Abstract
Chemoresistance er den viktigste årsaken til behandlingssvikt i avansert kolorektalcancer (CRC). Men molekylære mekanismene bak dette fenomenet er fortsatt ikke klarlagt. I et tidligere arbeid har vi identifisert lave nivåer av PKM2 som en antatt oksaliplatin-resistens markør i HT29 CRC cellelinjer og også hos pasienter. For å kunne vurdere hvordan PKM2 påvirker oksaliplatin respons i CRC celler, forstummet vi PKM2 med bestemte sirnas i HT29, SW480 og HCT116-celler. MTT test viste at PKM2 lyddemping indusert motstand i HT29 og SW480 celler og følsomhet i HCT116 cellene. Samme eksperimentene i isogene HCT116 p53 null-celler og dobbel stanse av p53 og PKM2 i HT29 celler ikke vist noen påvirkning av p53. Ved hjelp av trypan blå flekk og FITC-Annexin V /PI tester vi har oppdaget at PKM2 knockdown var assosiert med en økning i cellelevedyktigheten, men ikke med en reduksjon i apoptose aktivering i HT29-celler. Fluorescens mikroskopi avslørte PKM2 nukleær translokasjon som reaksjon på oksaliplatin i HCT116 og HT29-celler, men ikke i oksa-resistente HTOXAR3 celler. Til slutt, ved hjelp av en qPCR Array vi demonstrert at oksaliplatin og PKM2 stanse endrede celledød genuttrykksmønster inkludert de av BMF, som var signifikant økt i HT29-celler i respons til oksaliplatin, i en dose- og tidsavhengig måte, men ikke i siPKM2 -HT29 og HTOXAR3 celler. BMF genet Slå på HT29-celler fører til en reduksjon i oksaliplatin-indusert celledød. I konklusjonen, våre data rapportere nye ikke-glykolytiske roller PKM2 svar på gentoksisk skade og foreslår BMF som et mulig mål gen av PKM2 å være involvert i oksaliplatin respons og motstand i CRC celler
Citation. Ginés A , Bystrup S, Ruiz de Porras V, Guardia C, Musulén E, Martínez-Cardús A, et al. (2015) PKM2 subcellulære lokalisering er involvert i oksaliplatin Resistance Oppkjøp i HT29 Menneskelig tykktarmskreft cellelinjer. PLoS ONE 10 (5): e0123830. doi: 10,1371 /journal.pone.0123830
Academic Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN
mottatt: 16 september 2014; Godkjent: 07.03.2015; Publisert: 8. mai 2015
Copyright: © 2015 Ginés et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av grun bianual de la Fundación Olga Torres 2008-2009 (https://www.fundacioolgatorres.org/beques_d-investigacio/) til EMB AGM AA AMC EM JLM
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er fortsatt en av de mest hyppige. årsaker til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. Den 5-års overlevelse rate er mindre enn 10% i avanserte stadier av sykdommen og cellegiftbehandling er fortsatt viktig for disse pasientene. Til tross for tilgjengeligheten av nye satsings behandlinger mot EGFR eller VEGF, kombinasjoner av oksaliplatin (oksa) med fluoropyrimidiner fortsatt de mest brukte front regimer i metastatisk setting [1, 2]. Cytotoksisitet av OXA er hovedsakelig generert ved dannelse av platina-DNA-addukter som resulterer i DNA-transkripsjon og replikasjon blokade. Følgelig, aktiverer den flere signalveier som fører til DNA-skade reparasjon og /eller aktivering av celledød programmer [3], som i sin tur er avhengig av blant andre faktorer, på den mutasjonsstatus av tumor suppressor genet p53 [4-6]. Det er imidlertid åpenbart at ikke alle pasienter ha nytte av behandling med OXA motstands prosesser som representerer den viktigste hindring av behandlingseffektivitet. Chemoresistance til platinaderivater er en kompleks multifaktoriell og fremgangsmåte hvor flere mekanismer så som medikament innstrømning /efflux modifikasjoner, endringer i DNA-skade reparasjon, reduksjon av celledød aktivering, autokrin overlevelsessignalering eller detoksifisering av høy aktivitet kan ta del [7-10]. Dessverre, de fleste av studiene vedrørende motstand platina narkotika har fokusert på cisplatin og den virkelige biologiske atferd og mekanismer for respons på OXA i kolorektal celler er stort sett ukjent.
