bukspyttkjertelkreft enn tidlig stadium sykdommen. (I, II: 2,7 ± 3,1 vs. III, IV: 5,5 ± 5,6, p = 0,094).
Tetthet av foxp3
+ lymfocytter i drenering lymfeknuter
foxp3
+ lymfocytter som akkumulert i positive lymfeknuter, først og fremst rundt den metastaser, ved en tetthet vesentlig høyere enn det som ble observert i de negative lymfeknutene (66,2 ± 36,9 /HP vs. 48,1 ± 29,9 /HP, p = 0,003, figur 2A-E). Ingen signifikant forskjell i tetthet av foxp3
+ lymfocytter ble observert i forskjellige lymfeknuter grupper for positiv (N1 N2 vs vs N3: 63,0 ± 2,7 /HP vs. 69,9 ± 37,0 /HP vs. 78,3 ± 75,2 /HP , p = 0,747, figur 2F) eller negative lymfeknuter (N1 vs. N2 vs N3. 50.4 ± 32.5 /HP vs. 50,0 ± 30,3 /HP vs. 43,4 ± 26,4 /HP, p = 0,516, figur 2G)
Immunhistokjemisk farging av foxp3
+ lymfocytter i en positiv lymfeknute (A: lav forstørrelse, × 40; B, høy forstørrelse, × 400) og en negativ lymfeknute (C: lav forstørrelse, × 40; D: høy forstørrelse x 400), og en sammenligning av den foxp3
+ lymfocytt tettheter i positive og negative lymfeknuter (E) (p = 0,03), mellom ulike grupper i positive lymfeknuter (F) (p = 0,75 ), og mellom ulike grupper i negative lymfeknuter (G) (p = 0,52).
foxp3
+ lymfocytter infiltrasjon av kreft i bukspyttkjertelen svulst er en uavhengig risikofaktor for lymfeknutemetastaser
lymfeknutemetastaser er de viktigste prognostiske indikatorer på resectable kreft i bukspyttkjertelen. Median tettheten av foxp3
+ lymfocytter (4 /HP) i hver tumor ble ansett for å være nivået cutoff og ble analysert i forhold til pasientens alder, kjønn, histologisk karakter og T stadium av tumoren for å identifisere risiko faktorer av lymfeknutemetastaser i bukspyttkjertelkreft. Univariate og multivariate analyser bekreftet at høy intratumoral tetthet av foxp3
+ lymfocytter er en uavhengig risikofaktor for nodemetastaser (tabell 2).
Den intratumoral tetthet av foxp3
+ lymfocytter tendens til å korrelerer med prognose etter radikal reseksjon
av de 50 pasientene i vår studie som gjennomgikk radikal reseksjon, fikk vi overlevelse status og overlevelse for 47 pasienter gjennom poliklinikk eller telefon oppfølging. Median oppfølgingstid var 21 måneder (4-87 måneder). I univariate analyse, både lymfeknuten status og tettheten av foxp3
+ lymfocytter i tumorene korrelert med prognose av kreft i bukspyttkjertelen pasienter etter reseksjon radikal (som vist i figur 3 og tabell 3). En multivariat analyse som omfatter de to faktorene antydet at foxp3
+ lymfocytter tetthet i tumor holder løftet som en selvstendig prognostisk faktor, men dette var ikke statistisk signifikant (p = 0,06).
lymfeknutestatus ( p = 0,03) (A) og tetthet av foxp3
+ lymfocytter i kreft i bukspyttkjertelen vev (p = 0,01) (B) var signifikant korrelert med prognosen fra bukspyttkjertelen hodet kreft etter radikal reseksjon.
