Abstract
Semiconductor kvanteprikker representerer en ny klasse av fluorophores med unike fysiske og kjemiske egenskaper som kan muliggjøre en bemerkelsesverdig utvidelse av dagens anvendelser av fluorescerende bildebehandling og optisk diagnostikk. Komplekser av kvanteprikker og antistoffer er lovende visualisere midler for fluorescerende påvisning av selektive biomarkører overuttrykt i tumorvev. Her beskriver vi bygging av selv-montering fluorescerende komplekser av kvanteprikker og anti-HER1 eller anti-HER2 /neu scFv antistoffer og deres interaksjon med dyrkede tumorceller. En forpliktende strategi basert på en helt bestemt ikke-kovalent interaksjon mellom to proteiner, barnase og barstar, ble brukt til å koble kvanteprikker og rettet mot antistoffer. En slik strategi kan kombinere målretting og visualiseringsfunksjoner bare ved å variere de tilsvarende modulene av fluorescerende kompleks
Citation. Zdobnova TA, Stremovskiy OA, Lebedenko EN, Deyev SM (2012) Selv Montering Komplekser av Quantum Dots og scFv Antistoffer for Cancer Cell målretting og bildebehandling. PLoS ONE 7 (10): e48248. doi: 10,1371 /journal.pone.0048248
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 9 juli 2012; Godkjent: 21 september 2012; Publisert: 25 oktober 2012
Copyright: © 2012 Zdobnova et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av den russiske Foundation for Basic forskning (prosjekt nos. 12-04-00757-en, 11-04-12091-Ofi-m-2011, og 10-04-01506), presidium av russiske Academy of Sciences (Molecular Cellular Biology og Nanoteknologi . Nanomaterialer) og departementet for utdanning og vitenskap i den russiske føderasjonen (prosjekt nos 16.740.11.0497, 14.740.11.0253, 16.512.11.2053 og 11.G 34. 31,0017). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blant de viktigste metodene for fluorescerende visualisering av tumorer er det en basert på deteksjon av selektive biomarkører overuttrykt i tumorvev, som gjør det mulig å avsløre tumortype, metastatiske prosesser, tumormedikamentresistens, etc. [1]. Kontrastmidler brukes til dette formålet generelt består av to deler, eller moduler: a. Visualisering modul som er ansvarlig for målgjenkjenning og en målgruppe som selektivt binder seg til en bestemt celletype
I det siste tiåret, fluorescerende halvledere nanokrystaller, kalt kvanteprikker (QD), har tiltrukket seg mye oppmerksomhet som visualiserer agenter for biologiske anvendelser. Blant de mest fordelaktige egenskaper ved QD er bemerkelsesverdig lysstyrke av fluorescens, fotostabilitet, bred eksitasjon og smale emisjonsspekter, og en rik palett av spektralt tunbare utslipps band, etc. Disse egenskapene gjør at flerfarget merking og samtidig identifisering av ulike biologiske gjenstander samt som langsiktig bio-imaging [2].
som en måls modul, scFv antistoffer syntes å være mer lovende for både
in vitro Hotell og
in vivo
programmer [ ,,,0],3]. ScFv antistoff består av en enkelt polypeptidkjede som kombinerer variable domenene til immunoglobulin lette og tunge kjeder som er koblet via en peptidlinker. Slike antistoff-derivater kan fremstilles i bakterielle ekspresjonssystemer som stabile proteiner feste antigen spesifisitet for et full-lengde antistoff, men som mangler Fc-domenet som er ansvarlig for effektorfunksjonen av immunglobuliner og er generelt uønsket for in vivo målretting anvendelser.
i dette arbeidet, for modell antistoffer (som en målgruppe modul), valgte vi anti-tumor 425scFv [4] og 4D5scFv [5], som selektivt binder seg til tumor~~POS=TRUNC HER1 /EGFR og HER2 /neu, henholdsvis. Disse Tumormarkører er trans-membran proteiner fra familien av epidermal vekstfaktor-reseptorer som er overuttrykt i mange kreftceller og har en stor diagnostisk og prognostisk betydning [6]. Tidligere har disse scFv blitt anvendt for målrettet levering av fluorescerende proteiner og terapeutiske midler til tumorceller [7], [8], [9], [10].
