Abstract
Ikke-småcellet lungekreft er den dominerende typen lungekreft, noe som resulterer i høy dødelighet på verdensbasis. Digoksin, et hjerteglykosid, er nylig blitt foreslått å være en ny kjemoterapeutisk middel. Src er et onkogen som spiller en viktig rolle i progresjon av kreft, og er derfor et potensielt mål for cancerterapi. Her, undersøkte vi hvorvidt digoksin kunne undertrykke lungecancer progresjon gjennom hemming av Src-aktivitet. Effektene av digoksin på lungekreftcellefunksjoner ble undersøkt ved hjelp av koloni dannelse, migrasjon og invasjon analyser. Western blotting og qPCR-analyser ble anvendt for å analysere mRNA og protein uttrykk nivåer av Src og nedstrøms-proteiner, og en celle-levedyktighet analyse ble brukt for å måle cellulær cytotoksisitet effekter. Resultatene av cellefunksjonsanalyser viste at digoksin inhiberte proliferasjon, invasjon, migrering og kolonidannelse av A549 lungekreftceller. Lignende effekter av digoksin ble også observert i andre lungekreftcellelinjer. Videre fant vi at digoksin undertrykte betydelig Src aktivitet og dens protein uttrykk i en dose- og tidsavhengig måte samt redusert EGFR og STAT3 aktivitet. Våre data antyder at digoksin er en potensiell antikreftmiddel som kan undertrykke lungecancer progresjon gjennom inhibering av Src, og aktiviteten av relaterte proteiner
relasjon:. Lin SY, Chang HH, Lai YH, Lin CH, Chen MH, Chang GC, et al. (2015) Digoksin undertrykker Tumor Ondartethet gjennom Hemme Flere SRC-Related signalveier i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 10 (5): e0123305. doi: 10,1371 /journal.pone.0123305
Academic Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES
mottatt: 07.11.2014; Godkjent: 03.03.2015; Publisert: 8. mai 2015
Copyright: © 2015 Lin et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan, ROC (NSC 101-2325-B-005-001, NSC 102-2325-B-005-001, og MEST 103-2314-B-005-001-My3) og Taichung Veterans General Hospital og National Chung-Hsing University (TCVGH -NCHU-1037605), Taiwan. Ytterligere finansiering kom fra Kunnskapsdepartementet, Taiwan, R.O.C. under ATU plan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den dominerende type lungekreft og den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Den lave overlevelsesraten til lungekreftpasienter er på grunn av tumorresistens på adjuvant kjemoterapi og metastase [2]. Metastasen av kreft celler fra primære tumorer er en flertrinns prosess som oppstår gjennom blodkar eller lymfekar. Til dags dato er det ingen effektiv behandling for å hemme eller kontrollere disse metastatiske prosesser.
Oncogene avhengighet bestemmer egnet behandling av kreft med målrettet terapi. NSCLCs har mange driver mutasjoner, inkludert de i EGFR, HER2, KRAS, BRAF, PIK3CA, akt1, MEK1, ROS1, og ALK [3]. Disse driver mutasjoner påvirker tumor følsomhet for kreftbehandlingen. EGFR mutasjoner eksemplifisere den terapeutiske relevans av molekylære klynger. Kliniske og biologiske data utstrekning viser at EGFR mutasjoner kan forutsi effekten av EGFR-hemmere, med responsrate høyere enn 70% og forlenget progresjonsfri overlevelse observert i flere studier [4,5]. Men disse hemmere, f.eks Irresa og Tarceva, er i siste instans begrenset av fremveksten av narkotika-resistente mutasjoner og andre mulige molekylære mekanismer [6,7]. Dermed identifisere nye forbindelser som er rettet mot tumorprogresjon, inkludert vekst og metastasering, er en sak av stor haster i kreftbehandling forskning.