I de siste årene har mange studier har rettet sin oppmerksomhet mot tumorcellemetabolismen som en mekanisme for celle tilpasning til medikamentsensitivitet [11, 12]. I denne linjen, vi fant i en tidligere studie som isoform M2 av pyruvat kinase enzym (PKM2) er knyttet til OXA motstand oppkjøp i et
in vitro
modell, og vi var i stand til å oversette våre resultater i en liten kohort av metastatisk CRC pasienter som hadde fått OXA /5-FU kjemoterapi [8]. Andre forfattere har rapportert at PKM2 ekspresjon og aktivitet er knyttet til cisplatin motstand i gastrisk tumorceller [13] og i kolorektal kreftceller med ervervet motstand mot 5-FU-behandling [14]. Disse fakta indikerer at dette enzymet kan ha en viktig rolle i resistens anskaffelsesprosesser for forskjellige kjemoterapeutiske medikamenter. Videre har det vist seg at noen av de PKM2 biologiske funksjoner avhengig av enzymets atomtranslokasjon, som er markedsført av forskjellige post-translasjonelle modifikasjoner så som tyrosinfosforylering [15-17], lysin acetylering [18], eller sumoylation [19] i respons på faktorer EGFR [20], IL-3 [21] eller henholdsvis Oct-4 [22]. Mens i de fleste av de ovennevnte tilfeller PKM2 trans resulterer i stimulering av celleproliferasjon, er det vist at etter at andre typer stimuli som DNA skade eller oksidativt stress, PKM2 translocates til cellekjernen som fører til aktivering av celledød i en caspases og BCL-2 uavhengig måte [23].
i arbeidet presenteres her, ønsket vi å belyse de PKM2 relaterte molekylære mekanismene som er ansvarlig for OXA motstand oppkjøp i et
in vitro
modell som tidligere beskrevet av oss [24]. Som det vil bli vist, modulering av ekspresjon PKM2 forandres OXA følsomhet, ikke bare i denne cellulære modell, men også i andre humane CRC-cellelinjer. Vi viser at PKM2 translocates til kjernen som respons på genotoksiske skade forårsaket av OXA i sensitive, men ikke i cellelinjer med ervervet resistens mot medikamentet og den regulerer ekspresjonen mønster av celledødsgener slik som BMF, som har vist seg å være involvert i aktivering av apoptotiske og ikke-apoptotisk celledød.
Materialer og metoder
Signert informert samtykke ble innhentet fra hver pasient, og klinisk forskning Etisk Komité fra Hospital tyskerne Trias jeg Pujol gitt godkjenning for studien.
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
HCT116 colon carcinoma celler og dens isogen derivat med en målrettet inaktivering av p53 var en gave fra Dr Vogel (Johns Hopkins University School of Medicine). SW480 og HT29 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Den sistnevnte ble anvendt som foreldrecellene til OXA-resistente sublinje HTOXAR3, som ble oppnådd som et resultat av kontinuerlig og økt eksponering for OXA som tidligere beskrevet [9]. Cellelinjer ble dyrket som monolag i DMEM (HT29, SW480 og HTOXAR3, Invitrogen, Life Technologies) eller RPMI 1640 (HCT116 og HCT116 p53 null; Invitrogen, Life Technologies) supplert med 10% varme-inaktivert FCS (Reactiva), 400 enheter /ml penicillin, 40 ug /ml gentamycin, og 2 mM L-glutamin (Sigma) og dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Celler ble jevnlig testet for forurensning av
Mycoplasma Hotell og ble godkjent av kort tandem repeat profilering.
Drugs
OXA ble utarbeidet i vann (1 mm) som stamløsning og lagret ved -20 ° C. Ytterligere fortynninger av medikamentet ble gjort i kulturmedium til sluttkonsentrasjoner før bruk.