I dag er det to metoder for QD konjugering med targeting midler: direkte konjugering og konjugering via adapter molekyler. Direkte konjugasjon er ikke en optimal metode fordi målsøkende midler forandres i løpet av konjugasjonsprosedyren. For eksempel, antistoffer konjugert til QD beholde deres antigenspesifisitet, men deres affinitet kan betydelig reduseres. [11]. Videre er direkte konjugering av QD til et målsøkende antistoff krever testing av aktiviteten til antistoffet i hvert enkelt tilfelle
Anvendelse av selv-sammen adaptere -. Liten og «klebrig» molekyler, effektivt og spesifikt å binde seg til hverandre uten dannelse av homodimerer, synes å være en mer lovende metode for å binde det målsøkende antistoff til QDS. I dette arbeidet presenterer vi barnase-barstar system (BBS) som et universalverktøy for fremstilling av fluorescerende komplekser av forskjellig selektivitet og parametere for fluorescens på grunnlag av QDS og scFv-antistoff for visualisering av tumorceller.
Materials og metoder
Bakteriell uttrykk og rensing av rekombinante proteiner
mutant barstar C40 /82A (heretter kalt barstar), villtype barnase [7], [12], rekombinant anti- HER2 /neu 4D5scFv og anti-HER1 425scFv antistoff [13], samt (4D5scFv)
2-Bn-fusjonsprotein [14] ble fremstilt i
Escherichia coli
og renset som beskrevet tidligere [7].
ekspresjonsplasmidet for 425scFv-B-fusjonsprotein ble konstruert på grunnlag av PSD-4D5scFv-barstar plasmidet [15] (
figur 1
). Genetisk engineering manipulasjoner, celledyrking og cellelysering ble utført i henhold til standard protokoller. DNA-fragmentet som koder for 425scFv protein ble amplifisert fra et plasmid pKM30425M1ChCl [4] med primere 5’GACTCGATATCGAAGTGCAACTGCAGCAGTC og 5’CTGTGGAATTCCCGTTTGATCTCCAGTTCTG. Produktet fra amplifikasjonen ble klonet inn i PSD-4D5scFv-barstar plasmid istedenfor 4D5scFv-genet ved hjelp av EcoRV og EcoRI restriksjons-endonukleaser. Den resulterende PSD-425-B-His
6 konstruksjon ble verifisert ved sekvensering.
425scFv-B-His
6 konstruere starter med en N-terminal kort FLAG tag (F, mørk blå ) etterfulgt av 425scFv i V
H-linker-V
L orientering (V
H, cyan, L, grå; V
L turkis), 16-amino-syre hengsel linker (grønn ), barstar (lilla). Konstruktet avsluttes med en His
6-tag (mørk blå) som er festet til den C-terminale ende av 425scFv-barstar fusjonsprotein. Fusjonsgenet er under kontroll av
lac
promoter.
OmpA Anmeldelser – signal peptid for rettet sekresjon av rekombinant protein til
E. coli
periplasma.
For produksjon av 425scFv-B inneholder Hans
6-tag på
C
-terminalen,
Escherichia coli
belastning BL21 ble transformert med PSD-425-B-His
6 og dyrket i lysogeni kjøttkraft (LB) ved 28 ° C. Den 425scFv-B-ekspresjon ble indusert ved tilsetning av 0,5 mM IPTG ved en OD
550 0,8. Bakteriene ble deretter inkubert ved 28 ° C i 12 timer. Cellene ble høstet, sentrifugert, og pelleten ble resuspendert i lyseringsbuffer (0,01 M Tris-HCl, pH 8,3, med 0,1 M NaCl og 10 mM EDTA) og ultralydbehandlet på is. Lysatet ble deretter sentrifugert ved 22000 g i 30 min ved 4 ° C. Pelleten ble brukt til rensing av Hans
6-tagget protein på Ni
2 + -NTA kolonne (Qiagen) under denaturerende betingelser i henhold til produsentens instruksjoner. Proteinet ble denaturert med 8 M urea, foldet på nytt i 5 timer ved anvendelse av en lineær gradient 8-0 M urea og eluert med 250 mM imidazol. For endelig rensing av 425scFv-B, ble elusjonstester fraksjoner fortynnet 20 ganger, påføres Q Sepharose FF 1 ml kolonne (GE Healthcare) og eluert ved hjelp av lineær gradient 0-500 mM NaCl.