onkogen Src spiller en viktig rolle i kreft progresjon og forårsaker dårlig prognose for pasienter med rekke humane kreftformer [8,9]. Src-aktivering, påvist ved en økning i tyrosin-kinase-aktivitet, er blitt identifisert i en rekke kreftformer, inkludert NSCLC [10,11]. Src medierer mange signalveier avgjørende for styringen av cellen transformasjon og homeostase [12]. I kreftceller, foreningen av Src med unormale reseptortyrosinkinaser øker tyrosin kinase aktivitet av Src, og dermed aktivere pro-overlevelse trasé gjennom PI3K /AKT, den angiogene vei gjennom signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3), spredning veien gjennom MEK /ERK, og invasjon gjennom FAK /paxillin /p130CAS [13]. I tillegg har Src blitt rapportert å interagere med EGFR; disse proteinene phosphorylate hverandre, og mobilnettet Src og EGFR samarbeide i kreft progresjon. For eksempel medierer Src fosforyleringen av EGFR Tyr845 til å regulere overlevelsesreaksjonsveier [14,15]. Mutasjoner i EGFR og dens beslektede familiemedlemmer lede til funksjonelle abnormaliteter og, som et resultat, forbedret Src-aktivering [16]. I tillegg Src-kinase-inhibitorer påvirke nedstrømssignalkaskade av Src og inhibering av EGFR-aktivitet [17]. Prekliniske studier med farmakologiske Src hemmere (dasatinib, saracatinib og bosutinib) har gitt bevis som støtter en rolle for Src som et terapeutisk mål i lungekreft [18,19].
Hjerte glykosider er en stor familie av kjemisk forbindelser som finnes som sekundære metabolitter i en rekke planter og i noen dyr. Digoksin, en av de kjente hjerteglykosider, er blitt godkjent av regulerende myndigheter og er mye brukt i behandlingen av hjertesvikt. Dens kardiale virkninger blir mediert gjennom hemming av Na + /K + ATPase, noe som fører til økte intracellulære kalsiumkonsentrasjon og økte hjertets kontraktilitet [20]. Nylig har flere studier har rapportert at hjerteglykosider selektivt hemme spredning og indusere apoptose og autofagi i kreftceller, men ikke normale celler [21,22]. Disse resultatene også antydet at hjerteglykosidet narkotika kan ha anvendelse i anticancerterapi. Men kreft effekter og molekylære mekanismer av hjerteglykosider i lungekreftceller er fortsatt i stor grad ukjent. I tidligere, upubliserte data, identifiserte vi digoksin fra et lite sett med naturlige forbindelser som en potensiell kandidat for reduksjon av Src-aktivitet ved anvendelse av en ELISA-metode. I denne rapporten har vi videre avslører ny mekanisme av digoksin i begrenser NSCLC malignitet, som kan være gjennom flere Src-baserte signalveier.
Materialer og metoder
Cell kultur og medikamentell behandling
Den menneskelige lunge adenokarsinom cellelinjer, A549 (ATCC CCL-185), H3255 (ATCC CRL-2882), H1975 (ATCC CRL-5908), PC9 og PC9 /GEF [20] ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Celler ble opprettholdt i RPMI 1640 (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (GIBCO BRL), og 1% penicillin og streptomycin (GIBCO BRL). Digoksin ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO, USA.) Og fremstilt ved en konsentrasjon på 100 mM i dimetylsulfoksid (DMSO) som en stamoppløsning. Arbeids løsningen var tilberedes ved fortynning med media til de ønskede konsentrasjoner. Bilen kontrollen var 0,1% DMSO.
Transfeksjon
A549 celler ble sådd i 6 cm retter på 5 × 10
5 celler /tallerken eller i 96 brønner på 5 × 10
3 celler /brønn og transfektert med pEGFP-N3-Src Y527F eller pEGFP-N3 tom vektor (Clontech, Mountair View, CA, USA) ved hjelp Lipofectamine reagens (Invitrogen), i henhold til produsentens protokoll.