siRNA trans
Celler ble sådd ut ved 60% konfluens i serum og antibiotika-fritt OptiMem medium (Invitrogen) i 6 , 12 og 96-brønners plater, avhengig av de følgende eksperimenter. PKM2 ble forbigående taushet ved hjelp av tre forskjellige siRNAs rettet mot PKM2 (seq NM_002654,. NM_182470, NM_182471, Ambion). P53 og BMF hemming ble utført med bassenger av 4 forskjellige sirnas (Smartpool On-target pluss:
TP53
, # L-003329;
BMF
, # L-004393-00, Dhamacon, GE). Som en transfeksjon middel vi brukte Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. En lyddemper negativ transkripsjon kontroll (Cat No. AM4611; Ambion) ble innført i hvert forsøk. Etter 24 timer av transfeksjon, ble mediet erstattet med fullstendig DMEM eller RPMI 1640 medier supplert med serum og antibiotika. Validering av PKM2, p53 og BMF knockdown ble vurdert ved qPCR og Western blot (WB), bare av WB og bare ved qPCR, henholdsvis. I finjustere eksperimenter, siGAPDH 3 nM positiv kontroll, ble (NM_002046 Ambion) og ikke-transfekterte celler (Mock) innført for å sikre at transfeksjon hadde minimal effekt på genekspresjon, spredning og celleviabilitet (S1 figur)
Western blot
Celler ble homogenisert i RIPA-buffer pluss [fosfatbufret saltløsning (PBS); NP-40 1%; Na deoxycolate 0,5%; SDS 0,1%; EDTA 1 mM; NaF 50 mm; NAVO
3 5 mm] inneholder en cocktail av EDTA-fri proteasehemmere (Roche). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-metoden ved hjelp av BCA Protein Assay Kit (Pierce) og bovint serumalbumin som en standard. Tyve mikrogram protein, ble lastet og underkastet elektroforese på 10% SDS-PAGE-geler (Invitrogen) og overført til PVDF-membraner (Bio-Rad). Etter 1 time for å blokkere (licor Biosciences) ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med et kanin polyklonalt anti-PKM2 primære antistoff (Cell signale, 1: 1000) eller med et muse-monoklonalt anti-p53 (Abcam, 1: 500). Kanin monoklonalt anti-Actin (1: 2000) og mus-monoklonale anti-a-Tubulin antistoffer (1: 15000) (begge fra Sigma Aldrich) ble benyttet som interne kontroller. Membraner ble inkubert med kanin IRDye og mus sekundære antistoffer (1: 15000) (licor Biosciences) i 45 minutter beskyttet mot lys. Membraner ble skannet ved hjelp Odyssey Imaging System og analysert med Odyssey v2.0 programvare (licor biovitenskap).
qPCR
genuttrykk eksperimenter ble utført som beskrevet i et tidligere arbeid [24]. Retrotranscription ble utført med MMLV revers transkriptase (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Primere og prober for PKM2 (analysen no. Hs00762869_s1) og BMF (Hs.00372938_m1) mRNA uttrykk analyse ble kjøpt ferdige fra Applied Biosystems. PCR-produktet størrelse generert med disse primere var 62 bp for PKM2 og 59 bp for BMF. Relativ genekspresjon kvantifisering ble beregnet i henhold til sammenlignings Ct fremgangsmåten som er beskrevet et annet sted ved hjelp av 18S (Stratagene) eller β-Actin (Applied Biosystems) som endogene kontroller. I alle forsøkene, triplikater bare med en Ct-verdi lavere enn 0,20 SD ble godtatt. I tillegg, for hver analyserte prøve, ble en retrotranscriptase minus kontroll løpe i samme plate for å sikre fravær av genomisk DNA-forurensning.
MTT
Cytotoksisiteten av OXA ble vurdert av 3- ( 4, 5-dimetyltiazol-2-yl) 2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) test. Celler ble sådd og transfektert i 96-brønners mikrotiterplater (Nunc) ved en densitet på 1,000 (HT29 og SW480) og 2.000 celler /brønn (HCT116). Førtiåtte timer etter siRNA transfeksjon, ble OXA tilsatt ved forskjellige konsentrasjoner; cellelevedyktigheten ble bestemt 24 timer etter inkubering ved MTT-analyse (Roche Diagnostics) [25]. Hemmende konsentrasjoner (IC, som strekker seg fra 10% til 90% av cellenes levedyktighet) ble bestemt i hver cellelinje ved median-effekt linje metode. Dataene rapportert representerer gjennomsnittet ± SD av et minimum av tre uavhengige eksperimenter.