SDS /PAGE analyse av proteiner ble utført i henhold til standard protokoller ved hjelp av 14% (for barnase og barstar) eller 12,5% (for de andre rekombinante proteiner) polyakrylamidgeler.
QD konjugering
QDS med fluorescensemisjonen maksimum ved 565 eller 605 nm ble anvendt for utformingen av visualisering modulen. Karboksylgruppe belagt QDS (Qdot 565 ITK ™ karboksyl kvanteprikker og Qdot 565 ITK ™ karboksyl kvanteprikker, Invitrogen) ble konjugert med ett av BBS proteiner ved hjelp av EDC /NHS kobling kjemi. 2 uM QDS i 0,1 M MES (pH 6,0) og 0,5 M NaCl ble først aktivert med EDC (ca. 2 mm) og NHS (~ 5 uM) ved romtemperatur i 15 min. Reaksjonsblandingen ble påført på Sephadex G-25-kolonne og eluert med en buffer inneholdende 40 mM Na2B4O7 og 30 mM KH2PO4, pH 8,0. Deretter eluert aktiverte partikler ble blandet med barstar eller barnase oppløst i den samme buffer og inkubert i en time ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble påført på Sephadex G-25-kolonne og bundne proteiner ble eluert med PBS (pH 7,4). QD: protein molare forhold var optimalisert for hvert protein
agarosegelelektroforese
Elektroforese av QDS og QD-konjugater ble utført ved anvendelse av 1% agarosegel i TAE-buffer (50 mM tris-acetat. , 1 mM EDTA, pH 7,6) ved 10 V /cm i 30 minutter. QDS ble fortynnet i TAE og blandet med 6 x ladningsbuffer (50% glycerol, 0,1% bromfenolblått) før lasting på gelen. Geler ble visualisert med transilluminator Multi Doc-It Digital Imaging system.
barstar og barnase aktivitetsanalyse
ribonuklease aktivitet barnase, (4D5scFv)
2-Bn og QD-Bn konjugater ble testet med syre-uoppløselig utfelling RNA-analysen beskrevet i [16], med den modifikasjon av alle løsnings volumene skalert ned fem ganger. Aktiviteten til barstar, 425scFv-B, og QD-B-konjugater ble bestemt ved deres evne til å inhibere aktiviteten av ribonuklease barnase. Barnase ved en konstant konsentrasjon på 26 nM ble inkubert med serielle To gangers fortynninger av barstar, 425scFv-B, eller QD-B-konjugater. De oppnådde løsninger ble så brukt i den Rushizky analyse [16].
Bestemmelse av antistoff-affinitets-
Målinger av en dissosiasjonskonstant ble utført ved anvendelse av BIAcore instrumenter (BIAcore 3000). Rekombinante p185
HER2-ECD eller ekstracellulære domene av EGFR (Sino Biological, Inc.) ble koblet til en CM5 chip på tettheten av 4500 RU av standard amin kobling kjemi. Alle proteiner ble brukt ved fire konsentrasjoner (1 uM, 330 nM, 110 nM og 37 nM) i HBS-PE (0,1 M HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Tween-20). De sensograms ble oppnådd ved en strømningshastighet på 5 ul /min ved 25 ° C. Dissosiasjon fasen varte i 20 min.
Cellekulturer
Den menneskelige eggstokkene adenokarsinom Skov-3 (HTB-77, ATCC), human epidermoid carcinoma A431 (CLR-1555), og kinesisk hamster ovarie CHO (russisk Cell Culture Collection) celler ble dyrket i McCoys 5A medium (for SKOV-3) eller RPMI-1640 (for A431 og CHO) med 10% (v /v) føtalt kalveserum (HyClone) og 2 mM
L
-glutamine. Cellene ble dyrket i 5% CO
2 ved 37 ° C.
Cell merking og bildebehandling
For HER2 /neu-rettet celle bildebehandling, Skov-3 celler som overuttrykker HER2 /neu var sådd ut i en 96-brønners plater ved en tetthet på 2 x 10
4 celler pr brønn og dyrket over natten. Cellene ble vasket to ganger med PBS (pH 7,4) før farging. Alle proteiner og QD konjugater ble oppløst i PBS (pH 7,4). Etter en kort vasking med kald PBS ble cellene deretter inkubert med (4D5scFv)
2-Bn rettet mot protein ved en sluttkonsentrasjon på 30 nM, og deretter med 80 nM QD
605-B eller QD
565-B konjugater i 40 minutter ved 4 ° C. Etter hver inkubasjon trinn, ble cellene vasket tre ganger med kald PBS (pH 7,4). Resultatene av cellemerking ble analysert med et invertert mikroskop fluorescerende Axiovert 200 (Zeiss, Tyskland). Bilder ble oppnådd ved anvendelse av et CCD-kamera (AxioCamHRc, Zeiss, Tyskland) og AxioVision programvare (Zeiss, Tyskland).