Western blot-analyse
Western blot-analyse ble utført som beskrevet tidligere [21]. De primære antistoffer som brukes for Western blot analyser inkludert anti-fosfor-Src (Tyr418) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), anti-fosfor-FAK (Tyr576) (Invitrogen), anti-FAK (Invitrogen), anti-GAPDH ( Invitrogen), anti-fosfor-EGFR (Tyr1068) (Cell Signaling, Beverly, MA, USA), anti-fosfor-STAT3 (Tyr705) (Cell Signaling), anti-fosfor-PI3K (Tyr458) (Cell Signaling), anti- AKT (Cell Signaling), anti-fosfor-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) (Cell Signaling), anti-SAPK /JNK (Cell Signaling), anti-fosfo-Paxillin (Tyr118) (Cell Signaling), anti fosfor-p130Cas (Tyr410) (Cell Signaling), anti-EGFR (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology), anti-PI3K (Santa Cruz Biotechnology), anti-fosfor-MEK1 /2 ( Ser218 /Ser222) (Santa Cruz Biotechnology), anti-MEK (Santa Cruz Biotechnology), anti-fosfor-ERK (Tyr204) (Santa Cruz Biotechnology), anti-ERK2 (Santa Cruz Biotechnology), anti-Paxillin (Santa Cruz Biotechnology) , anti-p130 Cas (Santa Cruz Biotechnology), anti-fosfor-AKT (Ser473) (Millipore, Billerica, MA, USA)
Sanntids revers transkripsjon PCR
Src, EGFR , STAT3, og FAK-mRNA-nivåer ble påvist med SYBR grønn sanntids RT-PCR på en ABI Prisme 7300 sekvensdeteksjonssystem (Applied Biosystems, Foster, CA, USA). TATA-boksen bindende protein (TBP) ble anvendt som en intern kontroll (GenBank X54993). Alle detaljer om empiriske prosedyrer og beregninger har blitt beskrevet tidligere [21]. De følgende primere ble anvendt: Src fremover, 5′-GAGGCCCAGGTCATGAAGAA-3 «; Src omvendt, 5»-CCCTTGAGAAAGTCCAGCAAA-3 «; EGFR fremover, 5»-CTGGCAGCCAGGAACGTACT-3 «; EGFR omvendt, 5»-GCCATCCACTTGATAGGCACTT-3 «; STAT3 fremover, 5»-CCCTTTGGAACGAAGGGTACA-3 «; STAT3 omvendt, 5»-AAGTGACGCCTCCTTCTTTGC-3 «; FAK fremover, 5’GAGAGCTGAGGTCATTTTTGCA -3 «; FAK omvendt, 5’GCAGCAATGTCCCTGTGTACA -3 «; TBP fremover, 5»-CACGAACCACGGGACTGATT-3 «; og, TBP omvendt, 5»-TTT TCTTGCTGCCAGTCTGGAC- 3 «. Alle forsøk ble utført in triplo.
Celleviabilitet assay
PrestoBlue celleviabilitet reagens (Invitrogen, USA) ble anvendt for å vurdere celleoverlevelse etter digoksin behandling i henhold til produsentens protokoll. OD-målinger målt ved 570/600 nm av en Victor
3 spektrofotometer (Perkin-Elmer, Boston, MA, USA) ble registrert etter tilsetting av reagens og inkubasjon. Alle prøvene ble testet i triplikat.
kolonidannelse assay
Den detaljerte fremgangsmåtene i kolonidannelsesbestemmelsen ble tidligere beskrevet [22]. I korthet, for forankringsavhengig vekst analysen ble 500 celler resuspendert i RPMI og sådd ut i seks-brønns plater. Etter 10 dager ble cellene vasket og fiksert med 3,7% paraformaldehyd. Deretter ble cellene farget med 0,05% krystallfiolett. I motsetning til den forankrings-uavhengig vekst assay ble de seks-brønns plater forbelagt med 0,7% LMP-agarose i RPMI medium med 10% FBS. 1000 celler ble sådd i 0,35% LMP-agarose /RPMI-medium med 10% FBS. Etter størkning, ble cellene behandlet med digoksin i 2 uker. Platene ble farget med 0,5 mg /ml p-iodonitrotetrazolium fiolett. Kolonier med en diameter større enn 1 mm ble tellet. Triplikatprøver ble anvendt i forsøket.