Trypan blå flekk
Celler ble dyrket i 12-brønners plater og behandlet med 15 uM OXA i 24 timer. Etter legemiddeleksponering ble cellene høstet og resuspendert i DMEM-medium i en konsentrasjon på 1×10
5 celler /ml. Cytotoksisitet ble målt ved bruk av trypan blå farging. Ti mikroliter 0,05% trypan blått (Invitrogen) ble blandet med 10 ul av cellesuspensjonen, spredt på et Neubauer kammer og dekket med et dekkglass. Mens levedyktige celler utelukke fargestoff og vises gjennomskinnelig, levedyktige celler vises blå farget. Livskraftig og dødelighet av minst 3 replikater av hver eksperimentell tilstand ble kvantifisert.
Annexin V /Propidium Iodide test
Apoptose ble bestemt ved hjelp av FITC Annexin V apoptose Detection Kit I (BD Pharmingen) i henhold til produsentens instruksjoner. Et minimum på 10
4 celler per prøve ble analysert ved hjelp av FACS Canto II strømningscytometer (Becton Dickinson Immunocytometry System). Minst 3 gjentak per eksperimentell tilstand ble analysert. Positive og negative kontroller (bindingsbuffer bare, propidiumjodid (PI) bare FITC-Annexin V only) ble brukt til å sette opp egnede forhold for å kompensere detektorer og kvadranter. OXA-indusert celledød etter BMF genet Slå ble målt ved bruk av PI. BMF ble brakt til taushet ved hjelp av siRNA rettet mot BMF som beskrevet ovenfor. Etter 72 timer Oxaliplatin behandling, ble HT29 cellene høstet med Accutase (Ref. A11105-01, Invitrogen) og resuspendert i kald PBS med en PI konsentrasjon av 3 um. PI fluorescens ble bestemt på et FACSCanto II flowcytometer (Becton Dickinson Immunocytometry System). BMF genet Slå ble bekreftet av qPCR.
Cell syklus analyse
For å vurdere cellesyklus distribusjon cellene ble høstet, vasket i PBS, fast i en ml 70% iskald etanol og lagret ved 4 ° C i minst 30 min. Pelletene ble resuspendert i 0,5 ml av 0,1 M HCl-buffer og inkubert i 10 minutter ved 37 ° C. Reaksjonene ble stanset med 2,5 ml PBS. Celler ble inkubert i 1 ml PI fargeløsning (30 pM (Applichem); RNAse A 200 ug /ml (Sigma)) i minst 30 minutter ved romtemperatur i mørke. Et minimum på 10.000 celler ble analysert for DNA-innhold ved hjelp av en FACS Canto II-strømningscytometer (Becton Dickinson Immunocytometry System). Andelen av celler i G1, S-fasen og G2 /M ble bestemt ved bruk FlowJo programvare v9.2.
Immunofluorescensanalyse
PKM2 subcellulære lokalisering ble oppdaget av immunfluorescens. Etter 24 timer feste i celle kammers objektglass (Millipore), ble cellene behandlet med OXA og festet til dekk i kald aceton i 10 minutter ved romtemperatur. Blokkering og permeabilization ble gjort med PBS-T /FBS 10%. Celler ble inkubert ved romtemperatur med et kanin polyklonalt anti-PKM2 primære antistoff (Cell Signaling, 1: 100) i 1,5 timer og deretter, med sekundært antistoff anti-kanin-Alexa 568 (Invitrogen, 1: 200). Kjerner ble farget med DAPI gull-antifade reagens (Invitrogen). Dekkglass ble observert med et fluorescens-mikroskop Axiovision Z1 ved hjelp av Apotome system ved 40x immersjonsolje linse (Carl Zeiss, Heidelberg, Tyskland). Flere bilder ble tatt på forskjellige fokusavstander ved hjelp av z-stabling (tykkelse intervall: 0,750 til 1 mikrometer). Å lokalisere PKM2 på forskjellige brenn dybder
qPCR rekke
kvantitativ real-time PCR ( QRT-PCR) ble utført ved hjelp av menneskelig celledød Pathway Finder PCR Array 384 HT (PAH-212Z, SA biovitenskap), en qPCR Array inneholder 84 celledød relaterte gener. I korthet ble Total RNA samlet fra celler ved hjelp av EZNA total RNA Kit I (Omega) og behandlet med DNAse (Ambion). RNA ble kvantifisert med en Nanodrop TM ND-1000 spektrofotometer (Thermo Scientific). RNA integritet og mangel på genomisk forurensning ble vurdert ved å kjøre prøvene på 1% agarosegeler. Totalt 500 ng RNA ble brukt for revers transkripsjon med RT
2 First Strand Kit (SA biovitenskap). PCR reaksjoner ble utført ved hjelp av RT