HER1-rettet celle avbildning ble utført på samme måte, ved bruk av HER1-overekspresjon A431-celler, 425scFv-B målretting modulen og QD
605-BN eller QD
565-BN visualisere moduler.
flowcytometri analyse
For flowcytometri analyse, celler ble sådd ut i 6-brønner plater (Corning) ved en tetthet på 4 x 10
3-celler per brønn og dyrket over natten. Celler ble farget som beskrevet ovenfor. Fargede celler ble løsnet med PBS (pH 7,4) inneholdende 5 mM EDTA og sentrifugert. Pelleten ble resuspendert i 1 ml PBS (pH 7,4) inneholdende 0,1% natriumazid. Celleassosiert fluorescensintensitet ble målt ved anvendelse av en FACS Calibur flowcytometer (BD Bioscience) ved en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm (argon-laser). Fluorescens på minst 10.000 celler per prøve ble analysert. Cell autofluorescence ble estimert ved hjelp av PBS-behandlede celler som kontroller.
In vitro
cytotoksisitet analyser
Den cytotoksisitet av brukte QDS, deres konjugater og komplekser på cellelinjen ble vurdert ved hjelp mikrotit analysen. De SKOV-3-celler ble sådd ut ved en tetthet på 4 x 10
3-celler per brønn i en 96-brønners plate, og fikk feste seg over natten. Deretter ble cellene inkubert med PBS (pH 7,4) inneholdende forskjellige konsentrasjoner av QD-prober ved 4 ° C i 1 time. Etter inkubering ble cellene vasket tre ganger med kald PBS (pH 7,4) og dyrket i 48 timer i standart betingelser. Etter 48 timer ble cellelevedyktigheten estimert ved stan MTT-analyse som beskrevet i [9]. Cellen levedyktighet ble uttrykt som prosentandel av den optiske tettheten av ubehandlede celler fra to eksperimenter utført i tre eksemplarer
Resultater
Generelt strategi. Den barnase-barstar system
I vårt tidligere arbeid, barnase-barstar system (BBS) ble opprinnelig utviklet for antistoff multimerization [15], [17]. Bakterie ribonuklease barnase fra
Bacillus amyloliquefaciens Hotell og dens naturlige hemmer barstar er små proteiner (12 og 10 kDa, respektivt) med ekstremt høy affinitet for binding (K
d~10
-14 M) [18], som er sammenlignbar med affiniteten til streptavidin-biotin interaksjon [19]. Her benyttet vi disse proteinene som molekylære adaptere for å få en serie av selv-montering fluorescerende komplekser basert på kvanteprikker med ulike anti-tumor spesifisitet og farge (
Tabell 1
). Probene er sammensatt av en visualisering modul, nemlig QDS konjugert til en av de BBS proteiner (enten barstar eller barnase), og et målsøkende modul, dvs. anti-tumor-antistoffer sammensmeltet til partneren BBS proteinet (enten barnase eller barstar hhv ) (
figur 2A
). De resulterende visualisere og målretting moduler kan kombineres på forskjellige måter avhengig av molekyl spesifisitet og optiske egenskaper som kreves for en bestemt oppgave Bioimaging (
figur 2B
).