bølgen og migrasjons assays
Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av digoxin i 24 timer og utsådd i Transwell kamre (8-um porestørrelse, 6,5 mm diameter, Corning Costar Corporation, MA, USA), som var eller ikke var belagt med Matrigel (R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Fremme av NSCLC celledød av digoksin
digoksin, et hjerteglykosid, har blitt rapportert. å ha mange kreft effekter [24,25]. For å avgjøre om digoksin hadde lignende cytotoksiske effekter i ulike lungekreftcellelinjer, fem cellelinjer, A549, H3255, H1975, PC9 og PC9 /GEF, ble behandlet med 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 og 1 mikrometer av digoksin for 24-96 h. PC9 celler som uttrykker en mutant EGFR med en delesjon i ekson 19 er en gefitinib sensitive NSCLC cellelinje. PC9 /GEF celler ble valgt ut fra foreldre PC9 celler som hadde blitt kontinuerlig utsatt for økende konsentrasjoner av gefitinib [23]. Resultatene viste at cellelevedyktigheten ble påvirket på en dose- og tidsavhengig måte (figur 1A-1E). De største effektene ble notert i A549-celler (IC
50 = 0,048, 0,036, 0,030 og 0,029 mikrometer for 24, 48, 72 og 96 h, henholdsvis), og de andre største effektene ble registrert i H3255 celler (IC
50 = 0,104, 0,107, 0,070 og 0,057 uM til 24, 48, 72 og 96 h, henholdsvis). Etter 72 timer med eksponering for stoffet, IC
50 verdier for digoksin i PC-9 og PC-9-IR celler var 0,0917 og 0,101 mikrometer, henholdsvis.
Fem lunge kreft cellelinjer, ( a) A549, (b) H3255, (c) H1975, (d) PC9 og (e) PC9 /gef, ble behandlet med 6 forskjellige doser (0, 0,01, 0,05, 0,1, 1 og 5 uM) til digoksin ved forskjellig tidspunkter (0, 24, 48, 72 og 96 h), og cellenes levedyktighet ble målt ved bruk av PrestoBlue celleviabilitet reagens etter behandling. Kvantitative data er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 3); * P. 0,05 sammenlignet med løsemiddel kontroll (0,1% DMSO) på tilsvarende tidspunkt
Rollen av digoksin i kreft effekter
For å undersøke kreft effekter av digoksin, vi neste utført celle anchorage-avhengighet, forankrings uavhengighet, migrasjon og invasjon analyser. Våre resultater viste at digoksin hemmet dannelsen av A549 cellekolonier i en doseavhengig måte (10, 25, 50 og 100 nM) i løpet av uker, uavhengig av forankringsavhengig (figur 2A) eller forankrings-uavhengig vekst (figur 2B). For å evaluere antitumor virkningene av digoksin på migrering og invasjon ytterligere, A549 celler ble for-behandlet med varierende konsentrasjoner av digoxin i 24 timer og deretter utsatt for invasjon og migrasjons analyser i 12 timer og 16 timer, henholdsvis. Våre data viser at digoksin signifikant inhiberte cellemigrering og invasjon ved 100 nM sammenlignet med løsningsmiddelkontrollen (0,1% DMSO, figur 2C og 2D).
A549-celler dyrket i en kulturskål med (b) eller uten (a ) soft agar ble behandlet med den ønskede konsentrasjon av digoksin, og deretter utsatt for kolonidannelse analyser. (C) Digoxin avtar A549 cellemigrering evne, som vurdert av transwell migrasjon analysen. (D) Invasivitet til A549-celler behandlet med digoksin ble evaluert ved anvendelse av en Matrigel-baserte transwell invasjon assay. * P 0,05 sammenlignet med vehikkel-behandlet kontroll (0,1% DMSO). Hver behandling ble uavhengig utført i tre eksemplarer.