2 profiler PCR utvalg nevnt før og RT
2 Sanntids SYBR Grønn PCR Master Mix (SA biovitenskap) på en 7900HT Fast Real-time PCR system (Applied Biosciences) og følge produsentens bruksanvisning. Relative endringer i genuttrykk ble beregnet ved hjelp av to
^ – ΔCt (terskel syklus) -metoden. De housekeeping gener som ikke viser variasjon mellom forsøksbetingelser ble valgt til å være med på array (RPLP0 og ACTB) for å normalisere cDNA beløp. Tre uavhengige biologiske replikater ble utført.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført med PASW statistikk 18 (IBM) med unntak av dose-responskurver analyse, som ble utført med PRISM4 program ( GraphPad Software). Statistiske forskjeller mellom IC
50 ble bestemt ved grafisk fremstilling av dose-responskurver og etterfølgende ikke-lineær regresjonsanalyse og F-test. U-Mann Whitney-test ble anvendt for å bestemme cellesyklusfordelings forskjeller. Sammenligninger mellom ulike eksperimentelle forhold i qPCR Array og BMF uttrykk eksperimenter ble utført gjennom T-Student test. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på
P 0
.
05
.
Resultater
PKM2 genet stanse endrer OXA følsomhet av menneskelige kolorektal kreft celler
I en tidligere arbeidet vi funnet lavere nivåer av PKM2 protein og mRNA uttrykk i CRC celler med ervervet resistens mot oXA (HTOXAR3) og i svulster fra oxa non-responder pasienter, særlig hos dem med mutert p53 [8]. For å vurdere effekten av nedregulere PKM2 på OXA respons i foreldre celler, vi spesielt hemmet PKM2 genuttrykk ved bruk av siRNA oligonukleotider i HT29 celler. Følsomhet for OXA kontroll (siNTC) og PKM2 knockdown celler (siPKM2) ble sammenlignet med MTT-analyse. Førti-åtte timer etter genet Slå ble cellene sådd ut i 96-brønners plater og behandlet i 24 timer med oksa doser i området 0-30 um. PKM2 knockdown effektivitet var høyere enn 95% ved både mRNA og proteinnivåer og varte i 96 timer eller mer (S1 Fig). Som det kan sees i figur 1, i HT29-celler, PKM2 lyddemping ført til mer enn 40% økning i OXA motstand i forhold til siNTC celler (fold = 1,42; p 0,0001) bekrefter påvirkning av PKM2 ned-regulering i oksaliplatin motstand i disse cellene. Disse resultatene ble validert i SW480 celler (fold = 1,61 p 0.0001), men ikke i HCT116 hvor PKM2 knockdown var assosiert med høyere følsomhet for OXA (fold = 0,80; p = 0,007) (fig 1). Vi antok at PKM2 påvirket tumorcellenes respons på OXA avhengig av ytterligere faktor /s. Én mulighet kan være mutasjonsstatus av p53 siden alle disse cellelinjene har unormale EGFR signalveien (HT29 havner mutasjoner i BRAF og PI3K, HCT116 i KRAS og PI3K og SW480 i KRAS), men til stede annerledes p53 mutasjonsstatus (HT29 og SW480 er p53 mutert og HCT116 er p53 vekt). For å demonstrere denne hypotesen, brukte vi en HCT116 isogen derivat med målrettet inaktivering av p53 (HCT116 p53 – /-) [26]. p53 null-celler var meget motstandsdyktig mot oksaliplatin som tidligere rapportert [27], men ved inhibering av PKM2 genekspresjon igjen førte til en nedgang i oksaliplatin motstand (figur 2). Disse resultatene indikerte en mulig virkning ikke er avhengig av wt p53, men på en forsterkning-av-funksjon (GOF) mutasjon av p53. Ifølge denne, forventet vi en endring i oksaliplatin følsomhet i HT29-siPKM2 celler etter å kneble p53 genuttrykk. Som det er vist i figur 2, p53-genet slå ned i HT29-celler (siNTC) førte til en nedsatt motstand mot oksaliplatin, men under disse betingelser mangel på PKM2 uttrykk også øket motstand i disse cellene. Tatt sammen tyder disse resultater på at rollen til PKM2 i oksaliplatin følsomhet er cellelinje avhengig og at andre faktorer, forskjellig fra mutert p53
per se
, men sannsynligvis assosiert med en p53-mutert kreftfremkallende sammenheng kan være å påvirke den annen atferd observert i disse cellelinjene etter PKM2 genet demping. Ytterligere eksperimenter er garantert for å demonstrere dette punktet.