Binding av QDS til scFv antistoff via barnase-barstar molekylære adaptere (A) og BBS-basert molekylær konstruktør som består av et sett av variable fluorescerende og målretting moduler (B) vises
Målrette modulen. konstruksjon og karakterisering av anerkjennelse proteiner
anti-HER1 425scFv og anti-HER2 4D5scFv antistoffer ble brukt som målgruppe molekyler for dirigert levering av QDS til kreftceller. Vi har fått en rekke 425scFv og 4D5scFv fusjonsproteiner med barnase eller barstar i ulike kombinasjoner. To fusjonsproteiner med de høyeste uttrykk avkastning ble valgt som målretting moduler for QDS levering: mono 425scFv smeltet til barstar (425scFv-B) og toverdig 4D5scFv smeltet til barnase ((4D5scFv)
2-Bn)
målretting fusjonsproteiner ble produsert i
E. coli Hotell og renset som beskrevet i materialer og metoder. De oppnådde proteiner var av den forventede molekylvekten og homogeniteten i henhold til SDS-PAGE (
figur 3A
). Dissosiasjonskonstanten av den (4D5scFv)
2-Bn fra den rensede p185
HER2-ECD var ~2.2 nM. Denne verdien stemmer godt overens med det paren 4D5scFv antistoff (~ 5,2 nM). Den enzymatiske aktivitet av det fremstilt (4D5scFv)
2-Bn bestemt ved syre-uløselig RNA utfelling analyse [16] ble ~8% av det native barnase aktivitet (
figur 3B
). Til sammenligning er aktiviteten av barnase fusjonert til forskjellige proteiner blitt rapportert å være ca 75% for hvert enzym-molekyl i 4D5scFv-dibarnase protein [7] og ~80% for barnase kondensert til eksotoksin A fra
Pseudomonas aeruginosa
[20]. Antagelig fusjon av to antistoffmolekyler til barnase resulterer i sterisk hindring virkning og samtidig reduksjon av RNAse aktivitet.
(A) 12% SDS-PAGE som bekrefter rensing av (4D5scFv)
2-Bn ( en, 71 kDa) og 425scFv-B (a «, 40 kDa), Coomassie Brillian Blue R-25 farget gel; standard protein markør (M) og fusjonsprotein baner (P) er vist. (B) RNAse aktivitet av (4D5scFv)
2-Bn (heltrukket linje) sammenlignet med aktiviteten av fri barnase (stiplet linje) og evaluert med syre-uoppløselig utfelling RNA-analyse. (C) Inhibering av fri barnase ved 425scFv-B (heltrukket linje) sammenlignet med inhibering av fri barstar (stiplet linje).
dissosiasjonskonstanten til (4D5scFv)
2-Bn fra den renset EGFR var ~ 2 mikrometer. Mønsteret av barnase hemming av 425scFv-B var den samme som ved fri barstar (
figur 3C
). Dermed barstar delen av 425scFv-B fusjonsprotein beholdt sin funksjonalitet
Visualisering fluorescerende moduler. Konjugering av QDS med BBS proteiner
Følgende QD konjugater med BBS-proteinene ble innhentet for senere bruke som visualiserer fluorescerende moduler: QD
605-B, QD
605-Bn, QD
565-B, og QD
565-Bn. De QDS som skal brukes i kombinasjon med barnase-inneholdende målretting modul ((4D5scFv)
2-Bn) ble konjugert med barstar, mens de som skal brukes sammen med barstar-inneholdende modul (425scFv-B) ble konjugert med barnase. Barnase og barstar ble konjugert til QDS bruker EDC /NHS kobling kjemi. I løpet av reaksjonen, de aktiverte karboksyl-gruppene på overflaten av QDS reagere med c-aminogruppene i proteinet lysinrestene samt α-aminogruppen av den N-terminale rest som resulterer i dannelsen av stabile amidbindinger.
effektiviteten av konjugering trinnet ble bekreftet ved hjelp av agarosegel-elektroforese (
figur 4A
). Under betingelsene utnyttes i elektroforese oppsett (pH 7,6), er ikke-konjugerte QDS negativt ladet, og dermed migrere fra katoden til anoden (
figur 4A
,
kjørefelt 1, 4
). Ved tilsetning av BBS-proteinene til QD suspensjon, vises den elektroforetiske mobilitet av nanopartiklene for å bli påvirket på forskjellige måter, avhengig av det tilsatte protein. Migrasjonen mønster av blanding av QDS og negativt ladet barstar (PI 4.6) er lik som gratis QDS (
figur 4A
,
kjørefelt 2
) .I kontrast, tillegg av positivt belastet barnase (pI 9.8) som kan binde seg til QDS grunn av elektrostatisk tiltrekning resulterte i en smurt migrasjonsmønster (
figur 4A
, spor 5).