Digoksin hemmer aktiveringen av Src og relaterte proteiner
Dasatinib (BMS-354825), en Src kinase inhibitor (SKI), har blitt identifisert som et effektivt mål terapi medikament in vitro og i klinisk forskning [26,27]. I denne studien ble dasatinib brukt som en positiv kontroll. En cytotoksisk analyse indikerte at cellelevedyktigheten ble betydelig redusert med digoksin, og effekten var sterkere enn de av dasatinib ved samme konsentrasjon (100 nM) i 24, 48, 72 og 96 timer (figur 3A). For å bestemme hvorvidt digoksin påvirker fosforylering av Src og relaterte proteiner på en doseavhengig måte, ble et Western blot-assay utført. Resultatene indikerte at fosforyleringen av Src Y418, EGFR Y1068 og STAT3 Y705 ble redusert på en doseavhengig måte (50-500 nM) av digoksin i A549 lungekreft cellelinjen som besitter villtype EGFR (figur 3B). Vi har også bestemt at digoksin redusert fosforylering av Src Y418, EGFR Y1068 og STAT3 Y705 i en tidsavhengig måte fra 2 til 24 timer i A549-celler (figur 3C). Lignende resultater ble oppnådd med andre lungekreft-cellelinjer, f.eks H3255 cellelinjen som bærer en L858R EGFR mutant og H1975 cellelinjen inneholdende en L858R /T790M EGFR mutant (figur 3D og 3E). For å bekrefte at effekten av digoxin er via regulering av Src aktivitet, ble en konstitutivt aktivert Src mutant konstruksjon (Src Y527F) [28] brukt. Resultatene viste at overekspresjon av Src Y527F økt fosforylering av STAT3 og FAK. Imidlertid fosforyleringen av Src Y418, Y705 og STAT3 FAK Y576 ble fortsatt redusert i digoksin-behandlede celler (figur 3F). For å evaluere virkningen av Src Y527F på cellelevedyktigheten ytterligere, ble A549-celler transfektert med Src Y527F i 18 timer og deretter behandlet med 100 eller 250 nM av digoxin i 24 timer. Mutant Src Y527F-transfekterte celler viste en økning på celle levedyktighet, sammenlignet med mock transfektanter (α = 0.05, p 0,05). Dataene viste også at 100 og 250 nM digoksin i betydelig grad hemmet cellelevedyktighet i Src Y527-transfekterte celler sammenliknet med den bærerkontrollen (0,1% DMSO) av Src Y527 transfektant (α = 0,05, p 0,05) (figur 3G). Disse resultatene indikerte at digoksin kan føre cytotoksisk effekt og reduserer fosforyleringen av Src, STAT3 og FAK i celler med konstitutiv aktivering Src.
(a) A549 cellelevedyktighet ble målt ved bruk av Prestoblue celleviabilitet reagens ved forskjellige tidspunkter (0, 24, 48, 72 og 96 h) med eller uten 100 nM digoksin eller dasatinib. (B) Analyse av fosforylert og ikke-fosforylert Src, EGFR og STAT3 i A549-celler på en doseavhengig måte. Kreftceller behandlet med eller uten forskjellige konsentrasjoner av digoksin (50, 100, 250 og 500 nM) eller 100 nM dasatinib i 24 timer ble analysert ved hjelp av Western blot. (C) Analyse av fosforylert og ikke-fosforylert Src, EGFR og STAT3 i A549-celler i en tidsavhengig måte. Etter digoksin behandling (250 nM) i 2, 4, 8, 12 eller 24 timer, ble kreftcellene høstet og analysert ved hjelp av Western blot. Effekten av digoksin på Src, EGFR, og STAT3 i (d) H3255-celler og (e) H1975 celler. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. Hver behandling ble uavhengig utført in triplo. (F) Effekt av Src Y527F på fosforyleringen av STAT3 og FAK etter digoksin behandling i A549-celler. Mock og EGFP-Src Y527F transfektanter ble behandlet med 100 eller 250 nM av digoxin i 24 timer. Fosforyleringen og total proteinnivåer av Src, STAT3 og FAK ble påvist ved Western blotting. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. Hver behandling ble uavhengig utført in triplo. (G) Digoxin hemmer levedyktigheten av celler transfektert med Src Y527F mutant. Etter transfeksjon med Src Y527F og behandling med 100 eller 250 nM av digoxin i 24 timer, ble A549 cellelevedyktigheten bestemmes ved PrestoBlue celleviabilitet reagens. Kvantitative data er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 3); * P. 0,05 sammenlignet med bilen kontroll (0,1% DMSO) av EGFP-Src Y527F transfektant