Dose-responskurver for HT29, SW480 og HCT116-cellelinjer etter PKM2 genet Slå og OXA behandling på 0-140 um og 0-32 um i 24 timer. Kurvene representerer gjennomsnittsverdier fra minst tre uavhengige eksperimenter. Celleproliferasjon ble målt ved MTT-analyse. Vertikale linjene i grafikken representerer ± SD. Innfellinger vise PKM2 inmunoblotting etter siRNA-rettet hemming. Spesifikke IC50 verdier for oksaliplatin i alle forhold er vist i tabellen. IC50-verdier for Mock betingelser (uten transfeksjon) var meget lik de siNTC og er ikke vist. * p-verdier er resultat av forhold til siNTC tilstand.
Barer representerer IC50 ± SD (gjennomsnittsverdier fra minst tre uavhengige eksperimenter) for oksaliplatin for hver tilstand. Innfellinger vise PKM2 og p53 inmunoblotting etter PKM2 genet demping. Spesifikke IC50 verdier for oksaliplatin i alle forhold er vist i tabellen. IC50-verdier for Mock betingelser (uten transfeksjon) var meget lik de siNTC og er ikke vist. * P-verdier er resultat av sammenligning med den siNTC tilstand. *
P- verdi
0,05. **
P-verdi
0,01; ***
P-verdi
0,001
PKM2 genet Slå i HT29 celler er assosiert med en økning i celle levedyktighet, men ikke med en nedgang i apoptose etter OXA eksponering
Etter vårt hovedmål, vi ønsket å vite om effekten av PKM2 genet stanse på oksaliplatin motstand i vår
in vitro
modell, var på grunn av en økning i celle levedyktighet, til en nedgang i apoptose eller både. PKM2 ble stille i HT29 celler før behandle dem med 15 mikrometer OXA i 24 timer. Effektene ble sammenlignet med kontrollceller som ble behandlet på samme måte. Ved hjelp av trypanblått-farving, levedyktighet hastigheter mellom OXA behandlede (T) og ikke-behandlede (NT) celler ble beregnet etter 0, 24 og 48 timers utvinning ganger (etter behandling med oxalplatin, ble cellene igjen for å gjenopprette i 0, 24 og 48 time, henholdsvis). Tjuefire timer etter behandling (tidspunkt 0t) en klar effekt av OXA ble detektert. Cellepopulasjon av siNTC og siPKM2 cellene reduseres gradvis etter 48 timers behandling. Men levedyktighet var noe høyere i siPKM2 celler sammenlignet med siNTC celler ved alle tidspunkter, som var statistisk signifikant på 0 h (fig 3A og 3B). Dette faktum tyder på at PKM2 påvirker OXA respons i disse cellene. For ytterligere å undersøke nedstrøms mekanismer forbundet med PKM2 relatert økning i levedyktighet i respons til OXA, analyserte vi effekten på apoptose ved hjelp av Annexin V /PI dobbeltfarging analyse (figur 3C). Cytotoksisitet indusert av OXA ikke markert endre nivåene av indusert tidlig apoptose inntil 48 timer etter kontinuerlig eksponering (Fig 2D). Videre fant vi ikke signifikante forskjeller i apoptose aktivering mellom forstummet PKM2 og kontrollceller i nærvær av OXA men det var en trend som siNTC celler døde i en større andel enn siPKM2 celler. Disse resultatene styrker ideen om at PKM2 deltar i OXA motstand og at apoptose er ikke den viktigste veien innblandet i celledød aktiveres etter OXA eksponering i denne cellelinjen.