(A) elektro~~POS=TRUNC mobilitet av QDS og QD -conjugates i 1% agarosegel, i Tris-acetat-EDTA-buffer (pH 7,4). QDS går fra katode (-) til anoden (+). Lanes: 1 – QD
605, 2 – blanding av QD
605 og barstar (uten EDC), 3 – QD
605-B konjugat, 4- QD
565, 5-Blanding av QD
565 og barnase (uten EDC), 6 – QD
565-Bn konjugat. (B) Normalisert fluorescens spektra av QD
565 (blå linje), QD
605 (fiolett linje) og deres konjugater, QD
565-Bn (grønn linje) og QD
605-B ( rød linje). (C) Den ribonuklease aktivitet QD
605-Bn (rød linje og sirkler) og gratis barnase RNase aktivitet hemming av QD
605-B (blå linje annet). QD
605 (grønn linje), påvirker ikke ribonuklease aktivitet barnase.
Kovalent konjugering av QDS med BBS proteiner ved hjelp av EDC kryssbinder resulterte i betydelig endring av migrasjonsmønstre. QD-B konjugater utstilt lavere mobilitet enn innledende QDS eller blanding av QDS og gratis barstar, indikerer vellykket funksjonalisering av den QD overflate (
figur 4A
, kjørefelt 3
). QD-Bn-konjugater knapt lar brønnene på agarose gel, antagelig på grunn av nøytraliseringen av den negative ladningen av QD ved konjugasjon med barnase (
figur 4A
, felt 6
) .Vi også testet QDS og BBS proteiner for oppbevaring av sine eiendommer innenfor konjugater. Flourescensspektroskopi målinger viste at emisjonsspekter samt kvante avkastning av QD fluorescens etter konjugering til barnase eller barstar vært tilnærmet uendret (
figur 4B
). Den syre-uoppløselige RNA utfelling analyse [16] angir at QD-Bn-konjugater beholde de funksjonelle egenskaper av barnase, dvs. ribonuklease-aktivitet, og QD-B-konjugater beholde barnase-bindende evne og barnase inhiberende aktivitet (
figur 4C
).
live cell imaging
HER1- og HER2-overuttrykk kreft cellelinjer, inkludert A431 human epidermoid (3 × 10
6 HER1 reseptorer /celle [21]) og human ovarie karsinom SKOV-3 (2,6 x 10
5 HER2 /neu-reseptorer /celle [22]) celler, ble valgt for å teste spesifikk farging av kreftceller med selv-sammen fluorescerende komplekser. HER1- og HER2 /neu-negativ kinesisk hamster ovarie-celler (CHO) ble anvendt som kontroller.
Et hovedproblem for cellulær avbildning med QDS er at QD sonder har en tendens til å være «klebrig» og ofte binde ikke-spesifikt til cellemembranen, proteiner, og ekstracellulær matriks [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29]. Den ikke-spesifikke binding er avhengig av overflate-egenskapene til QD og cellelinjene som brukes. Vi evaluerte den ikke-spesifikke bindingsegenskapene til de første karboksylerte QDS anvendes for fluorescerende probe konstruksjon. Som vist i
figur 5 plakater (
Aa og B – grønn linje
), betydelig ikke-spesifikk binding er observert med QD
605 inkubert med SKOV-3, A431 og CHO-celler hos 4 ° C. Vi tillegger det nivå av ikke-spesifikk binding til elektrostatiske interaksjoner av de negativt ladede QDS med celleoverflaten. Følgelig, for rettet og spesifikk farging av kreftceller med QDS er det nødvendig ikke bare for å sikre riktig målretting av den oncomarker av interesse, men også for å redusere ikke-spesifikk binding av QDS. For å redusere ikke-spesifikk binding, blir QDS ofte modifisert med poly (etylenglykol) (PEG), en hydrofil polymer som rutinemessig anvendes for slike formål i biologiske anvendelser. Men i det foreliggende arbeid behovet for PEGylering kan unngås. Overraskende nok har vi funnet at QD konjugering til både den BBS proteiner – barnase og barstar – reduserer ikke-spesifikk binding av QDS til celleoverflaten. Når cellene ble inkubert med QD
605-B eller QD
605-Bn ved 4 ° C, svak eller ingen fluorescerende signal ble påvist på celleoverflaten, noe som indikerer at QDS konjugert med BBS proteiner har neglisjerbar ikke- spesifikk binding (
Figur 5
, Ab og B-oransje linje for QD
605-B eller gul linje for QD
605-Bn
). Lignende resultater ble oppnådd for QD
565 og deres konjugater. Således vil bruken av BBS proteinene tillates ikke bare bindingen av QDS med rettet mot antistoffer, men også å redusere den ikke-spesifikke binding av QDS til celleoverflaten.