Digoksin hemmer Src aktivitet og nedstrøms signal
Effektene av digoksin på Src nedstrøms mål ble påvist ved Western blotting i digoksin-behandlede cellelinjer (figur 4A-4C). En betydelig hemming av PI3K, FAK, SAPK /JNK, paxillin og p130Cas aktiviteter ved digoksin ble vist i tre cellelinjer på 250/500 nm og nedenfor. Spesielt A549-celler, er den mest følsomme overfor digoksin veksthemming, viste fremming av p-MEK1 /2 og p-ERK av digoxin ved 100 nM (figur 4A). H3255 cellene ble den nest mest følsomme for digoksin fordi p-Src ble inhibert (figur 3D). I denne cellelinje, digoksin noe redusert p-MEK1 /2 og p-ERK ved 500 nM (figur 4B). I tillegg, selv om digoksin vesentlig hemmet ekspresjon av p-Src ved 250 nM i H1975 celler (figur 3E), en økning i p-AKT-aktivitet var i forståelse med inhibering av p-MEK og p-ERK (fig 4C) . For å undersøke rollen til ERK1 /2 i virkningen av digoxin, ble A549-celler behandlet med den ERK inhibitor U0126 og 100 eller 250 nM av digoxin i 24 timer. Cellene ble deretter underkastet Western blotting (figur 4D) og celle-levedyktighet (figur 4E) assay. Resultatene viste at inhibering av ERK1 /2 fosforylering var ute av stand til å hindre at de cytotoksiske virkninger av digoksin eller fremming av p-ERK og p-MEK1 /2 av digoksin ved 100 nM. Dette resultatet antydet at digoksin kan påvirke andre signalveier og hemme andre vekstfaktorer eller protein kinaser å regulere cellevekst i disse cellelinjene.
Western blotting analyser av fosforylert og ikke-fosforylert PI3K, AKT, MEK1 /2, ERK, FAK, SAPK /JNK, paxillin og p130Cas i (a) A549, (b) H3255, og (c) H1975 cellelinjer etter en 24-timers behandling med 100, 250 eller 500 nM digoksin. Løsemiddelet kontrollen var 0,1% DMSO; GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. (D) Western blotting analyser av fosforylert og total ERK, MEK1 /2 og AKT i A549-celler etter en 24-timers behandling med 10 uM U0126 og 100 eller 250 nM digoksin. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. (E) ERK-inhibitor har ingen virkning på digoksin-indusert celledød. A549-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av U0126 og digoksin. Cellelevedyktigheten ble målt ved PrestoBlue celleviabilitet reagens. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3).
Digoxin reduserer mRNA-ekspresjon av Src og beslektede proteiner
Figurene 3 og 4 viser at digoksin ikke bare inhibert Src og beslektet protein-kinase-aktivitet, men også redusert mengden av Src og relaterte proteinkinaser. Vi videre gransket om denne effekten kan oppstå fra protein ustabilitet eller transkripsjonen nedregulering. A549-celler ble forbehandlet med den proteasominhibitor MG-132 ved 10 uM i 2 timer før eksponering til 250 nM digoksin i ytterligere 24 timer. Imidlertid, i nærvær av en proteasominhibitor, ekspresjonen av digoxin-redusert Src, EGFR og STAT3 ble ikke endret i vesentlig grad sammenlignet med det i cellene behandlet med digoksin alene (figur 5A). Vi xamined ytterligere om digoksin redusert ekspresjon av Src, EGFR, STAT3, og FAK mRNA i A549-celler ved hjelp av revers transkripsjon kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR; figur 5B). Vi observerte en nedregulering av EGFR og FAK-mRNA-ekspresjon i 0,5- og 0,6-fold, henholdsvis ved 100 nM digoksin i motsetning til løsningsmiddel-kontroll (p 0,05) og nedregulering av Src og STAT3 mRNA-ekspresjon for 0.48- og 0,67 ganger, henholdsvis 250 nM digoksin (p 0,05). Disse resultatene indikerer at ekspresjon av Src og relaterte proteiner er regulert av digoksin, som i sin tur virkninger transkripsjonsregulering.