Diskusjoner
i denne studien, vurderte vi fordelingen av foxp3
+ antatte treg i bukspyttkjertelen kreft primære tumorer og drenering lymfeknuter, og bestemt dens korrelasjon med kritiske clinicopathological funksjoner. Som foxp3 er den mest aksepterte enkelt immunhistokjemisk markør for treg og har vist seg å ha noen prognostisk verdi, bekreftet vi at foxp3 akkumulert i kjernen av små, runde mononukleære lymfocytter som var klart atskilt fra tumorceller [10] – [13] . Viktigere, vår studie viste en ny sammenheng mellom tettheten av foxp3
+ lymfocytter i bukspyttkjertelkreft og lymfeknutemetastase. Videre har vi gjort romanen observasjon at foxp3 uttrykket er høyere i lymfeknutene inneholder kreft i bukspyttkjertelen metastaser enn i de som er negative for carcinoma
I samsvar med tidligere studier [10] – [13]., Fant vi at tettheten av foxp3
+ lymfocytter i bukspyttkjertelkreft korrelerte signifikant med histologisk grad av svulsten, uavhengig av pasientens alder, kjønn, tumorstørrelse, eller lokal invasjon. Forskjeller i celle fenotype, chemokine uttrykk, metabolisme, oksidativ status, og pH av svulsten mikromiljøet mellom ulike histologiske grader av kreft i bukspyttkjertelen kan påvirke foxp3
+ lymfocytter tetthet i tumorvev; Men de nøyaktige mekanismene som driver Treg infiltrasjon av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen er ennå ikke klarlagt
lymfeknutemetastaser er helt klart en viktig begivenhet i solid svulster patogenesen, særlig kreft i bukspyttkjertelen [15] -. [18]. Som lymfeknuter er nettstedene til antigen presentasjon og immunrespons innvielse, kan de tjene som tidlig barrierer som hindrer svulst celle inntreden i den systemiske sirkulasjonen [19]. Den lokale mikromiljøet av lymfeknuter er uunnværlig i løpet av påfølgende immunresponser. Imidlertid har tidligere studier ikke vist en sammenheng mellom foxp3 infiltrasjon og knutepunktstatus. Hiraoka et al. [10] har tidligere studert både primær bukspyttkjertelkreftsvulster og lymfeknuter, men avviket mellom våre funn og deres kan skyldes vår telling av totale foxp3
+ celler i stedet for forholdet foxp3
+ til CD4
+ celler. Vi antok at det absolutte antall foxp3
+ antatte treg, kan faktisk være mer relevant for å bestemme effektene på utviklende anti-tumor immunrespons.
I denne studien, analyserte vi 157 lymfeknuter fra 50 pasienter, og fant signifikant høyere tetthet av foxp3
+ lymfocytter i positive lymfeknuter sammenlignet med negative. Mens nivåene av foxp3
+ lymfocytter i lymfeknuter korrelert med tilstedeværelse eller fravær av metastaser, dette ble ikke påvirket uavhengig av avstanden i lymfeknuter fra den primære kreft i bukspyttkjertelen. Deng et al. [20] funnet lignende resultater i kolorektal cancer, men dette har ikke tidligere blitt vist i bukspyttkjertelkreft. Det er i hovedsak to mekanismer for å forklare våre funn. Først immuntoleranse mediert av foxp3
+ lymfocytter kan bidra til overlevelse og spredning av kreftceller som drenerer til lymfeknuter og til slutt danner brennpunkter som er synlig under lysmikroskopi. Alternativt kan tilstedeværelsen av tumorceller i lymfeknutene resultere i foxp3
+ lymfocytter akkumulering gjennom migrering, utvidelse eller perifer omdannelse. Som vist på figurene 2A og 2B, foxp3
+ lymfocytter hovedsakelig akkumuleres i periferien av metastatiske foci. Foxp3
+ lymfocytter opphopning i lymfeknutene kan fremme tumorcelleinfiltrasjon i den systemiske sirkulasjonen og fremskynde utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen gjennom hemming av effektor T-celle funksjon.
Den prognostiske verdien av å måle foxp3
+ T-celler i ulike gastrointestinale kreftformer er fortsatt kontroversielt. I en nylig publisert meta-analyse, ble det vist at tumor-infiltrerende foxp3
+ T celler korrelerte med dårlig prognose i leverkreft og magekreft, men god prognose ved kolorektalkreft [21]. I innstillingen av kreft i bukspyttkjertelen, ble det vist at tumor-infiltrerende foxp3
+ celle tjener som negativ prognostisk faktor [10], [12], [22]. I vår studie, univariat analyse viste at lymfeknute status og lokal tumor foxp3
+ lymfocytter tetthet var prognostiske faktorer for kreft i bukspyttkjertelen hos pasienter etter radikal reseksjon. Ingen forskjell i prognosen stratifisert etter patologisk stadium ble sett i 50-bukspyttkjertelen kreftpasienter. Etter factoring i lymfeknute status og lokal tumor tetthet av foxp3
+ lymfocytter, multivariat analyse indikerte sistnevnte som har bare border statistisk signifikans. I denne pasient sett, den lokale svulsten foxp3
+ lymfocytter tetthet syntes å ha større prognostisk verdi enn selv lymfeknutestatus.
I konklusjonen, vi bekreftet at oppbyggingen av foxp3
+ lymfocytter i primær svulstvev korrelerer med lymfeknutemetastase i bukspyttkjertelkreft. Viktigere, har vi også vist at tilstedeværelsen av foxp3
+ lymfocytter i regionale lymfeknuter er assosiert med nodal metastaser, og at metastatiske lymfeknuter inneholde vesentlig flere foxp3
+ celler enn gjør negative lymfeknuter.