(A) Optisk mikroskopi av HER1overexpressing A431-celler som var preinkubert med QD
605 (a), QD
605-Bn (b), 425scFv-B og QD
605-Bn (c). HER1-negative CHO-celler ble brukt som kontroller for farging med 425-B og QD
605-Bn (d). Som ekstra kontroll konkurrerende binding test av fritt 425scFv og anti-HER1 425scFv-B /QD
605-Bn komplekset ble utført (e). Venstre rad, lyse-feltet image; høyre rad, fluorescens bilde med 488 nm eksitasjon og 605 nm utslipps topper. (B) Flowcytometri av Skov-3, A431 $ \\ raster (70%) = «RG1» $ CHO celler inkubert med QD
605 (grønn linje), QD
605-Bn (gul linje), QD
605-B (oransje linje), (4D5scFv)
2-Bn og QD
605-B (rød linje), 425scFv-Bsand QD
605-Bn (blå linje).
«armament’of QD-BBS proteinkonjugater med målretting antistoffer tillatt spesifikk merking og avbildning av kreftceller. Den generelle strategien for spesifikke tumorcelle merking av selvsammen fluorescerende QD-scFv kompleks basert på BBS-systemet er illustrert i
figur 6
(venstre)
. Tumorceller ble pre-inkubert med målretting fusjonsproteinet og deretter farget med QD-BBS-proteinkonjugater. Visualisere modulen ble koblet til celleassosiert målretting modulen via barnase-barstar interaksjon. Dermed blir QD
605-BN-konjugater effektivt farget HER1 på overflaten av A431-celler etter at cellene ble inkubert med den 425scFv-Ber rettet mot protein (
Figur 5
, Ac
) . Likeledes ble Skov-3 celler som overuttrykker HER2 /neu avbildes ved sekvensiell behandling med (4D5scFv)
2-Bn og QD
605-B. Kontroller med HER1- og HER2 /neu-negative CHO-celler viste ingen farging, noe som indikerer bindingen spesifisiteten til de målrettede selv-sammen komplekser. I tillegg, når de A431-celler ble behandlet med anti-HER1 fluorescerende kompleks og fri 425scFv (molforhold 01:02), binding av komplekset til cellemembranen ble fullstendig blokkert (
Figur 5
, Ae
). Tilsvarende resultater ble oppnådd ved hjelp Skov-3 celler, anti-HER2 /neu kompleks og gratis 4D5scFv.
Legends som i figur 1.
Bruk av QD
565- B modulen gjør det mulig å utføre celle avbildning i det grønne spektralområdet. Således ble QD-scFv-komplekser med de ønskede antitumorsæregenheter og fluorescerende spektrene som oppnås ved kombinasjon av visualisere og målretting modulene (tabell 1).
I tillegg tumorceller ble med hell fotografert ved en ett-trinns fremgangsmåte ved å bruke formon QD-scFv-komplekser. I dette tilfellet er rettet mot modulen (425scFv-B eller (4D5scFv)
2-Bn) og visualisere modul (Bn-QD eller B-QD, respektivt) ble forblandet for kompleksdannelse, etterfulgt av inkubasjon av tumorcellene med de resulterende komplekser. (
figur 6
).
Selv om QDS er unike visualisering middel i form av deres photophysical og kjemiske egenskaper, deres distribusjon i biomedisinske applikasjoner er fortsatt heftig debattert på grunn av sitt potensial cytotoksisitet. Vi utførte noen foreløpige eksperimenter for å anslå cytotoksisiteten til de benyttede quantum dotes og deres konjugater og komplekser. Cytotoksisitetstester viste ikke noen betydelig påvirkning av QD
605 og QD
565 (så vel som deres derivater) på overlevelsen av SKOV-3 (
figur 7
). Disse resultatene stemmer godt til de data som er publisert tidligere demonstrert at kvanteprikker belagt med polymerskall i konsentrasjoner som er nødvendige for visualisering av bestemte overflatereseptorer viser ingen innflytelse på overlevelse av cellekulturer [30].