(a) A549-celler ble forbehandlet med eller uten MG132 (10 uM) i 2 timer, deretter behandlet med digoksin (250 nM) eller 0,1% DMSO (løsningsmiddel kontroll) og oppsamlet ved 24 timer. Proteinekspresjon ble bestemt ved Western blot-analyse. GAPDH var en kontroll for protein lasting og transport. (B) Celler ble behandlet med digoksin (100 og 250 nM) i 24 timer, og påvisning av Src, EGFR, STAT3 og FAK-mRNA-ekspresjon ble bestemt ved sanntids RT-PCR. * P 0,05, signifikant forskjellig fra kjøretøyet behandlet kontroll (0,1% DMSO). Hvert eksperiment ble uavhengig utført tre eksemplarer.
Diskusjoner
Lungekreft har en høy dødelighet og er en av de vanligste ondartede svulster. Nylige suksesser i målrettet behandling har bedret resultatene av kreftbehandling. En diett av EGFR TKI, inkludert gefitinib og erlotinib, er standard førstelinjebehandling mot avansert NSCLC hos pasienter som aktiverende EGFR mutasjoner. [29]. Men denne tilnærmingen fremmer uunngåelig TKI motstand. Src, en velkjent onkogen, spiller en viktig rolle i mange signalveier og opprettholder aktiverings i forskjellige krefttyper, inkludert lungekreft [30]. I denne rapporten har vi funnet at digoksin hemmer betydelig Src fosforylering hos NSCLC celler med varierende EGFR genotyper, inkludert villtype, en L858R mutant, og en L858R /T790M mutant. Videre viste vi muligheten av digoksin til å inhibere lungecancer proliferasjon, migrering og invasjon in vitro. I tillegg viser vi en multi-funksjonell rolle for digoksin muligens involverer signalveier, som så vidt vi vet, har ikke tidligere blitt rapportert.
Digoxin er et naturlig stoff hentet fra revebjelle (
revebjelle
L.) [31], som tilhører en gruppe av hjerteglykosider som kan binde og hemme natrium pumper. Det har vært brukt klinisk for å behandle hjertesvikt og atriell arytmi via hemming av Na
+ /K
+ – ATPase i mange år, [32], og det hemmer veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler [33] betraktelig. Som tidligere nevnt, har lave konsentrasjoner av hjerteglykosider vist seg å ha lav cytotoksisitet i normale celler [32]. I tillegg har digoksin blitt vist å inhibere primær tumorvekst og metastase av kreftceller fra bryst til lunge i en ortotopisk modell i hvilken humane brystcancerceller ble implantert i SCID-mus [34]. På molekylært nivå, digoksin nedregulerer NDRG1 og VEGF gjennom hemming av HIF-1α i henhold hypoksiske forhold i A549 celler [35] og induserer autofagi å redegjøre for den veksthemmende effekter i NSCLC celler gjennom regulering av mTOR og ERK1 /2 signalveier [36]. I denne studien, har vi funnet at digoksin redusert fosforylering av Src i en dose (50-500 nM) og tid (2-24 h) -avhengig måte. Våre data viser også at digoksin redusert fosforylering av eksogent, konstitutivt aktivt Src i transfekterte celler. Men en tidligere rapport antydet at digoksin litt forhøyet fosforyleringen av både Src og ERK i NSCLC-celler i løpet av 10 minutter ved en konsentrasjon på 100 nM og til slutt resulterte i reduksjon av p53-proteinsyntese [37]. Vi spekulere at avvik kan skyldes eksponeringstiden for digoksin. Dette er imidlertid den første studien for å demonstrere at digoksin kan hemme ikke bare Src men også fosforylering og ekspresjon av EGFR og STAT3 for ytterligere å retardere kreftcelle proliferasjon, migrering og invasjon. Våre resultater støtter potensiell bruk av digoksin som en multi-target agent i kreftbehandling
TKI med aktiviteter mot EGFR er effektive i lungekreftpasienter med EGFR mutasjoner.; imidlertid frem motstand over tid. Dermed finne en ny middel mot EGFR villtype og TKI-resistente lunge cancer er en nødvendighet. I vår studie, en EGFR villtype lungekreft-cellelinje, A549, ble brukt til å screene Src-kinase-inhibitorer. NSCLC pasienter med en Arg substitusjon for Leu i posisjon 858 eller sletting av ekson 19 i EGFR er lydhør overfor EGFR TKI [38]. Flere kliniske studier har indikert at forsterkningen av en T790M mutasjon i EGFR bidrar til oppkjøpet av EGFR-TKI motstand [39]. Derfor TKI-sensitive lungekreft cellelinjer (PC9, ekson 19 sletting, H3255, L858R EGFR mutant) [40] og TKI-resistent lungekreft cellelinjer (PC9 /GEF, ekson 19 sletting, ervervet resistens, H1975, L858R /T790M EGFR-mutant) [38] ble brukt til å evaluere effektiviteten av anticancer digoksin. Våre resultater viste at A549-celler var den mest følsomme for digoksin ved lave konsentrasjoner, mens andre lungekreftceller svarte på digoksin ved konsentrasjoner i området 250-500 nM.