Etter siRNA transfeksjon cellene ble behandlet med 15 mikrometer OXA for 24 h periode, observert ved optisk mikroskopi ved 0, 24 og 48 timer etter avslutningen av medikamenteksponering (0 h refererer til celler behandlet i 24 timer, 24 timer refererer til celler behandlet i 24 timer og til venstre for å komme seg for ytterligere 24 h) (A ) og kvantifisert ved trypan blue-farging (B). Apoptose aktivering etter 24 og 48 timer med 10 uM OXA eksponering ble bestemt ved FITC-Annexin V /PI dobbel farging (C) og måles som et forhold mellom prosentandelene av apoptotisk behandlede (T) og ikke-behandlede (NT) celler (D) . Vertikale linjene i grafikken representerer ± SD. *
P-verdi
0,05. NT: ikke-behandlede celler. Optisk mikroskopi. Målet 10x forstørrelse
Cellesyklus fordeling etter OXA eksponering endres ved PKM2 knockdown i HT29 men ikke HCT116 cellene
OXA har blitt rapportert å modifisere protein uttrykk og stabilitet p53 fører til en pågripelse av celler i G1 og /eller G2 /M og fremst avhengig av mutasjonsstatus [5, 27-29]. For å kunne vurdere om PKM2 uttrykk, OXA og p53 mutasjonsstatus førte til forskjeller i cellesyklusprogresjon, studerte vi cellesyklus distribusjon over 72 timer i PKM2 forstummet og kontroll HT29 og HCT116-celler etter kontinuerlig behandling med 10 mikrometer OXA. Som det er vist i figur 4, ubehandlede celler viste den samme cellesyklusfordeling, i nærvær eller fravær av PKM2, noe som betyr at dette proteinet ikke har noen effekt på cellesyklusregulering
per se
. Imidlertid induserte OXA forskjellige reaksjoner i cellesykluskontroll mellom de to cellelinjer. HCT116-celler behandlet med OXA ble i hovedsak beholdt i G1 og G2 /M faser i hele 72 timer med kontinuerlig eksponering for platina narkotika og PKM2 ablasjon ikke har en signifikant effekt på cellesyklus distribusjon. I motsetning til behandling i HT29 celler, førte dem skal beholdes i S og G2 /M faser prinsipielt. Disse celler ble signifikant påvirket av PKM2 knockdown i løpet av de siste 48 og 72 timer etter eksponering (S-faseceller: 67,2% siNTC vs 48% siPKM2; p = 0,05; G2 /M-fase celler: 66,5% siNTC vs 39,7% siPKM2; p = 0,05). siPKM2-HT29-celler holder ikke mer enn 24 timer i en hvilken som helst fase av cellesyklusen, og dermed unngår cellesykluskontrollpunkter. Disse resultatene bekrefter at CRC-celler reagerer på OXA å endre deres cellesyklusen avhengig av p53-mutasjonsstatus og PKM2 uttrykk.
Begge cellelinjer ble transfektert og /eller eksponert for 10 uM til OXA 8, 24, 48 og 72 timer . Etter propidiumjodidfarging, andelen av celler i cellesyklusfaser G1, S og G2 /M ble målt ved flow-cytometri og kvantifisert ved FlowJo v9.2 programvare. Resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter.
P-verdier
≤ 0,05 er representert som en *.
PKM2 translocates til kjernen i respons til OXA i sensitiv, men ikke i resistente celler
Det har blitt demonstrert at genotoksiske skader forårsaket av UV og oksidativt stress stimulerer PKM2 nukleær translokasjon for å fremme celledød [23]. På grunn av de farmakologiske egenskaper og virkningsmekanismen til OXA, ønsket vi å vite om det kunne forårsake lignende endringer i PKM2 subcellulære lokalisering. Vi behandlet HCT116, HT29 og HTOXAR3 celler med forskjellige doser av stoffet (1,65, 10 og 30 mm) i hele 72 timer og vi observerte PKM2 lokalisering ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Som det er vist i figur 5, i det basale betingelser PKM2 ble fordelt i cytoplasma av alle cellelinjer analysert. Men eksponering for OXA indusert vesentlige endringer i PKM2 lokalisering i HCT116 og HT29 cellelinjer, men påfallende, disse endringene ble ikke observert i HTOXAR3 celler. Forbigående nukleær translokasjon av PKM2 ble observert i HCT116-celler i de første 24 timene etter 1,65 uM OXA eksponering. Førti-åtte timer senere, PKM2 ble flyttet igjen i cytoplasma. På denne tiden, opptrådte de fleste av cellene krympet og frittliggende korrelere med en økning i mengden av celledød indusert av de medikament. I HT29-celler, OXA induserte en progressiv og økende atom akkumulering av PKM2 langs 72 h både ved 10 eller 30 uM. Celler med PKM2 i kjernen viste en markert økning i størrelse og viste et perforert mønster ekspresjon av proteinet. I kontrast, forble PKM2 i cytoplasma av HTOXAR3 celler gjennom alle behandlings tidspunktene ved lav (10 mm) og IC
50 (30 mm) doser av platina. Viktigere, HTOXAR3 celler viste mindre PKM2 farging enn HT29 celler bekreftende våre tidligere resultater [8]. HT29 siPKM2 celler ble anvendt som en kontroll av antistoffarging spesifisitet (S2 figur).