Relativt cellelevedyktighet SKOV -3 celler etter behandling med innledende QDS (rød linje), er deres konjugater med barstar (blå linje) og deres kompleks med 4D5scFv (oransje linje) vist.
Diskusjoner
ordinære fysiske og kjemiske egenskaper av QDS aktiver flerfarget og langsiktig bildebehandling, altså betydelig styrke dagens metoder for kreftcelle fluorescerende bildebehandling og multiplex profilering av molekylære tumor markører [2].
Den HER1 og HER2 /neu tumor~~POS=TRUNC markører~~POS=HEADCOMP, epidermal vekstfaktor reseptor familiemedlemmer, spiller en sentral rolle i dannelsen og utviklingen av visse typer svulster, inkludert de av endometriet, eggstokk, bryst, prostata og lunger, og er klinisk signifikante tumor markører [6].
for selektiv levering til kreftceller som overuttrykker biomarkører av interesse, QDS må funksjon med målretting molekyler. Monoklonale antistoffer mot HER1 [31] og HER2 [31], [32], [33], [34], [35], så vel som EGF, den naturlige ligand av HER1 [36], [37], [38], har blitt brukt som målretting grupper for utforming av antitumorkontrastmidler basert på QDS. Imidlertid, i full-lengde antistoffer er forholdsvis stor, slik at antallet av antistoffene som kan knyttes til overflaten av QDS er begrenset og intra-tumoral fordeling av nanopartikler hindres, noe som begrenser bruken av full-lengde antistoffer som QD målretting midler. ScFv synes å være mer fordelaktig for generering av HER1- eller HER2 /neu-målrettede QD sonder, fordi de er mindre enn full-lengde antistoffer, men beholde antigen spesifisitet og høy affinitet binging av foreldre antistoffer. Andre fordeler ved scFv antistoff som målretter modulene inkluderer den relative enkelhet av deres produksjon i bakterier, lav immunogenisitet, og mangel på antistoff-effektorfunksjonen [17].
Tidligere studier har vist gjennomførbarheten av in vitro og in vivo avbildning av tumorceller ved hjelp av nanopartikler konjugert med scFv antistoffer rettet mot HER1 [38] eller HER2 /neu [39].
bruk av selv-montering adaptere (små «klissete» molekyler som binder seg til hverandre med høy effektivitet og spesifisitet, men ikke danner homodimerer) er en mer lovende tilnærming til QD-antistoffbinding enn direkte konjugering. Dannelsen av komplekser som involverer disse molekylene har ingen betydelig effekt på antistoffaffiniteten og gir mulighet for enkel tilberedning av forskjellige kombinasjoner av antistoffer med forskjellige særegenheter og QDS med ulike Fluorescensspektrene.
I denne studien har vi brukt systemet basert på en veldig bestemt og sterk ikke-kovalent (nemlig elektro) samspillet mellom to proteiner, barnase og barstar, som selv-montering molekylære adaptere. Bindingsaffiniteten av barnase og barstar er sammenlignbar med den for (strept) avidin-biotin-systemet, den sterkeste kjent blant biomolekyler.
BBS ble valgt på grunn av flere bemerkelsesverdige egenskaper som er essensielle for utforming av målrettet mot moduler . (I) Biotin er ikke et peptid, dens tilknytning til proteiner, f.eks antistoffer, etter genet engineering metoder er ikke mulig. Kjemisk linking er kaotisk, vanligvis uspesifikke i form av vedlegg geometri og ofte krever avansert post-modifikasjon separasjon av komponenter. I motsetning til dette, er begge komponenter av BBS genetisk kodet, noe som muliggjør etablering av målretting moduler som fusjonsproteiner som kodes av et enkelt gen uttrykt i bakterielle systemer [15] .Barnase og barstar er motsatt ladet og således tillate oss å velge den mest hensiktsmessige BBS protein for hvert antistoff brukes til bygging av målretting moduler. Som bidrar til å unngå komplikasjoner forbundet med protein isolasjon, f.eks gjensidig «klebing» av domener av den oppnådde rekombinante protein. I tillegg barnase som en bestanddel av rekombinante proteiner som kan virke som en molekylær anstand sikre deres korrekte folding [40]. (Ii) Ingen av BBS proteinene har analoger i pattedyr, noe som reduserer ikke-spesifikk bakgrunn når dette systemet blir brukt
in vivo
.