En ny studie viste at Src aktivering styrer en rekke trasé, inkludert overlevelse, angiogenese, spredning, migrasjon og invasjon, gjennom en rekke proteiner, inkludert PI3K /AKT, STAT3, MEK /ERK og FAK /paxillin /p130CAS [13]. Liu et al. viste at celleproliferasjon er regulert av PI3K /AKT og RAF /MEK /ERK signalveier [41]. I en separat studie ble ERK1 /2-aktivering samtidig som finnes i digoksin-indusert autofagi [36]. I den foreliggende undersøkelse, digoksin redusert fosforylering av PI3K og ERK i forskjellige typer av lunge cancer ved 250 nM, men fremmet fosforyleringen av MEK og ERK ved en lav konsentrasjon (100 nM) i A549-celler. Imidlertid hemning av ERK-reaksjonsveien ikke påvirke effekten av digoksin, noe som indikerer at det kan være andre måter med virkningene av digoksin. Vi foreslår at digoksin kan hemme kreft celle vekst gjennom hemming av PI3K /AKT signalveier, som fører til autofagi ved forskjellige konsentrasjoner. STAT3 aktiveres i EGFR villtype NSCLC og korrelerer med progresjon av kreft, inkludert celleoverlevelse, migrering og invasjon [42]. Sorafenib og en av dets derivater (SC-1) er rapportert å inhibere EGFR villtype NSCLC vekst og induserer apoptose via SHP-1 /STAT3 sti [43]. I denne studien fant vi at digoksin ikke bare redusert STAT3 fosforylering i EGFR villtype NSCLC men også i EGFR mutant-type NSCLC. I tillegg aktivering av FAK-Src molekylære stillasene og p130Cas-JNK signal kaskader av a1-inte fremmer invasjonen av tykktarmskreftceller [44]. Videre er paxillin abnormt reguleres i forskjellige maligniteter og er involvert i tumorvekst og invasjon. Ektopisk uttrykk for paxillin forenkler celleproliferasjon og migrasjon, mens paxillin knockdown hemmer disse hendelsene i mage celler [45]. Våre data indikerer at digoksin undertrykker FAK-Src, paxillin, PI3K /AKT, MEK /ERK, Stat3 og p130Cas-JNK signalveier i ulike EGFR-holdige lungekreftceller, noe som tyder på at digoksin hemmer kreft celle invasjon ved å redusere Src aktivering og aktivering relaterte signalveier.
i konklusjonen, ved hjelp av in vitro narkotika screening og cellefunksjonsanalyser, oppdaget vi at digoksin kan undertrykke kreft progresjon lunge ved å hemme Src aktivering og aktivering av relaterte pathways, inkludert celleproliferasjon, migrasjon, og invasjon. Men vi kan fortsatt ikke utelukke at andre signalveier og proteiner spille noen roller i digoksin-induserte effekter (fig 6). Tatt sammen, foreslår at digoksin vil være viktig i anticancerlegemiddelutvikling.
digoksin-behandlede celler, fosforyleringen av Src og dets relaterte proteiner ble hemmet, noe som kan føre til inhibering av lungecancer celleproliferasjon, migrasjon og invasjon.
takk
forfatterne ønsker å takke Prof. Chih-Hsin Yang for å gi kreft PC9 lunge og PC9 /GEF cellelinjer. Vi takker også Dr. Hong Chen Chen for å gi pEGFP-N3-Src-Y527F mutant plasmid.