Immunoflourescence farging av PKM2 (rød) demonstrerer atom akkumulering i HCT116 og HT29-celler etter behandling med OXA i en tid og doseavhengig måte men ikke i resistente celler HTOXAR3. Kjerner ble farget i blått. NT: Ikke-behandlede celler. Objektiv: 40x immersjonsolje. Skala:. 10 mikrometer
Det har blitt rapportert at atom PKM2 og nivåer av β-catenin fosforylering korrelerer med graderinger av glioma kreft og prognose [30]. Andre forfattere har også rapportert basal PKM2 kjernefysiske lokalisering i humane cellelinjer fra ulik opprinnelse, inkludert tykktarmskreft [31]. For å bekrefte PKM2 subcellulære lokalisering i menneskelige kolorektal tumorer og dens mulige forhold til total β-catenin, analyserte vi deres respektive immunohystochemical flekker i en vev microarray av 41 tumorprøver fra pasienter med metastatisk CRC pasienter som tidligere ble brukt av oss [8]. Våre resultater klart bekreftet PKM2 cytoplasma flekken i alle svulster som ble analysert (S3 Fig). Det er bemerkelsesverdig at disse observasjonene ble utført ved bruk av 2 forskjellige antistoffer (se S1-fil). PKM2 og β-catenin ble sterkt uttrykt i de fleste svulster som ble analysert, men vi kunne ikke finne noen positiv korrelasjon mellom PKM2 og β-catenin kjernefysiske lokalisering.
PKM2 genet Slå endrer uttrykk mønstre av celledød gener i CRC cellelinjer som reaksjon på oXA
Som det har vist seg i dette arbeidet, PKM2 translocates til kjernen av HT29-celler i respons til dette platina middel mens i sin oksa-resistente avledede celler er det ikke. Hensyntatt tidligere resultater knytte kjernefysisk translokasjon av PKM2 og aktivering av caspase-uavhengig celle dødsveier [23], spekulerte vi at PKM2 fremmer transkripsjon av gener som er involvert i respons til OXA. Ved å bruke en RT
2 profiler qPCR Array vi analysert uttrykket av 84 viktige gener knyttet til ulike celledødsmekanismer (apoptose, nekrose og autofagi) for å avklare hvilke celledød sti /s eller genet /s spille en viktig rolle i respons til OXA og hvorvidt den PKM2 genet Slå påvirker de tilhørende transkripsjonsmønstre. For å gjøre det, HT29 celler ble transfektert med spesifikke sirnas som beskrevet før, og ble behandlet med OXA 10 mm i 48 timer for å sikre høye nivåer av atom PKM2 (fig 5). Som det er vist i figur 6A, genekspresjonsmønster i respons til OXA var helt forskjellig blant HT29, siPKM2-HT29 og HTOXAR3 celler. Som vi forventet, andelen av deregulerte gener som følge av OXA eksponering var betydelig høyere i HT29-celler sammenlignet med HTOXAR3 siden 10 uM OXA svarer til IC
50 av de sensitive celler, og omtrent til IC
25 for HTOXAR3 celler. Interessant, siPKM2 celler utstilt en «mellomliggende» mønster av celledødsgener uttrykk. Som det er klart vist i varmevekskartet på figur 6B, etter OXA behandling, genekspresjon profil siPKM2 celler var nærmere den til HTOXAR3 celler enn den til de følsomme celler. Twenty-åtte av disse genene viste høyest (fold-endring) og /eller statistisk signifikante forskjeller mellom de eksperimentelle forhold analysert (Tabell 1 og S1 Table). 0,05.
